Đánh giá hiệu quả sàng lọc virus hbv, hcv, hiv của máu và chế phẩm máu bằng kỹ thuật nat (nucleic acid testing)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  LUẬN ÁN BÁC SỸ CHUYÊN KHOA II ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SÀNG LỌC VIRUS HBV, HCV, HIV CỦA MÁU VÀ CHẾ PHẨM MÁU BẰNG KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID TESTING) Chuyên ngành : HUYẾT HỌC Mã số : CK 62 72 25 01 Hƣớng dẫn: TS Phan Nguyễn Thanh Vân Thực hiện: BS Hồng Thị Nhƣ Mai Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Tác giả luận văn Bs Hoàng Thị Nhƣ Mai MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN Y VĂN 1.1 Tình hình truyền máu 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2 Các virus gây bệnh qua đường truyền máu 1.2.1 Đặc điểm sinh học HBV 1.2.2 Đặc điểm sinh học HCV 13 1.3 Tình hình sàng lọc bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu 25 1.3.1 Trên giới 25 1.3.2 Tại Việt Nam 27 1.4 Các biện pháp bảo đảm an tồn truyền máu , phịng lây nhiễm HBV, HCV, HIV đơn vị máu hiến Ngân Hàng Máu BVTMHH 28 1.4.1 Lựa chọn người hiến máu an toàn 28 1.4.2 Một số phương pháp xét nghiệm sàng lọc HBV, HCV, HIV 28 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Đối tượng nghiên cứu 43 2.2 Vật liệu nghiên cứu 43 2.2.1 Cỡ mẫu nghiên cứu 43 2.2.2 Hóa chất xét nghiệm 43 2.2.3 Trang thiết bị 43 2.3 Phương pháp nghiên cứu 44 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 44 2.3.2 Quy trình 44 2.3.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: 46 2.3.4 Nội dung nghiên cứu 46 2.4 Xử lý số liệu 49 2.5 Vấn đề y đức 49 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Đặc điểm đối tượng hiến máu 50 3.2 Kết phát HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc huyết 52 3.3 Kết phát HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc NAT 54 3.3.1 Kết NAT thực với mẫu trộn 54 3.3.2 Tỷ lệ nhiễm virus HBV, HCV, HIV sàng lọc kỹ thuật NAT chạy riêng mẫu 55 3.3.3 Kết kiểm tra túi huyết tương 55 3.3.4 Kết NAT định tính định lượng 56 3.3.5 Kết ngoại kiểm tra 57 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 61 4.1 Đặc điểm người hiến máu 61 4.2 Xác định tỷ lệ dương tính HBV, HCV, HIV thực kỹ thuật xét nghiệm huyết học 62 4.3 Xác định tỷ lệ dương tính HBV , HCV , HIV thực kỹ thuật xét nghiệm NAT 65 4.3.1 Kết NAT thực với mẫu trộn 65 4.3.2 Tỉ lệ nhiễm virus HBV, HCV, HIV sàng lọc kỹ thuật NAT 66 4.3.3 Kết kiểm tra túi huyết tương 69 4.3.4 Kết NAT định tính định lượng 70 4.3.5 Kiểm tra chất lượng quy trình kỹ thuật NAT 72 4.4 Đánh giá hiệu hai phương pháp kỹ thuật xét nghiệm huyết học kỹ thuật NAT 73 4.4.1 Nghiên cứu hiệu sử dụng kỹ thuật NAT việc nâng cao tính an toàn sinh học chế phẩm máu 73 4.4.2 Đánh giá hiệu hai phương pháp kỹ thuật xét nghiệm huyết học kỹ thuật NAT 74 KẾT LUẬN 76 KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS : Acquirred Immune Deficiency Symdrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) Anti HBs : Anti Hepatitis B surface (Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) Anti HBc : Anti Hepatitis B core (Kháng thể kháng kháng nguyên lõi virus viêm gan B) Anti Hbe : Anti Hepatitis B e (Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan B) Au : Australia (Nước Úc) BN : Bệnh nhân BV.TMHH : Bệnh viện Truyền máu Huyết học CMIA : Chemiluminescense immuno assay (Kỹ thuật hoá phát quang) DNA : Desoxyribonucleic Acid ELISA : Enzyme Linked Immunosorben Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym) ECLIA : Electrochemiluminescense immunoassay (Kỹ thuật điện hoá phát quang) EIA : Enzyme Immunoassay (Kỹ thuật miễn dịch enzym) FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) HBcAg : Hepatitis B core Antigen (Kháng nguyên lõi virus viêm gan B) HBsAg : Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HBeAg : Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên E virus viêm gan B) HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCV : Hepatitis V virus (Virus viêm gan C) ID NAT : Individual NAT KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể MP NAT : Mini Pool NAT NAT : Nucleic Acid Testing NRL : National Reference Laboratory PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) RNA : Acid Ribonucleic TMA : Transcription Mediated Amplification TMP : Trans Membrance Protein VHHTMTW : Viện Huyết học truyền máu Trung Ương WHO : World Health Organization XN : Xét nghiệm DANH MỤC BẢNG, BIỂU Trang Bảng 1.1: Xét nghiệm viêm gan B NAT sàng lọc đơn vị máu 26 Bảng 3.1 Tỷ lệ hiến máu phân loại theo giới tính 50 Bảng 3.2 Tỷ lệ phát HBV, HCV, HIV dương tính người hiến máu 52 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc huyết 52 Bảng 3.4 Kết NAT thực với mẫu trộn 54 Bảng 3.5 Kết xét nghiệm NAT phân biệt HBV, HCV, HIV 55 Bảng 3.6 Kết NAT xét nghiệm túi huyết tương 55 Bảng 3.7 Kết NAT định tính định lượng 56 Bảng 3.8: Kết chạy kiểm tra với mẫu Panel Acrometrix MPX 57 Bảng 3.9: Kết chạy kiểm tra với mẫu Panel Acrometrix HIV-1 HCV, HBV 57 Bảng 3.10 Kết ngoại kiểm tra đợt 24/06/2015 58 Bảng 3.11 Kết ngoại kiểm tra đợt 30/09/2015 59 Bảng 3.12 Kết ngoại kiểm tra 16/03/2016 60 Bảng 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV với tác giả khác 62 Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ HBV-DNA dương tính với tác giả khác 66 Bảng 4.3 So sánh tỷ lệ HCV-RNA dương tính với tác giả khác 67 Bảng 4.4 So sánh tỷ lệ HIV-RNA dương tính với tác giả khác 69 Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ hiến máu phân loại theo giới tính 50 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ hiến máu phân loại theo nhóm tuổi 51 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ đối tượng nghiên cứu theo mục đích hiến máu 51 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ nhiễm HBV theo nhóm tuổi 53 Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ nhiễm HCV theo nhóm tuổi 53 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ nhiễm HIV theo nhóm tuổi 54 Biểu đồ 3.7 Kết NAT định tính định lượng 56 DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Cấu trúc virus HBV Hình 1.2: Chu trình sống HBV 11 Hình 1.3: Diễn biến huyết người nhiễm HBV 12 Hình 1.4: Cấu trúc virus HCV 14 Hinh 1.5: Chu trình sống HCV 17 Hình 1.6: Diễn biến huyết người nhiễm HCV 18 Hình 1.7: Cấu trúc virus HIV 20 Hinh 1.8: Chu trinh sống HIV 23 Hình 1.9: Diễn biến huyết người nhiễm HIV 24 Hình 1.10: Nguyên lý kỹ thuật ELISA 29 Hình 1.11: Nguyên lý kỹ thuật vi hạt hoá phát quang 30 Hình 1.12: Nguyên lý kỹ thuật điện hoá phát quang 32 Hình 1.13: Cấu trúc phức hợp bắt cặp ECLIA 32 Hình 1.14: Nguyên tắc kỹ thuật TMA 38 Hình 1.15: Nguyên tắc phản ứng Realtime-PCR với đoạn dò Taqman 40 Hình 2.1: Real time PCR 48 Sơ đồ 1.1: Sàng lọc HBV, HCV HIV kỹ thuật huyết kỹ thuật NAT theo hướng dẫn hoạt động truyền máu thông tư 26/2013/TT-BYT 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Mỗi năm thơng qua vận động tồn dân hiến máu, lượng máu tiếp nhận từ đối tượng hiến máu tình nguyện ngày tăng cao vấn đề đặt hàng triệu đơn vị máu có thực an tồn khơng? Chính vậy, việc đảm bảo đơn vị máu an toàn cho điều trị việc làm cần thiết An toàn truyền máu nội dung xuyên suốt chiến lược truyền máu quốc gia, sàng lọc tác nhân lây truyền qua đường máu xem mục tiêu quan trọng nhằm giảm thiểu mức thấp nguy lây nhiễm qua đường máu sử dụng chế phẩm máu với mục đích điều trị Sàng lọc tác nhân lây truyền qua truyền máu túi máu hiến chiến lược ngân hàng máu Tổ chức y tế giới (WHO) khuyến cáo việc sàng lọc HBV, HCV HIV bắt buộc cho tất đơn vị máu [18] Theo ước tính WHO, nhu cầu sử dụng máu điều trị hàng năm quốc gia tính theo đơn vị % dân số Ở Việt Nam, với dân số 90 triệu người, năm cần khoảng 1800 000 đơn vị tương đương 450 000 lít máu để đáp ứng nhu cầu điều trị, cấp cứu đề phịng thảm họa Cơng tác sàng lọc tác nhân lây truyền qua đường máu áp dụng từ năm 1971 với xét nghiệm tìm kháng nguyên bề mặt virus gây viêm gan B (HBsAg), từ năm 1985 với xét nghiệm sàng lọc virus suy giảm miễn dịch người (HIV) từ năm 1990 với xét nghiệm sàng lọc virus viêm gan C (HCV) Từ đó, kỹ thuật sàng lọc ngày phát triển Hiện nay, ngân hàng máu lớn Việt Nam, việc sàng lọc tất mẫu máu hiến bắt buộc nhiễm trùng sau sử dụng dấu ấn sau:  HIV-1 HIV-2 sàng lọc kết hợp kháng nguyên – kháng thể HIV hay kháng thể kháng HIV  Viêm gan virus B: sàng lọc kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)  Viêm gan virus C: sàng lọc kết hợp kháng nguyên – kháng thể HCV hay kháng thể kháng HCV  Syphilis (Treponema pallidum): sàng lọc kháng thể treponema đặc hiệu Tuy nhiên giai đoạn cửa sổ, xét nghiệm huyết học phát triển mạnh độ nhạy độ đặc hiệu, chưa thực đảm bảo việc phát virus lây qua đường truyền máu Cùng với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật NAT (Nucleic Acid Testing) nhiều nước giới áp dụng sàng lọc máu, góp phần giúp giảm nguy lây nhiễm qua đường truyền máu cho người nhận Kỹ thuật sử dụng nước phát triển vào cuối thập niên 1990 đầu năm 2000 Hiện có khoảng 33 quốc gia giới sử dụng kỹ thuật NAT cho phát HIV khoảng 27 quốc gia sử dụng kỹ thuật cho phát HBV [19] Kỹ thuật NAT có độ nhạy độ đặc hiệu cao cho phép phát nhân đặc hiệu theo hàm mũ trình tự đích tác nhân gây bệnh từ lượng nhỏ virus, đó, cho phép phát sớm xác tác nhân gây bệnh Hơn nữa, NAT sử dụng để phát đồng thời HIV, HBV, HCV thông qua xét nghiệm thời gian 4-5 giờ, đảm bảo an toàn cho đơn vị máu truyền Tại Việt Nam, kỹ thuật NAT triển khai thường quy Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Huế năm 2015, Viện Truyền máu Huyết học Cần Thơ triển khai NAT năm 2016 Tại Ngân Hàng Máu bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh, kỹ thuật NAT sàng lọc HBV, HCV, HIV thực từ tháng 02/2014 [7] Với thời gian năm thực kỹ thuật NAT sàng lọc máu tiến hành nghiên cứu, đánh giá hiệu sàng lọc virus HBV, HCV, HIV máu chế phẩm máu kỹ thuật NAT nhằm hướng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm tác nhân lây qua đường truyền máu cách xác, đảm bảo an toàn, chất lượng cho máu chế phẩm sử dụng điều trị Bảng 4.4 So sánh tỷ lệ HIV-RNA dƣơng tính với tác giả khác Tác giả, năm nghiên cứu Kết nghiên cứu BVTMHH TPHCM 6/2015-7/2016 Kết nghiên cứu BVTMHH TPHCM 2015 [7] Kết nghiên cứu Viện HH-TMTW (2014-2015) [14] Soisaang P (Thái lan – 2009) [46] Số mẫu Tỷ lệ % nghiên cứu HIV-RNA 233.849 0,0026 79.545 0,003 141.875 486.676 0,002 So sánh với số kết nghiên cứu tác giả khác, thấy kết chúng tôi, tương đương với báo cáo BVTMHH năm 2014: 0,003%, cao kết nghiên cứu viện HHTMTW 2014-2015 Hiện nước giới áp dụng kỹ thuật NAT sàng lọc máu chế phẩm máu, nhờ tỷ lệ lây nhiễm sau truyền máu giảm đáng kể Tại Pháp từ 2001-2003 với việc sử dụng kỹ thuật NAT tỉ lệ giảm từ 1/1.700.000 1/3.150.000 với HIV; 1/1.560.000 1/10.000.000 HCV [44] Nhờ việc sử dụng XN này, vài nước Châu Âu làm giảm nguy lây nhiễm từ 1/400.000 xuống 1/2.5.000.000 HIV 1/760.000 xuống 1/1,5.000.000 HCV [45] 4.3.3 Kết kiểm tra túi huyết tƣơng Trong số 236 mẫu máu dương tính với NAT, tiến hành thử lại túi huyết tương, kết 64,83% dương tính; 35,17% túi huyết tương cịn lại cho kết âm tính Trong túi HCV cho kết dương tính, túi HIV cho kết dương tính 228 mẫu dương tính HBV kiểm tra lại túi có 145 túi dương tính với HBV Như 83 túi cịn lại dương tính giả Ngun nhân xuất ngoại nhiễm vào mẫu khuếch đại nhiễm chéo trình xử lý mẫu tay Để hạn chế tượng ngoại nhiễm, khắc phục cách tất mẫu đền nhận bảo quản đảm bảo an toàn mặt sinh học, tuyệt đối vơ trùng q trình làm xét nghiệm 4.3.4 Kết NAT định tính định lƣợng Ở kết bảng 3.7 số 228 trường hợp phát HBV-DNA dương tính, chúng tơi tiến hành định lượng HBV-DNA, có 21/228 mẫu cho kết dương tính 207 mẫu cho kết âm tính Điều giải thích kỹ thuật NAT với kit MPX test v2.0 phát trường hợp HBV-DNA có kết định lượng 2,3 IU/ml (tương đương 13 copies/ml) ngưỡng phát HBV-DNA phịng lab mà gửi làm định lượng 300 copies/ml Do vậy, 207 mẫu ngưỡng phát cho kết âm tính hồn tồn hợp lý Điều 13 Thơng tư 26/2013/TT-BYT rõ Thực xét nghiệm sàng lọc tác nhân lây truyền qua đường máu cho đơn vị máu, thành phần máu phải bảo đảm yêu cầu sau: - Thực xét nghiệm theo phương cách bảo đảm độ nhạy, phòng ngừa nguy âm tính giả lãnh đạo đơn vị phê duyệt - Kết xét nghiệm sàng lọc tác nhân lây truyền qua đường máu cho đơn vị máu, thành phần máu dùng để kiểm sốt an tồn cho đơn vị máu, thành phần máu nhằm phòng ngừa lây nhiễm tác nhân lây truyền qua đường máu không sử dụng để trả lời, tư vấn cho người hiến máu Vì với kết xét nghiệm kỹ thuật NAT việc sàng lọc đơn vị máu hiến , chúng tơi hồn tồn tin tưởng vào chất lượng xét nghiệm yên tâm vào đơn vị máu “ “ cấp cho bệnh nhân Virus viêm gan C virus có giai đoạn cửa sổ dài khoảng sau 80-100 ngày sau bị nhiễm kháng thể HCV xuất phát phương pháp ELISA Tuy nhiên gặp trường hợp người hiến máu có HCV-RNA (+) mà thời gian chuyển đổi huyết kéo dài Tại Mỹ, từ năm 1999 đến năm 2005, Hội chữ thập đỏ sàng lọc 48 triệu đơn vị máu kỹ thuật NAT phát 196 mẫu có HCV-RNA(+) mà XN kỹ thuật ELISA âm tính, có trường hợp người hiến máu có thời gian miễn dịch ẩn kéo dài năm mà khơng có chuyển đổi huyết thanh, khơng có kháng thể HCV phát Kết bảng 3.7 cho thấy có trường hợp nhiễm HCV phát thêm kỹ thuật NAT, có trường hợp cho kết định lượng HCV-RNA dương tính (với ngưỡng phát 1.000 copies/ml huyết thanh) Tuy nhiên chưa khẳng định mẫu máu lại khơng bị nhiễm virus Rất mẫu có nồng độ virus 500 copies/ml nên chưa phát ngưỡng phát xét nghiệm NAT với kit MPX v2.0 dành cho HCV-RNA 6,8 IU/ml (tương đương 39 copies/ml) Kết xét nghiệm ID - Cobas TaqScreen MPX PCR 4.3.5 Kiểm tra chất lƣợng quy trình kỹ thuật NAT Trong thời gian nghiên cứu thực từ 6/2015 đến 7/2016, quy trình xét nghiệm NAT sử dụng kit MPX test version hệ thống máy Cobas s201 Hệ thống thực kiểm tra chất lượng định kỳ năm lần tổ chức One World Accuracy (NRL, Úc) Thời gian đợt ngoại kiểm BV.TMHH tham gia thời gian tiến hành nghiên cứu vào 24/06/2015, 30/09/2015 16/03/2016 Tất đợt ngoại kiểm BV.TMHH tham gia cho thấy mẫu dương tính HBV, HCV, HIV hệ thống sàng lọc NAT bệnh viện phát Kể từ lúc hệ thống NAT Cobas s201 đưa vào hoạt động thức xét nghiệm cho ngân hàng máu, phịng xét nghiệm ln đạt tiêu chuẩn cho xét nghiệm sàng lọc NAT tổ chức ngoại kiểm NRL đánh giá ngân hàng máu BV.TMHH Trong đợt ngoại kiểm 24/06/2015 30/09/2015 tổ chức NRL chuẩn bị mẫu có nồng độ HBV DNA 0,4 UI/mL HCV RNA UI/mL Đây nồng độ gần thấp giới hạn phát (LoD – limit of detection) thuốc thử sử dụng phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm Các mẫu nồng độ thấp không NRL đánh giá Kết sàng lọc BV.TMHH phát tất mẫu HBV-DNA có nồng độ 0,4 IU/ml phát mẫu HCV-RNA có nồng độ IU/ml Như vậy, xét nghiệm sàng lọc HBV kỹ thuật NAT Bệnh Viện có độ nhạy cao với HBV Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy phương pháp NAT phù hợp với hai loại virus HCV HIV Đối với việc xét nghiệm dựa kháng ngun p24 đóng vai trị quan trọng Với sở pháp lý có áp dụng kỹ thuật NAT, tổ chức FDA khuyến cáo để ngừng việc xét nghiệm kháng nguyên p24 HIV-1 dựa sở phương pháp sàng lọc RNA HIV-1 phương pháp tối ưu hơn, bệnh nhân nhiễm thời gian ngắn đồng thời, kết xét nghiệm kháng nguyên p24 dương tính đồng nghĩa với kết xét nghiệm RNA dương tính Kỹ thuật sàng lọc NAT đặc biệt phát huy tốt ưu điểm thời gian đầu bệnh nhân vừa nhiễm HIV, lượng virus thấp nên lượng kháng thể IgM IgG chưa sản xuất đủ để phát phương pháp huyết thơng thường Bên cạnh đó, phương pháp NAT giúp phân biệt bệnh nhân bị nhiễm HIV thật bệnh nhân có triệu chứng tương tự Đồng thời, việc sử dụng kỹ thuật sàng lọc HCV RNA phát nhân lên virus giúp chuẩn đoán HCV với độ nhạy độ đặc hiệu cao so với xét nghiệm enzyme gan [51] Qua kết nghiên cứu bàn luận với việc tham khảo tài liệu cho thấy kỹ thuật NAT kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao Việc đưa kỹ thuật NAT vào sàng lọc thường quy cho người hiến máu góp phần rút ngắn giai đoạn cửa sổ nhiễm HIV, HBV, HCV nâng cao chất lượng an toàn truyền máu với nhu cầu máu hàng triệu đơn vị máu năm Kỹ thuật NAT bổ khuyết kết huyết chưa phát giai đoạn cửa sổ trường hợp có biến thể virus Vì vậy, hai kỹ thuật NAT ELISA nên bổ sung cho 4.4 Đánh giá hiệu hai phƣơng pháp kỹ thuật xét nghiệm huyết học kỹ thuật NAT 4.4.1 Nghiên cứu hiệu sử dụng kỹ thuật NAT việc nâng cao tính an toàn sinh học chế phẩm máu Kỹ thuật NAT kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy tốt so với kỹ thuật ELISA Trong số 215.256 đơn vị máu sàng lọc âm tính với HBsAg, KT-HCV, KN-KT HIV xét nghiệm vòng kỹ thuật sinh học phân tử NAT, phát loại bỏ thêm 228 đơn vị máu có kết HBV-DNA dương tính (0,105%), đơn vị máu có kết HCV-RNA dương tính (0,0009%) đơn vị máu có kết HIV-RNA dương tính (0,003%) Kỹ thuật NAT phát trường hợp HCV (+) chí < 500copies/ml Qua kết nghiên cứu bàn luận với việc tham khảo tài liệu cho thấy kỹ thuật NAT kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao Các xét nghiệm sàng lọc máu dựa nguyên tắc xét nghiệm miễn dịch enzyme phát kháng thể gây virus kháng nguyên virus Hơn hai tỷ người toàn giới bị nhiễm HBV, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan Trong số này, 350 triệu người mắc bệnh mạn tính, có nguy ung thư gan xơ gan Các công nghệ sàng lọc có thiết kế để phát kháng thể lõi kháng nguyên bề mặt Tuy nhiên, số nhiễm trùng không xuất tám tuần sau nhiễm trùng Ngoài ra, tồn giới có 170 triệu người bị nhiễm HCV 40 triệu người nhiễm HIV Đây mối quan tâm toàn cầu nghiêm trọng Máu xử lý thành thành phần máu phép nhiều bệnh nhân hưởng lợi từ người hiến Do đơn vị máu thu thập từ người hiến giai đoạn cửa sổ bị nhiễm truyền vào tối đa bốn người nhận thêm vào bể chứa 1.000 đơn vị để sản xuất sản phẩm có chứa máu Mối đe dọa lớn an toàn việc cung cấp máu việc hiến máu người hiến "huyết thanh" thời kỳ "cửa sổ" nhiễm trùng ban đầu đảo ngược huyết phát Mẫu thời kỳ cửa sổ có tải lượng virus thấp Việc phát mẫu tải lượng virus thấp đòi hỏi xét nghiệm nhạy Việc đưa kỹ thuật NAT vào sàng lọc thường quy cho người hiến máu góp phần rút ngắn giai đoạn cửa sổ nhiễm HIV, HBV, HCV nâng cao chất lượng an toàn truyền máu với nhu cầu máu hàng triệu đơn vi máu năm Do đó, sức mạnh NAT nằm khả phát acid nucleic virus thay có mặt kháng thể Kỹ thuật NAT bổ khuyết kết huyết chưa phát giai đoạn cửa sổ, giai đoạn nhiễm “câm“ trường hợp có biến thể virus NAT sử dụng thêm vào xét nghiệm kháng thể số người theo lý thuyết, lượng virus rơi xuống mức giới hạn phát kháng thể phát Hoặc số trường hợp nhiễm trùng mãn tính virus, kỹ thuật không phát [10] Kỹ thuật NAT kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy tốt so với kỹ thuật ELISA 4.4.2 Đánh giá hiệu hai phƣơng pháp kỹ thuật xét nghiệm huyết học kỹ thuật NAT Mặc dù NAT phát virus giai đoạn cửa sổ chứng minh cịn nguy âm tính giả nồng độ virus máu thấp HBV chép chậm so với HIV HCV thời gian tăng lên gấp đơi HBV ước tính khoảng 2,56 ngày Để phát nhiễm HBV thể ẩn, đảm bảo an tồn cho đơn vị máu truyền MP NAT sử dụng để làm giảm giá thành xét nghiệm nước phát triển Tuy nhiên nước có vùng dịch tễ nhiễm HBV cao MP NAT cho nhiều kết pool ban đầu phản ứng sau nhiều chế phẩm để lại chờ kết xét nghiệm ID NAT tìm mẫu phản ứng Do tiến hành sàng lọc ID NAT tốt sàng lọc MP NAT vùng dịch tễ cao Mỗi quốc gia phải có chiến lược xét nghiệm sàng lọc cho dựa quần thể nhiễm HBV, phương pháp sàng lọc khác giá thành hiệu Bên cạnh kỹ thuật sử dụng hóa chất chiếu xạ thích hợp bất hoạt virus nhiều trung tâm truyền máu sử dụng việc sử dụng vaccin HBV, HCV quần thể đóng vai trị quan trọng việc giảm thiểu nguy lây nhiễm Và việc tuyên truyền nâng cao nhận thức với người hiến máu đóng vai trị vơ quan trọng, có yếu tố nguy lây nhiễm khơng nên hiến máu Vì vậy, hai kỹ thuật NAT ELISA nên bổ sung cho nhau, kỹ thuật NAT thay kỹ thuật ELISA sàng lọc máu 4.4.3 Hạn chế nghiên cứu  Số lượng mẫu dành cho nghiên cứu chưa đủ lớn, cỡ mẫu nhỏ so với nước khu vực, từ hạn chế trình đưa đánh giá hiệu việc áp dụng kỹ thuật NAT trình thực sàng lọc túi máu chế phẩm máu  Trong thời gian thực đề tài, phòng xét nghiệm NAT chưa ngăn tách biệt với khu vực khác nên gây nhiễu kết số mẫu Hiện tình trạng khắc phục  Kỹ thuật NAT có độ nhạy cao nên có tỷ lệ mẫu cho kết dương tính giả, cần kỹ thuật có độ đặc hiệu cao xác nhận lại trước tư vấn kết xác cho người hiến máu KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu bàn luận trên, xin đưa số kế luận sau Xét nghiệm sàng lọc kháng nguyên kháng thể kỹ thuật xét nghiệm huyết học với tỷ lệ HBsAg 1,94%; anti HCV 0,16 %; HIV AgAb 0,12% Kỹ thuật xét nghiệm NAT có tỷ lệ HBV 0,097% ; HCV 0,0008%, HIV 0,0026% Kỹ thuật NAT phát thêm 228 mẫu dương tính HBV - DNA, mẫu dương tính HCV-RNA mẫu dương tính HIV- RNA Kỹ thuật NAT kết hợp với kỹ thuật huyết học rút ngắn giai đoạn cửa sổ cho kết xác, nhanh hơn, tránh trường hợp âm tính giả, góp phần bảo đảm an tồn truyền máu phịng lây nhiễm HIV, HCV, HBV cho người bệnh truyền máu KIẾN NGHỊ Qua kết bàn luận xin đưa số kiến nghị sau: Thực kỹ thuật NAT sàng lọc máu chế phẩm máu bổ trợ cho kỹ thuật miễn dịch kháng nguyên kháng thể nhằm giúp giảm nguy lây nhiễm bệnh lây qua đường truyền máu đặc biệt giai đoạn cửa sổ Thúc đẩy tiến trình tập trung hóa ngân hàng máu, xây dựng phịng xét nghiệm đủ tiêu chuẩn đào tạo độ ngũ bác sỹ , kỹ thuật viên có trình độ cao nhằm nâng cao chất lượng an toàn truyền máu TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bạch Khánh Hòa , Phạm Tuấn Dương, Trần Vân Chi , Trần Thúy Lan , Trần Quang Nhật , Hoàng Văn Phương (2012), “Kết xét nghiệm sàng lọc HBsAg, kháng thể HCV, Kháng nguyên kháng thể HIV, Kháng thể giang mai người hiến máu Viện Huyết học – Truyền máu TW“, Tạp chí Y học - Chuyên đề Hội nghị khoa học huyết học – Truyền máu toàn quốc 2012, tr 441-445 Bộ y tế, cục phòng chống HIV/ AIDS, Ước tính dự báo nhiễm HIV/AIDS Việt Nam năm 2007-2012 (2009) Bộ y tế (2015), Kế hoạch phòng chống bệnh viêm gan virus giai đoạn 2015-2019, kèm theo định số 739/QĐ-BYT việc ban hành kế hoạch phòng chống bệnh viêm gan virus giai đoạn 2015-2019, Hà Nội Bùi Thị Mai An, Nguyễn Thị Y Lăng, Đỗ Thung Phấn cộng (2002), “Tình hình nhiễm HIV, HBV, HCV bệnh nhân bị bệnh máu Viện Huyết học – Truyền máu Bệnh viện Bạch Mai năm 1998-1999, Cơng trình nghiên cứu khoa học Bệnh viện Bạch Mai 2001-2002, NXB Y học, tr 321- 328 Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà (1997), “Dịch tễ học viêm gan virus B Việt Nam”, Tạp chí y học thực hành Việt Nam, (9), tr 1-3 Đỗ Thị Vinh An (2003), Bước đầu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử Polymerase Chian Reaction (PCR) chẩn đoán sớm HCV HCV, Luận văn thạc sỹ, tr 40-45 Đỗ Trung Phấn (2000), An toàn truyền máu, Nhà xuất khoa học kỹ thuật tr.46-154 Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Chí Tuyển, Thái Quý, Phạm Tuấn Dương, Đỗ Mạnh Tuấn ( 1999), “Hiệu vận động hiến máu sản xuất chế phẩm máu”, Y học Việt nam (232), tr 1-18 Hồng Văn Phóng (2014), Nghiên cứu thực trạng hiệu số giải pháp nâng cao chất lượng máu, chế phẩm máu trung tâm truyền máu Hải Phòng, luận án tiến sĩ y học 10 Lê Thị Hương, Trương Quý Dương (2012), “Kết sàng lọc kháng thể HIV, kháng thể HCV, HBsAg, giang mai, sốt rét người hiến máu tình nguyện bệnh viện đa khoa tỉnh Hịa Bình (3/2007 - 3/2012)“, Tạp chí Y học Việt Nam – Chuyên đề Hội nghị khoa học Huyết học – Truyền máu toàn quốc 2012”, tr 286 – 291 11 Nguyễn Anh Trí, Bạch Khánh Hịa, Chử Thị Thu Hường, Trần Vân Chi (2010), “Tình hình sàng lọc bệnh lây truyền qua đường máu Việt Nam, thực trạng giải pháp”, Nhà xuất y học: Một số chuyên đề huyết học- Truyền máu, tập 12 Phan Nguyễn Thanh Vân, Hoàng Thị Tuệ Ngọc, Nguyễn Châu Trưởng, Nguyễn Thị Như Nguyện, Phù Chí Dũng (2015), “Bước đầu triển khai kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (KT NAT) sàng lọc máu để phát HIV, HCV HBV Bệnh viện Truyền máu Huyết học”, Hội nghị truyền máu huyết học phía Nam lần 3, 19(4):373-376 13 Trần Văn Bé (2003), “Thực hành Huyết học – Truyền máu Kỹ thuật Lâm sàng”, Nhà xuất Y học, (10), tr.287-303 14 Viện Huyết học – Truyền máu TW (2014), Báo cáo tổng kết năm 2014, kế hoạch hoạt động năm 2015, Hà Nội 15 Vũ Thùy An, Phạm Ngọc A, Trần Văn Bảo, Nguyễn Trường Sơn (2012), “Tình hình sàng lọc bệnh nhiễm trùng qua đường máu người hiến máu tình nguyện khu vực Đông Nam Bộ trung tâm truyền máu chợ Rẫy từ 2009-2011“Tạp chí y học, chuyên đề: Hội nghi Khoa học toàn quốc 2012”, tr 272-279 16 Võ Văn Huy (2000), Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát virus viêm gan B huyết người cho máu, Luận án Thạc sỹ y học, tr.45-49 TIẾNG ANH 17 Alter HJ (1991), “Descartes before the horse: I clone, therefore I am: the hepatitis C virus in current perspective”, Ann Intern Med., 115(8):644-649 18 Arthur Bird, Anthon Heyns (2006), “Blood Safety - TTD – Nucleic Acid Amplification Technology (NAT)”, Vox Sanguinis, 91(3), pp,75-90 19 Barbaba R, Michelina N, (2005), “Immunology of Hepatitis B virus and Hepatits C virus infection“, Nat Immunol, 5: 215-229 20 Belay Tessema (2003-2007) “Blood banking in KIEV Municipal Blood center – Blood supply system, blood screening and sero – epidemiology of HBv/HCV in fection”, Vox Sanguinnis, 68,pp.15-18 21 Bukh J.,Purcell RH., Miller RH (1992), “Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus ARN with the polymerase chain reaction assay“, Proa Nat Acad Sci USA, 89: 187-191 22 Bukh J, Miller RH, Purcell RH (1995), “Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes”, Seminars in liver disease 23 Busch MP, Glynn SA, Stramer SL, et al (2005), “A new strategy for estimating risks of transfusion-transmitted viral infections based on rates of detection of recently infected donors”, Transfusion, 45:254-264 24 Busch MP, Lee LL, Satten GA, et al (1995), “Time course of detection of viral and serologic markers preceding human immunodeficiency type seroconversion: implications for screening blood and tissue donors”, Transfusion, 35:91-97 25 Centers for Disease Control and Prevention (www.cdc.gov) Fact Sheet – Human Immunodeficiency Virus Type October 1998 26 Choo QL., Richman KH, Han JH (1991), “Genetic organization and diversty of the hepatitis C virus“, Proc Natl Acad Sci USA ,88 : 2451-2455 27 Choo Q-L, Weiner AJ, Overby LR, et al (1990), “Hepatitis C virus: the major causative agent of viral non-A, non-B hepatitis”, Br Med Bull, 46(2):423-441 28 Chisari FV, Ferrari C Viral Hepatitis In: Nathanson N et al.(1997), “Viral Pathogenesis”, Philadelphia, Lippincott-Raven: 745-748 29 Courouce AM, Le Marrec N, Girault A, Ducamp S, Simon N (1994), “Anti – hepatitis C virus (anti–HCV) seroconversion in patien undergoing hemodiallysis: comparison of second-and third – generration anti-HCV assay”, Transfusion, 34, pp.790-795 30 Dong Hee Seo, et all (2015) “Occull hepatitis B virus infection and blood transfusion“, World Journal of Hepatology, (3): 600 – 606 31 D Joe Chaffin MD (2011), Transfusion-transmitted diseases Part 1, (www: bbguy.org 32 Fabrizi F, Poordad FF, Martin P (2002), “Hepatitis C infection and the patient with endstage renal disease“, Hepatology, 36, pp,3-10 33 Guidotti LG., Chisari FV (2006), “Immunology and Pathogenesis of Viral Hepatitis“, Annul Rev Pathol 1:23-61 34 History of blood transfution and blood transfution medicine., http://www.bloodbook com/ trans-history.html 35 Hitzler WE, Runkel S (2001), “Routine HCV PCR screening of blood donations to identify early HCV infection in blood donors lacking antibodies to HCV”, Transfusion, 41:333-337 36 Hu Y, Shahidi A., Park S., Guifoyle D., Irvin Hirshfield I.(2003), “Detection of extrahepatic Hepatitis C virus replication by a novel, highly sensitive, single-tube nested polymerase chain reaction“, Am J Clin Pathol, 119 : 95-100 37 Hwang SJ., Lee SD (1996), “Hepatitis C in Southeast Asia“, Medical Progress, 23: 98-201 38 Kahn JO, Walker BD (1998), “Current Concepts: acute human immunodeficiency virus type infection”, N Engl J Med., 339:33-39 39 Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS (2002), “Genotypes and Clinical Phenotypes of Hepatitis B virus in patients with Chronic Hepatitis D virus Infection“, J Clin Microbiol,40: 1207 -1209 40 Kato N (2001), “Molecular vinology of hepatitis C virus“, Acta Medica Okayama, 55: 33-159 41 Khalili M (2006), “Coinfetion with hepatitis viruses and HIV“, HIV Insite Knowledge Base Chapter, www.hi.vinsite ucsf.edu 42 Krekulova L., Rehak V., Riley LW (2006), “Structure and function of hepatitis C virus protein 15 years after“, 51: 665-680 43 Kuan-Tsou Lin, et al (2013), “Detection and identification of occult HBV in blood donor in Taiwan using a commecial, multiplex, multi-dye nucleic acid amplifiaction technology screening test”, Vox Sangunis, 106,103-11 44 Jan G Wilson (1997), “Minireview: Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification”, Applied and Environmental microbiology, vol 63, no.10 45 Locarnini S, MD, (2004), “Molecular virology of Hepatitis B virus“, Serminars in liver disease, 24:3-10 46 Mahoney FJ (1999) “Update on Diagnosis , Management , and Prevetion of Hepatitis B virus infection“, Clin Microbiol Rev, 12: 351-36 47 McCutchan FE.(2006), “Global Epidemiology of HIV”, Journal of Medical Virology, 78:S7-S12 48 McFalan W., Mvere D., Shandera W., Reinngold A (1997), “Epidemiology and prevention of transfution – Assciated Human Immunodeficiency Virus transmission in Sub - Sahara Africa”, Vox Sanguinis, 72, pp.85-92 49 McCoy R, Watson K, Kosky M (1999), “Aguide dianogsis”, Physician, 28, pp, 19-23 50 Mollison P.L., Engilfriet C.P, Contreras (1997), “Infectious agent transmitted by transfusion”, Blood transfusion in clinical medicine, 17, pp.176-192 51 Murthy KK, Henrard DR, Eichberg JW, et al (1999), “Redefining the HIV-infectious window period in the chimpanzee model: evidence to suggest that viral nucleic acid testing can prevent blood-borne transmission”, Transfusion, 39:688-693 52 Neurath AR, Kent SB, Strick N, et al.(1986), “Identification and chemical synthetis of a host cell receptor binding site in hepatitis B virus” 53 Proffitt MR et al (1993), “Laboratory diagnosis of human immunodeficiency virus infection “, HIV –AIDS, pp.203-219 54 Raymonnd D., Swan T (2004), “Hepatitis C virus (HCV) and HIV/HCV coinfection A critical review of research and treatment”, Treament Action Group, New York 16: 266-288 55 Reeves JD and Doms WR (2002), “Human Immunodeficiency Virus Type 2”, Journal of General Virology, 83:1253-1265 56 Rekha Hans and Neelam Marwaha (2014), “Nucleic acid testing - benefits and constraints”, Asian J Transfus Sci., (1):2-3 57 Roth WK, Weber M, Petersen D, et al (2002), “NAT for HBV and anti-HBc testing increase blood safety”, Transfusion, 42:869-875 58 S.Laperrche (2005), “Impact of NAT on seroological testing in blood screening”, Surveillance and Screening of Blood Borne Pathogen, pp 59 Screening Donated Blood for Transfusion - Transmissible Infections: Recommendations World Health Organization 2010 60 Silvano Wendel et al (2007), “Primary screening of blood donor nucleic acid testing ( NAT ) for the detection of hepatits B infection by studying diluted NAT yield samples“, Blood transfusion, 13(2): 227 -232 61 Soisaang Phikulsod (2009), “One year experience of nucleic acid technology testing for human immunodeficiency virus Type 1, hepatitis C virus, and hepatitis B virus in Thai blood donations”, Blood donor and blood collection, p:1126 – 1135 62 Stramer SL, Glynn SA, Kleinman SH, et al (2004), “Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid-amplification testing”, N Engl J Med., 351:760-768 63 SzmunessW, Stevens CE, Harley EJ, et al (1980), “Hepatitis C vaccine-demonstration of efficacy in a controlled clinical trial in a high-risk population in the United Stated” 64 Weber B (2002), ”The isolated anti – HBc reativity: New developments Journal of Microbiology”, 40, pp, 451 - 458 65 World Health Organization (2002), Hepatitis B Department of Communicable Disease Surveilance and Response 66 World Health Organization Introduction of Hepatitis B Vaccine into Childhood Immunization Services Geneva, WHO, 2001 (unpublished document WHO/V&B/01.31 available on request from Department of Vaccines and Biologicals, World Health Organization, 1211 Geneva 27, Switzerland) ... thời gian năm thực kỹ thuật NAT sàng lọc máu tiến hành nghiên cứu, đánh giá hiệu sàng lọc virus HBV, HCV, HIV máu chế phẩm máu kỹ thuật NAT nhằm hướng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm tác nhân... xét nghiệm sàng lọc HBV, HCV, HIV Để đảm bảo an tồn phịng lây nhiễm HIV, HBV, HCV qua đường truyền máu nay, BVTMHH kỹ thuật sử dụng để sàng lọc HBV, HCV, HIV công tác sàng lọc máu  Kỹ thuật miễn... kỹ thuật NAT 72 4.4 Đánh giá hiệu hai phương pháp kỹ thuật xét nghiệm huyết học kỹ thuật NAT 73 4.4.1 Nghiên cứu hiệu sử dụng kỹ thuật NAT việc nâng cao tính an tồn sinh học chế