Trong những năm gần đây, việc lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông nghiệp với mục đích đạt năng suất và sản lượng cao đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất. Các hợp chất phốt pho hữu cơ hay gọi là cơ phosphat (OP) là một trong số những chất độc hại nhất đã được biết tới. Việc phân giải các thuốc trừ sâu OP rất là chậm, bởi vậy chúng thường tích tụ trong đất, và thường bị rửa trôi vào sông, mạch nước ngầm gây nguy hiểm cho sức khỏe người, động vật. OP đã được chứng minh là chất độc nguy hiểm không chỉ đối với một số loại côn trùng và động vật hoang dã, mà còn gây hại cho con người, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ và phụ nữ có thai. Tác động tiêu cực tới môi trường và sức khỏe con người của một số hợp chất OP như glyphosate, chlorpyrifos, parathion, methyl parathion, diazinon, coumaphos, monocrotophos, fenamiphos và phorate đã được nghiên cứu và chứng minh. Bên cạnh đó còn có các thuốc carbamate cũng là một hoá chất trừ sâu có tác dụng tương tự. Các nghiên cứu cũng cho thấy thuốc BVTV nhóm carbamate và OP có thể làm thai chết, thay đổi hormone, ảnh hưởng đến DNA, thai dị dạng, tinh trùng, buồng trứng và trứng phát triển không bình thường
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT XỬ LÝ DƢ LƢỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CÓ GỐC LÂN HỮU CƠ TRONG ĐẤT NÔNG NGHIỆP HỌC VIÊN THỰC HIỆN: TRẦN NHẬT ĐÔNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 84202018 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN PHƢỢNG MINH HÀ NỘI, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc rõ ràng phép công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên thực TRẦN NHẬT ĐÔNG i LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin cảm ơn cố vấn luận văn - TS Nguyễn Phượng Minh – giảng viên hướng dẫn trực tiếp tơi Cảm ơn cánh cửa đến văn phịng thầy ln rộng mở tơi gặp phải rắc rối có câu hỏi vấn đề nghiên cứu Thầy ln cho phép tự bày tỏ quan điểm đồng thời đưa nhận xét, góp ý, dẫn dắt tơi hướng suốt thời gian nghiên cứu, thực đề tài luận văn thạc sĩ Tôi xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho kiến thức chuyên sâu chuyên ngành suốt thời gian học tập để tơi có tảng kiến thức hỗ trợ lớn cho tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln hỗ trợ tơi khuyến khích liên tục suốt năm học tập qua trình nghiên cứu viết luận văn Thành tựu khơng thể có khơng có họ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTError! defined Bookmark not DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nói chung thuốc bảo vệ thực vật có gốc lân hữu Việt Nam giới .3 1.1.1 Khái niệm thuốc bảo vệ thực vật chứa gốc phốt hữu 1.1.2 Tác dụng phụ chất BVTV chứa gốc OP 1.1.3 Tình hình sử dụng thuốc BVTV Việt Nam giới 10 1.2 Tổng quan vai trị vi sinh vật nơng nghiệp xử lý dư lượng thuốc bảo vệ thực vật nói chung thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu 19 1.2.1 Sử dụng chế phẩm vi sinh nông nghiệp 19 1.2.2 Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật .20 1.2.3 Sự phân hủy thuốc BVTV chứa nhóm OP vi sinh vật .22 1.2.4 Tình hình nghiên cứu xử lý thuốc BVTV nhóm OP Việt Nam 25 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu .27 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng VSV 27 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy VSV .28 2.2.4 Phương pháp đếm khuẩn lạc .28 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả phân giải OP 28 2.2.6 Phương pháp sắc ký khối phổ - phương pháp Quechers 29 iii 2.2.7 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến khả sinh trưởng VSV 29 2.2.8 Phương pháp tách chiết DNA tổng số vi khuẩn 30 2.2.9 Phương pháp xác định chủng mức đ an to n sinh h c chủng vi sinh vật 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 33 3.1 Kết phân lập chủng VSV từ mẫu đất 33 3.2 Kết đánh giá khả phân giải OP .355 3.3 Kết xác định tên chủng CP4 377 3.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng Acinetobacter pittii CP4 .40 3.4.1 Đặc điểm hình thái 40 3.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 42 3.5 Kết đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến khả sinh trưởng vi sinh vật 43 3.5.1 Môi trường nhân sinh khối thời gian nuôi cấy .43 3.5.2 Yếu tố nhiệt đ 44 3.5.3 Yếu tố pH 45 3.5.4 Yếu tố khơng khí 45 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT OP Hợp chất photpho hữu BVTV Bảo vệ thực vật CFU Colony forming unit TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VSV Vi sinh vật v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.2: Độc tính sơ chất BVTV chứa gốc OP (Upadhyay cs., 2011) Bảng 3.1: Các mẫu đất có xuất chủng VSV sống môi trường chứa Chlorpyrifos 34 Bảng 3.2: Dư lượng Chlorpyrifos .36 Bảng 3.3: OD620 mẫu sau phân tích 37 Bảng 3.4: Độ tương đồng gen 16S rRNA chủng CP4 với trình tự cơng bố GenBank .40 Bảng 3.5: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng Acinetobacter pittii CP4 43 Bảng 3.6: Khả sinh trưởng VSV môi trường nuôi cấy 44 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng phát triển VSV 44 Bảng 3.8: Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng phát triển VSV 45 Bảng 3.9: Ảnh hưởng khơng khí đến sinh trưởng phát triển VSV 46 Bảng 3.10: Điều kiện nhân sinh khối chủng CP4 .46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Thuốc bảo vệ thực vật Hình 1.2: Cấu trúc hóa học chung hợp chất OP (Haye’s, 2010) Trong R gốc alkyl, X gốc hữu Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc 41 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào chủng Acinetobacter pittii CP4 kính hiển vi điện tử 42 vii MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, việc lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học nơng nghiệp với mục đích đạt suất sản lượng cao làm cho đất đai ngày thối hóa, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất Các hợp chất phốt hữu hay gọi phosphat (OP) số chất độc hại biết tới Việc phân giải thuốc trừ sâu OP chậm, chúng thường tích tụ đất, thường bị rửa trôi vào sông, mạch nước ngầm gây nguy hiểm cho sức khỏe người, động vật OP chứng minh chất độc nguy hiểm không số loại côn trùng động vật hoang dã, mà gây hại cho người, đặc biệt trẻ nhỏ phụ nữ có thai Tác động tiêu cực tới mơi trường sức khỏe người số hợp chất OP glyphosate, chlorpyrifos, parathion, methyl parathion, diazinon, coumaphos, monocrotophos, fenamiphos phorate nghiên cứu chứng minh Bên cạnh cịn có thuốc carbamate hố chất trừ sâu có tác dụng tương tự Các nghiên cứu cho thấy thuốc BVTV nhóm carbamate OP làm thai chết, thay đổi hormone, ảnh hưởng đến DNA, thai dị dạng, tinh trùng, buồng trứng trứng phát triển khơng bình thường [11] Nhiễm độc cấp OP thường gặp nông thôn Việt Nam, loại thuốc trừ sâu có chứa nhóm OP dùng rộng rãi nông nghiệp Độc tính chúng lên hệ thần kinh việc sử dụng bừa bãi nông nghiệp vấn đề xã hội quan tâm Sự tích tụ nhiều chất OP đất dẫn đến cần thiết phải có kỹ thuật loại bỏ chúng hợp lý, hiệu Việc xử lý chất OP chỗ sử dụng chất xúc tác hiệu cao, gồm enzyme vi sinh vật có ảnh hưởng loại bỏ tốt chất OP độc hại Việc sử dụng sinh vật nói chung, chủ yếu vi sinh vật thực vật, để xử lý ô nhiễm môi trường (bioremediation) lĩnh vực quan trọng tiềm công nghệ sinh học môi trường Công nghệ dựa khả hoạt động enzyme ngoại bào xúc tác để chuyển hóa chất lạ sinh học (xenobiotic substances) Việc sử dụng enzyme ngoại bào dạng tồn sinh khối (vi sinh vật tiết enzyme) dạng chiết xuất (enzyme tinh sạch) kỹ thuật xử lý môi trường hiệu đại Bằng cách phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất trồng chè, đề tài luận văn học viên thực tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả xử lý dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có gốc lân hữu cơ, góp phần giảm thiểu độc hại cho trồng người, đồng thời làm tăng suất trồng, góp phần vào cơng tạo nông nghiệp bền vững Đồng thời mẫu đo OD620 để đánh giá khả tăng sinh trường chủng nghiên cứu Chỉ số OD620 mẫu trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3: OD620 mẫu sau phân tích OD620 Chủng VSV Ngày Ngày Ngày Ngày 10 ĐC 0,2346 0,2717 0,2558 0,2535 CP1 0,2985 0,3913 0,3575 0,3126 CP2 0,3016 0,4083 0,3638 0,3296 CP3 0,3197 0,4134 0,3652 0,3362 CP4 0,3389 0,4504 0,3958 0,3407 CP5 0,2815 0,3986 0,3658 0,3014 Kết cho thấy chủng phân giải tốt Chlorpyrifos, chủng CP4 có hoạt tính mạnh ổn định môi trường MMS hẳn chủng khác Do đề tài định sử dụng chủng CP4 làm vật liệu nghiên cứu tiếp 3.3 Kết xác định tên chủng CP4 Quy trình tách chiết DNA tổng số vi khuẩn tiến hành theo phương pháp CTAB/NaCl Ausubel et al., 1994 37 Tiến hành: (1) Vi khuẩn nuôi 24 môi trường thạch thu sinh khối hòa 1,5 ml nước khử trùng (2) Cặn tế bào thu cách ly tâm lạnh tốc độ 5000 vòng/5 phút để thu sinh khối (3) Cặn tế bào hòa 567 µl TE, µl lyzozym mix ủ 37oC 20 phút (4) Bổ sung µl proteaza K, 30 µl SDS 10 % vào dung dịch mix ủ 37oC 30 phút (5) Sau bổ sung 100 µl NaCl M, mix đều, bổ sung tiếp 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (10% cetyltrimethylammoium bromide, 0.7 M NaCl) mix ủ 65 oC/10 phút (6) Chiết V hỗn hợp chloroform : isoamyl (24 : 1), vortex (7) Ly tâm 12000 vòng/phút thu dịch (lặp lại chiết dung mơi hai lần) (8) Bổ sung 10 µl Na-acetat M, mix đều, bổ sung tiếp V cồn 100 % (lạnh) 0,7 V isopropanol (lạnh), mix (9) Để lạnh -20oC (10) Ly tâm 12000 vòng/20 phút thu cặn (11) Rửa tủa 500 µl cồn 70o, ly tâm 12000 vịng/10 phút, thu cặn (12) Làm khơ (13) Hịa cặn 40 ữ 60 àl TE - ARNaza, 37oC/ (14) Kiểm tra độ tinh DNA máy đo quang phổ bước sóng 260 nm 280 nm CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu Tỉ lệ ADN/protein > 1,8 mẫu (15) Điện di kiểm tra gel agaroza 0.8 %, điện 100 V Nhuộm gel dung dịch ethidium bromit %/ 10 phút 38 * Xác định trình tự gen 16s rARN (1) Trình tự ADN xác định kit Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm phân tích máy đọc trình tự tự động ABI 377 (Perkin-Elmer, Mỹ) (2) Chuỗi nucleotit xử lý chương trình Bioedit (3) Truy cập liệu ngân hàng gen EMBL (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh chương trình GENDOC 2.5 (Nicholas, 1999) (4) Sử dụng chương trình phân tích phả hệ tiến hóa MEGA 2.1 để xác định mối quan hệ di truyền chủng phân tích Trình tự gene 16S rARN chủng vi khuẩn CP4: ATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTAT TAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACG TCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAG ATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTAC CAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG CGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAG GAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACT CGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTTCCAGCAGCCGCGGTAA TACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCG CGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTA ACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGA GGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCT GGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTG ACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGC CTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAAC GCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGA GATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGG CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGGTCCCGG CAACGAGCGCACCCTTTTTCCCTTTATTTGCCAGCGAGTAAATGT CGGGAAA 39 Bảng 3.4: Độ tƣơng đồng gen 16S rRNA chủng CP4 với trình tự công bố GenBank Mã Thông tin chủng % tương đồng CP033530.1 Acinetobacter pittii 2014S07-126 99.24% CP040903.1 Acinetobacter pittii AP007 99.15% MN049561.1 Acinetobacter calcoaceticus GCPIR7 99.15% LC485224.1 Acinetobacter pittii SN6-2 99.15% MK954115.1 Acinetobacter sp A4 99.15% MK834827.1 Acinetobacter calcoaceticus Bi 99.15% MH890513.1 Acinetobacter sp Ap6 99.15% Theo bảng 3.4, chủng CP4 có độ tương đồng lớn (99,24%) với chủng Acinetobacter pittii 2014S07-126 Do đề tài đặt tên chủng CP4 Acinetobacter pittii CP4 3.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng Acinetobacter pittii CP4 3.4.1 Đặc điểm hình thái Phân loại vi khuẩn dựa đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc tế bào chủng Acinetobacter pittii CP4 Đặc điểm hình thái chủng Acinetobacter pittii CP4: + Hình thái khuẩn lạc LB: khuẩn lạc trắng ngà, trịn nhỏ đều, đường kính 1,2mm, bề mặt trơn bóng, khơng sinh sắc tố 40 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc + Hình thái tế bào kính hiển vi điện tử: tế bào hình que, đứng đơn, kích thước 0,5x10 µm Có tiên mao 41 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào chủng Acinetobacter pittii CP4 dƣới kính hiển vi điện tử + Gram (-) 3.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng VSV theo kit API 20NE (đối với chủng vi khuẩn Gram (-), không thuộc loại Enterobacter), kit API20E, kit API 50CHB để xác định vi khuẩn Gram (+) Định tên vi khuẩn dựa vào kết phân tích phần mềm APILAB PLUS 3.3.3 kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey (1994) 42 Bảng 3.5: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng Acinetobacter pittii CP4 Đặc điểm TT Đặc điểm CP4 TT Acid hóa mannitol CP4 nguồn Hiếu khí + 10 Vi hiếu khí - 11 Acid hóa nguồn Galactose Khả di động - 12 Phép thử catalase + Phép thử oxidase + Khả đồng hóa tinh bột, disacarit, dextrin Acid hóa nguồn + L-Arabinose Acid hóa nguồn Ribose - Acid hóa nguồn D-Fructose - Acid hóa nguồn trehalose Acid hóa nguồn sorbitol, 13 glucose 14 Khả sinh Indol + + + + 15 Tạo H2S + 16 Hoạt tính urease - 17 Gram - Ghi chú: (+) có phản ứng (-) khơng phản ứng 3.5 Kết đánh giá ảnh hƣởng yếu tố đến khả sinh trƣởng vi sinh vật 3.5.1 Môi trường nhân sinh khối thời gian nuôi cấy Để lựa chọn môi trường nuôi cấy chủng Acinetobacter pittii CP4, đề tài tiến hành đánh giá khả thích nghi, sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật môi trường Các môi trường sử dụng nghiên cứu môi trường sản xuất tối ưu hóa thành phần dinh dưỡng sinh trưởng phát triển nhóm vi sinh vật Vi sinh vật nhân sinh khối cấp môi trường đặc hiệu Kết nghiên 43 cứu lựa chọn môi trường nhân sinh khối thời gian nuôi cấy chủng vi sinh vật tập hợp bảng 3.6 Bảng 3.6: Khả sinh trƣởng VSV môi trƣờng nuôi cấy Mật độ VSV (CFU/ml) Môi trường 24h 48h 72h 96h LB 4,35.108 1,83.109 8,02.109 5,79.108 MMS 2,13.107 1,87.108 7,64.108 7,3.107 Số liệu bảng 3.6 cho thấy mật độ chủng Acinetobacter pittii CP4 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy thời gian nhân sinh khối Kết nghiên cứu cho thấy môi trường LB phù hợp cho sinh trưởng phát triển chủng Acinetobacter pittii CP4, chủng Acinetobacter pittii CP4 đạt mật độ tế bào cao sau thời gian nhân sinh khối 72 3.5.2 Yếu tố nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu, đề tài tiến hành nhân sinh khối chủng vi sinh vật môi trường LB có điều kiện pH, cấp khí nhiệt độ khác Kết kiểm tra mật độ tế bào sau 72 nuôi cấy thể bảng 3.7 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh trƣởng phát triển VSV Mật độ tế bào (CFU/ml) Chủng VSV Acinetobacter pittii CP4 T0=20±2 (0C) T0=25±2 (0C) T0=30±2 (0C) T0=35±2 (0C) T0=40±2 (0C) 8,19.106 2,34.108 9,74.109 8,48.108 4,12.107 44 Bảng 3.7 cho thấy chủng Acinetobacter pittii CP4 phát triển tốt đạt mật độ cao nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 300C ± (0C), kết kiểm tra mật độ cho thấy chủng Acinetobacter pittii CP4 đạt mật độ 9,74x109 CFU/ml 3.5.3 Yếu tố pH Để xác định pH thích hợp cho q trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu, đề tài tiến hành nhân sinh khối chủng vi sinh vật mơi trường LB, 300C, có điều kiện cấp khí pH khác Kết kiểm tra mật độ tế bào sau 72 nuôi cấy thể bảng 3.8 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng pH tới sinh trƣởng phát triển VSV Mật độ tế bào (CFU/ml) Chủng VSV pH=5,0 Acinetobacter pittii CP4 pH=5,5 pH=6,0 pH=6,5 pH=7,0 pH=7,5 pH=8 4,52.104 4,68.105 5,12.106 5,42.108 1,02.1010 4,12.108 3,36.107 Bảng số liệu cho thấy chủng Acinetobacter pittii CP4 phát triển tốt đạt mật độ cao nuôi cấy điều kiện pH=7, mật độ tế bào đạt 1,02.1010 CFU/ml 3.5.4 Yếu tố khơng khí Trong q trình nhân sinh khối, chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu có nhu cầu sử dụng oxy, đề tài tiến hành đánh giá nhu cầu sử dụng oxy trình sinh trưởng phát triển chủng 45 Acinetobacter pittii CP4 thơng qua lượng khơng khí cấp vào Kết nghiên cứu ảnh hưởng lượng không khí cung cấp q trình nhân sinh khối chung vi sinh vật trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng khơng khí đến sinh trƣởng phát triển VSV Mật độ tế bào (CFU/ml) Chủng VSV 0,50* Acinetobacter pittii CP4 0,55* 0,60* 0,65* 0,70* 0,75* 0,80* 2,34.106 4,52.106 5,68.107 1,26.108 5,26.108 9,02.109 6,72.108 *: Lượng khơng khí ( dm3 khơng khí/dm3 mơi trường/phút) Số liệu bảng 3.9 cho thấy chủng Acinetobacter pittii CP4 đạt mật độ cao (9,02.109 CFU/ml) nồng độ khơng khí cung cấp vào 0,75 dm3 khơng khí/lít mơi trường/phút Như điều kiện nhân sinh khối chủng Acinetobacter pittii CP4 trình bày bảng đây: Bảng 3.10: Điều kiện nhân sinh khối chủng Acinetobacter pittii CP4 Điều kiện nhân sinh khối Chủng CP4 Môi trường nuôi cấy LB Thời gian nhân sinh khối 72 Nhiệt độ môi trường 300C pH môi trường Lưu lượng cấp khí 0,75 dm3 khơng khí/dm3 môi trường/phút 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ 30 mẫu đất thu thập từ vùng trồng chè, đề tài phân lập chủng VSV sống môi trường chứa OP, chủng CP4 có hoạt tính mạnh ổn định sử dụng làm vật liệu nghiên cứu đề tài - Bằng kỹ thuật phân tích trình tự 16S rDNA định danh tên chủng CP4 Acinetobacter pittii CP4 - Đã xác định số thông số kỹ thuật quan trọng sử dụng môi trường nuôi cấy chủng Acinetobacter pittii CP4 gồm: + Môi trường nuôi cấy: LB + Thời gian nhân sinh khối: 72 + Nhiệt độ môi trường: 300C + pH môi trường: + Lưu lượng cấp khí: 0,75 dm3 khơng khí/dm3 mơi trường/phút 4.2 Kiến nghị Chủng Acinetobacter pittii CP4 có tiềm làm vật liệu tạo chế phẩm xử lý thuốc bảo vệ thực vật có gốc Lân hữu Đề nghị tiếp tục nghiên cứu để tạo chế phẩm phục vụ việc xử lý dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có gốc Lân hữu đất nông nghiệp 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Cục Bảo vệ thực vật (2006) Tổng quan quản lý thuốc bảo vệ thực vật Việt Nam nước Tài liệu báo cáo kết thực dự án cấp ngành Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2016) Báo cáo kết thực công tác 2016 triển khai kế hoạch năm 2017 lĩnh vực trồng trọt Hoàng Hà cs (2009) Thực trạng dư lượng thuốc bảo vệ thực vật số loại rau địa bàn Hà Nội đề xuất số giải pháp quản lý thuốc bảo vệ thực vật Luận án Thạc sĩ Nông nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Nguyễn Văn Lẹ, Dương Minh Viễn, Đỗ Thị Xuân (2015) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu diazinon đất chuyên màu số tỉnh đồng sông Cửu Long Nông nghiệp phát triển nông thôn, kỳ tháng 6/2015 56-61 Trần Thị Thành (2005) Điều tra tình hình sử dụng đánh giá dư lượng thuốc bảo vệ thực vật số loài rau ăn quả, ăn củ số địa phương thị trường thành vố Vinh-Nghệ An Luận án cử nhân Sinh học Đại học Vinh Nguyễn Thị Anh Thư (2014) Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa số tỉnh đồng sông Cửu Long Luận án tốt nghiệp Đại học, Trường Đại học Cần Thơ 48 Hà Minh Trung cs (2000) Nghiên cứu ảnh hưởng hóa chất độc hại dùng nông nghiệp tới sức khỏe người, biện pháp khắc phục Đề tài cấp Nhà nước 11-08, Bộ NN&PTNT Trung tâm kiểm định thuốc BVTV phía Bắc (2001) Dư lượng thuốc BVTV rau chè Việt Nam Tạp chí BVTV số Tài liệu tiếng Anh: Adeali A (2006), Risk management and occupational safety and healthpractices in Singapore, The 22st annual conference of the Pacific Occupational Safety and Health Organization, Bangkok, Thailand pp B12732 10 Bacon, C W., & White, J (Eds.) (2000) Microbial endophytes CRC Press 11 Bajgar J (2004) Organophosphates/nerve agent poisoning: Mechanism of action, diagnosis, prophylaxis, and treatment Adv Clin Chem 38, 151-216 12 Berg, G (2009) Plant–microbe interactions promoting plant growth and health: perspectives for controlled use of microorganisms in agriculture Applied microbiology and biotechnology, 84(1), 11-18 13 Bezuglova, O S., & Shestopalov, A V (2005) The use of humates for the detoxification of soils contaminated with heavy metals In Use of Humic Substances to Remediate Polluted Environments: From Theory to Practice (pp 185-200) Springer, Dordrecht 14 Bhagobaty R.K and Malik A (2008) Utilization of chlorpyrifos as a sole source of carbon by bacteria isolated from wastewater irrigated 49 agricultural soils in an industrial area of western Uttar Pradesh, Indian Research Journal of Microbiology 3(5): 293-307 15 Cho T.H., Wild J.R., and Donnelly K.C (2000) Utinity of organophosphorus hydrolase for remediation of mutagenicity of methyl parathion Environmental Toxicology and Chmistry 19(8): 2022-2028 16 Cho C.M.H., Mulchandani A., and Chen W (2002) Bacterial cell surface display of organophosphorus hydrolase for selective screening of improved hydrolysis of organophosphate nerve agent Applied and Environmental Microbiology 68(4): 2026- 2030 17 Cycon M., Mijowska A.Z., Wojcik M., et al (2013) Biodegradation and bioremediation potential of diazinon-degrading Serratia marcescens to remove other organophosphorus pesticides from soils J Environ Manage 117: 7-16 18 Deng S, Chen Y., Wang D., et al (2015) Rapid biodegradation of organophosphorus pesticides by Stenotrophomonas sp G1 Journal of hazardous materials 297: 15-24 19 Doumbou, C L., Hamby Salove, M K., Crawford, D L., & Beaulieu, C (2001) Actinomycetes, promising tools to control plant diseases and to promote plant growth Phytoprotection, 82(3), 85-102 20 Dumas D.P., Caldwell S.R., Wild J.R and Raushel F.M (1989) Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta J Biol Chem 261:19659-19665 21 Ekesi, S., & Maniania, N K (2002) Metarhizium anisopliae: an effective biological control agent for the management of thrips in horti-and 50 floriculture in Africa In Advances in Microbial control of Insect Pests (pp 165-180) Springer US 22 Fest, C., & Schmidt, K J (2012) The chemistry of organophosphorus pesticides Springer Science & Business Media 23 Georghiou, G P., & Mellon, R B (1983) Pesticide resistance in time and space In Pest resistance to pesticides (pp 1-46) Springer US 24 Gopal S., Rastogi V., Ashman W and Mulbry W (2000) Mutagenesis of organophosphorus hydrolase to enhance hydrolysis of the nerve agen VX Biochemical and Biophysical Research Communication 279: 516-519 25 Hayat, R., Ali, S., Amara, U., Khalid, R., & Ahmed, I (2010) Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review Annals of Microbiology, 60(4), 579-598 26 Haye’s (2010), Handbook of Pesticide Toxicology, Third Edition, Volume 1, Academic press is an imprint of Elsevier 27 Heinrichs, E A., & Mochida, O (1984) From secondary to major pest status: the case of insecticide-induced rice brown planthopper, Nilaparvata lugens, resurgence Protection Ecology, 7(2/3), 201-218 28 ILO (2000), Safe and health in used chemical agriculture, Labuor Publish Geneva 29 Islam S.M.A., Math R.K., Cho K.M., et al (2010) Organophosphorus hydrolase (OpdB) of Lactobacillus brevis WCP902 from Kimchi is able to degrade organophosphorus pesticides Journal of Agricultural and Food Chemistry 58: 5380-86 51 ... trò vi sinh vật nông nghiệp xử lý dư lượng thuốc bảo vệ thực vật nói chung thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu 19 1.2.1 Sử dụng chế phẩm vi sinh nông nghiệp 19 1.2.2 Ứng dụng vi sinh vật. .. Bằng cách phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất trồng chè, đề tài luận văn học vi? ?n thực tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả xử lý dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có gốc lân hữu cơ, góp phần giảm... Khái niệm thuốc bảo vệ thực vật chứa gốc phốt hữu Hình 1.1: Thuốc bảo vệ thực vật Vi? ??c sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nông nghiệp, chăn nuôi cần thiết nhằm ngăn chặn loài vật gây hại mùa