phân tích biểu hiện colllagen type xi alpha (col11a1) trong u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN COLLLAGEN TYPE XI ALPHA (COL11A1) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS BÙI CHÍ BẢO Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN COLLLAGEN TYPE XI ALPHA (COL11A1) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan cơng tác STT Họ tên Bùi Chí Bảo Đại Học Y Dược TPHCM Võ Văn Thành Niệm Đại Học Y Dược TPHCM Trần Huỳnh Thành Đại học Quốc Tế Vũ Nguyễn Thanh Tùng Đại học Quốc Tế Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại Học Y Dược TPHCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng II MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 KẾT LUẬN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 31 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALK Anaplastic Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase COSMIC the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer CT Computerized Axial Tomography DAB 3, -diaminobenzidine DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid E2F4 E2F Transcription Factor FDA Food and Drug Administration FFPF Formalin-fixed, paraffin-embedded GWAS Genome-wide association studies H&E Hematoxylin and eosin HMMD Hóa mơ miễn dịch HRP Horseradish peroxidase HVA Homovanillic acid IDRF Image-defined risk factors INPC International Neuroblastoma Pathology Classification INRG International Neuroblastoma Risk Group INRGSS INRG staging system INSS International Neuroblastoma Staging System LMO1 LIM-domain only LOH Loss of Heterozygosity MIBG Radioiodine-labeled metaiodobenzylguanidine MLH1 MutL Homolog COL11A1 Collagen Type XI Alpha Chain mRNA Messenger Ribonucleic acid MYCN V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Neuroblastoma Derived Homolog NBPF23 Neuroblastoma breakpoint, family 23 NF1 Neurofibromin NST Nhiễm sắc thể OD Optical density PBAF Polybromo BRG1-associated factor PET Positron Emission Tomography PHOX2B Paired-like homeobox 2B RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction SEER Surveillance, Epidemiology, and End Report SMAD3 SMAD Family Member SNP Single Nucleotide Polymorphism SWI/SNF Sucrose non-fermenting/mating-type switching tRNA Transfer RNA U NBTK U ngun bào thần kinh DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình thái mơ học khối u bệnh nhân U NBTk ( sách Pediatric Hematology and Oncology) A: U NBTK khơng biệt hóa; B: U NBTK biệt hóa; C U hạch NBTK thể hỗn hợp; D: U Hạch thần kinh 11 Hình 2: Cấu trúc họ Collagen 21 Hình Ba mức độ biểu Col11A1trong mô NB 27 Hình Biểu Col11A1 tất mô NB 28 Hình 5: Mối tương quan biểu COL11A1 mRNA đặc điểm lâm sàng: (A) giới tính (nam nữ), (B) độ tuổ ạn theo hệ thống phân loại INRGSS (L1, L2, M MS) (D) Có khơng có khuếch đại gen MYCN (thống kê Student’s t-test; P-value < 0,05 (*), ns: non-significant – khơng có ý nghĩa thống kê) 29 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Bảng 2: Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS Bảng 3: Lược đồ phân loại nhóm nguy U NBTK trước điều trị theo hệ thống INRGSS 14 Bảng 4: Họ gen Collagen 17 Bảng 5: Các protein chứa domain giống collagen 18 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u rắn nằm hộp sọ ung thư phổ biến trẻ em Đây u ác tính hệ thần kinh giao cảm có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh thời kỳ phôi thai [1, 2] Khối u khởi phát mô hệ thần kinh giao cảm, điển hình vùng tủy thượng thận hạch cạnh cột sống, biểu tổn thương lớn vùng bụng (60%), sau ngực (15%), xương chậu (5%) chuỗi hạch giao cảm cổ tử cung (5%) [3] Tuổi tác,giai đoạn đặc điểm sinh học có vai trò quan trọng tiên lượng bệnh sử dụng để phân nhóm nguy điều trị bệnh Trẻ em mắc U NBTK thường điều trị đa mơ thức, kết hợp phẫu thuật, hóa xạ trị bệnh nhân nguy cao hỗ trợ điều trị chuyên sâu cấy ghép tế bào gốc Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót bệnh nhân nguy cao 50% điều trị liều cao U NBTK dạng u đặc ác tính phổ biến trẻ em với khoảng 90% trường hợp chuẩn đoán trước tuổi [4] Bệnh chiếm 20% loại ung thư phát thời kỳ mang thai, khoảng 8-10% trường hợp ung thư trẻ em nguyên nhân gây tử vong cho 15% ung thư trẻ em [2, 5] Bệnh xảy tuổi niên người lớn, khoảng 10% trường hợp chuẩn đoán sau 10 tuổi tỷ lệ mắc phải bệnh nhân độ tuổi 30-39 tuổi khoảng 0,2 trường hợp triệu người năm [6] Tỷ lệ mắc phải trẻ em nam cao so với nữ trẻ em da trắng cao đáng kể so với chủng tộc khác [7] Trên giới, U NBTK chiếm khoảng 7,8% ung thư trẻ em Mỹ có khoảng 650 trường hợp mắc năm Theo SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Report), tỷ lệ mắc phải xấp xỉ 9,5 trường hợp triệu trẻ em Các khảo sát U NBTK thực nước công nghiệp khác Tỷ lệ mắc U NBTK cao nước có thu nhập cao châu Âu, Bắc Mỹ thấp nước có thu nhập thấp Châu Phi, Châu Á Mỹ Latin Các nước Đông Á Nam Á Ấn Độ Trung Quốc có tỷ lệ mắc U NBTK thấp so với Nhật Bản [8] Hầu hết bệnh nhân U NBTK giai đoạn di thời điểm chẩn đốn nên có tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 60 trường hợp chẩn đốn mắc U NBTK bệnh viện Nhi Trung Ương [9] Theo ghi nhận bệnh viện Nhi Đồng từ năm 2005 đến 2010, U NBTK thường phát trễ khoảng 93% trường hợp giai đoạn thời điểm chẩn đốn tỷ lệ sống sót sau năm nhỏ 10% [10] Khoảng 70-80% bệnh nhân U NBTK phát giai đoạn di căn, thường di đến quan hạch bạch huyết, gan, xương, tủy xương da Não phổi hai quan gặp khối u di nhiều bệnh nhân nguy cao chữa trị tái phát thường phát có di vị trí Các biểu triệu chứng lâm sàng có liên quan đến vị trí khối u nguyên phát tiến triển bệnh Đối với U NBTK vùng bụng (30%), bệnh nhân có triệu chứng căng bụng, sưng, đau chí tắc nghẽn đường ruột Trong trường hợp khối u chèn ép mạch máu thận, bệnh nhân thường tăng huyết áp Bệnh di có triệu chứng liên quan đến vị trí khác đau cục bộ, bị đau, sưng bầm quanh hốc mắt khối u di đến xương quanh mắt mô mềm Nhiều bệnh nhân bỏ ăn, giảm cân, suy nhược, đau xương tiêu chảy mạn tính Các khối u xuất phát từ các hạch giao cảm cạnh cột sống tăng trưởng qua lỗ xương sống vào ống tủy làm chèn ép dây thần kinh cột sống, gây triệu chứng liên quan đến thần kinh yếu ớt, khập khiễng, tê liệt bàng quang ruột chức Khi khối u di đến cổ, chúng gây hội chứng Horner (sa mí mắt, co đồng tử, lõm mắt) Trẻ sơ sinh mắc U NBTK thuộc giai đoạn 4S (theo INSS) thường có bụng sưng lên khối u di đến gan; cục bướu nhỏ xuất da da đổi màu Ngược lại, bệnh nhân mắc U NBTK giai đoạn khu trú thường khơng có biểu triệu chứng Khoảng 90% trường hợp U NBTK, tế bào khối u sản xuất kích thích tố catecholamine cao, cụ thể homovanillic acid (HVA) vanillylmandelic acid (VMA) nước tiểu Tỷ lệ HVA:VMA cao khối u khơng biệt hóa, tiên lượng xấu; ngược lại hàm lượng VMA cao khối u biệt hóa tiến triển [11, 12] Tùy thuộc vào vị trí khối u yếu tố khác, bác sĩ sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để chẩn đốn U NBTK Thơng thường, xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh chụp X-Quang, chụp cắt lớp vi tính (CT – Computerized Axial Tomography), chụp cắt lớp xạ positron (PET-Positron Emission Tomography) chụp cộng hưởng từ (MRI – magnetic Resonance Imaging) thường sử dụng để xác định ví trí khối u, vùng di Ngồi cịn sử dụng chất hóa học có gắn phóng xạ metaiodobenzylguanidine (MIBG – radioiodine-labeled metaiodobenzylguanidine) có chứa lượng nhỏ i-ốt phóng xạ MIBG tương tự norepinephrine, hormone sản xuất tế bào thần kinh giao cảm Chất tiêm vào tĩnh mạch, vận chuyển máu gắn vào tế bào U NBTK Khối u tăng hấp thu MIBG phát máy quét chất phóng xạ Chất cịn sử dụng biện pháp điều trị [12, 13] Phân chia giai đoạn U NBTK q trình có nhiều tranh luận, có hai hệ thống phân giai đoạn U NBTK Đầu tiên, hệ thống phân giai đoạn U NBTK quốc tế (International Neuroblastoma Staging System - INSS) phát triển vào năm 1971 dựa chẩn đoán hình ảnh sử dụng Nhóm Nghiên Cứu Ung Thư trẻ em (Children’s Cancer Study Group) INSS chia làm giai đoạn: 1, 2, 3, 4S Năm 1993, hệ thống phân loại điều chỉnh thành nhóm dựa theo phẫu thuật cắt bỏ khối u tình trạng lan rộng khối u, bao gồm: giai đoạn 1, 2A, 2B, 3, 4S Chữ “S” nghĩa đặc biệt (special) 4S bệnh lây lan với vị trí di xác định gan, tủy xương, da trẻ 12 tháng tuổi Đây hệ thông phân loại FDA chấp nhận sử dụng rộng rãi giới Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Giai đoạn Đặc điểm Khối u khu trú loại bỏ hồn tồn phẫu thuật, có khơng có dư lượng khối u kính hiển vi; hạch lympho không chứa tế bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần kinh Khối u khu trú bên thể, tất 2A khối u nhìn thấy bị loại bỏ phẫu thuật Hạch lympho không chứa tế bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần kinh Khối u nằm bên thể có khơng thể bị loại 2B bỏ hoàn toàn phẫu thuật Gần hạch lympho khối u có chứa nguyên bào thần kinh ung thư khơng lan đến hạch lympho phía bên thể nơi Khối u chưa di xa có số đặc điểm sau: Bảng 5: Các protein chứa domain giống collagen Cấu trúc collagen Collagen chuỗi có kích thước khác từ 662 đến 3152 axit amin cho chuỗi a1 (X) a3 (VI) người tương ứng (Ricard-Blum cộng 2000; Gordon Hahn 2010) Ba chuỗi giống hệt để tạo thành homo- trimers (ví dụ, collagen II) (Bảng 1) khác để tạo thành dị hình (ví dụ, collagen IX) (Bảng 1) Ba chuỗi collagen tạo thành fibril ba xoắn ốc polyproline II thuận tay trái xoắn xoắn ba bên phải với xung đột dư chuỗi liền kề Ba xoắn ổn định diện glycine chất tồn dư thứ ba, hàm lượng cao proline hydroxyproline, liên kết hy- drogen trái phiếu, tương tác tĩnh điện (Persikov et al 2005), liên quan đến lysine aspartate (Fallas et al 2009) Các chuỗi ba xoắn ốc bao gồm lặp lại Gly-X-Y, X Y proline thường xuyên 4-hydroxy-proline, tương ứng Vị trí 3-hydroxy-proline dư lượng, tham gia vào hình thành phân tử supramolecular, xác định collagens I, II, III, V / XI (Weiss et al 2010) Ba xoắn hình que, linh hoạt diện khiếm khuyết Gly-XY (một đến ba dư lượng axit amin) gián đoạn (lên đến 21-26 gián đoạn chuỗi collagen IV, Khoshnoodi et al 2008 ) Những gián đoạn có liên quan mức độ phân tử với khu vực địa phương có độ dẻo tính linh hoạt cao công nhận phân tử (Bella cộng 2006) (Hình 1) Hình 2: Cấu trúc họ Collagen ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tương nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu mẫu khối u thu thập từ bệnh nhân U NBTK chẩn đoán điều trị bệnh viện Nhi Đồng 2, thành phố Hồ Chí Mình đồng thuận gia định bệnh nhân Bệnh nhi U NBTK phát khối u hình ảnh CT scan PET/CT Phân loại nhóm nguy U NBTK dựa vào tiêu chí hệ thống phân loại ung thư trẻ em Children Oncology Group (COG) (2010), gồm yếu tố: mô học, độ tuổi (nhỏ lớn 18 tháng); giai đoạn xếp loại theo hệ thống INSS gồm giai đoạn L1, L2, M, MS khuếch đại gen MYCN nghiên cứu bệnh nhân U NBTK trước Số lượng mẫu nghiên cứu: 23 mẫu khối u Mẫu mô hach amidam dùng làm mẫu chứng người bình thường Phương pháp nghiên cứu Thu nhận mẫu khối u Mẫu mô thu nhận bệnh viện Nhi Đồng II Mô sau phẫu thuật giữ môi trường DMEM (Invitrogen), 10% FBS, 5% PS (Kháng sinh) vận chuyển trung tâm Y sinh học phân tử - trường đại học Y Dược TP HCM bảo quản -80oC Mẫu mô đúc paraffin (FFPF - formalin-fixed, paraffin-embedded) để tiến hành nhuộm hóa mơ miễn dịch Hóa mơ miễn dịch Cố định mẫu mơ: Có cách để cố định mơ: Đơng lạnh, vùi mơi trường OCT, hóa chất ổn định RNA chất cố định; cố định mô formalin thông dụng Trên thị trường, có nhiều dung dịch sử dụng để cố định mơ như: Bouin, paraformaldehyde, formalin đệm trung tính Mục đích chất cố định ngừng q trình ly giải protein enzyme mơ mơ bị phá hủy không ức chế ly giải protein Chất cố định hoạt động ức chế phát triển vi sinh vật trì độ bền ổn định mơ, giữ hình thái mơ để sử dụng cho thí nghiệm sau Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến cố định mô, chẳng hạn khả thấm chất cố định vào trsong mơ, thể tích chất cố định loại mô, nhiệt độ, nồng độ chất cố định thời gian cố định Cố định tốt pH trung tính, pH 6-8, thị trường có sẵn formalin đệm với phosphate pH [25] Xử lý vùi mô paraffin: Sau mô cố định, mô cần phải xử lý để cắt thành lát mỏng Đầu tiên, mẫu mơ loại bỏ nước nước paraffin khơng hịa trộn sau bị thay cồn trước sử dụng làm mơ xylene mơ cịn nước khơng thể thấm paraffin Sau đó, mẫu mô nhúng paraffin Mô cố định formalin vùi paraffin ( FFPE – formalin-fixed paraffin-embedded) có đặc điểm hình thái tốt lát mơ cắt sử dụng làm HMMD để phân tích biểu gen [25] Quy trình thực hiện: Bước 1: Cố định mơ Mục đích: Duy trì hình thái mơ Mơ sinh thiết sau vận chuyển từ bệnh viện đặt lên băng y tế đo kích thước mơ Sử dụng dao cắt mô dày khoảng 3-4 mm đặt mô falcon 50ml có chứa formalin 10% với tỷ lệ 10:1 so với thể tích mơ Ngâm mẫu formalin 24 - 48 Cho formalin vào bình thu hồi để xử lý, rửa mô nước lạnh phút đặt vô PBS Bảo quản mô tủ 4oC đến xử lý Bước 2: Xử lý đúc mơ Mục đích: Loại bỏ nước vùi mơ paraffin Sử dụng máy xử lý mô tự động SPIN TISSUE PROCESSOR Model STP-120 (Thermo Scientific, Đức)  Mô lấy từ falcon 50ml xử lý sau cố đinh lấy từ tủ mát cho vào cassette đựng mẫu mô Dán nhãn tên cho cassette để tránh nhầm lẫn mô  Cassette chứa mô đặt vào rổ đựng hệ thống máy xử lý mô tự động, khởi động máy rổ đựng cassette chạy qua 12 bình hóa chất theo bước sau: Bước Thời gian ngâm mơ Thứ tự bình hóa chất Hóa chất Formol 01:00 Formol 01:00 Cồn 60% 01:30 Cồn 80% 01:30 Cồn 96% 01:00 Cồn 100% 01:00 Cồn 100% 01:30 Cồn 100% 01:30 Xylol 01:30 10 Xylol 01:30 11 Paraffin 02:00 12 Paraffin 02:00 Cố định mô Khử nước Làm mô Ngấm paraffin (giờ : phút) Sau lấy cassette chứa mơ khỏi máy xử mơ cho vào ngăn chứa cassette máy - đúc mô HistoStarTM 70oC Đúc mô paraffin hệ thống máy đúc khối mô HistoStarTM (Thermo Scientific, Đức)  Trước đúc mô, cần chuẩn bị paraffin tan chảy 70oC cài đặt nhiệt độ cho máy HistoStarTM nhiệt độ 70oC bàn làm mát -12oC  Dùng kẹp để lấy mô từ cassette cho vào khuôn đúc chế paraffin tan chảy vào khuôn, đảm bảo phủ kín mơ  Chuyển khn đúc đến vị trí làm lạnh 5oC đợi cho paraffin mờ  Sau chuyển khn đúc tới vị trí nóng 70oC đặt cassette lên khuôn  Phủ đầy cassette với paraffin  Chuyển khuôn đúc với cassette lên bàn lạnh để làm lạnh nhanh  Để paraffin mát cứng lên Bước 3: Cắt lát mô Mục đích: Cắt lát mơ từ khối mơ paraffin dán vào lam Mô vừa đức cắt bỏ phần paraffin phía để lộ phần mơ làm phẳng mặt cắt lát Trước cắt lát cần để mô vào tủ mát để khối mô cứng Chuẩn bị bồn nước 3540oC Cắt lát mô máy Microm HM 325 Rotary Microtome (Thermo Scientific, Đức) sau: - Đặt mô FFPE Microtome, song song với dao cắt - Cắt mô thành lát mỏng dày khoảng 4-5µm - Đặt lát mơ vừa cắt lên bề mặt nước - Đặt lam lát mô nhấc lam lên cho lát mô nằm slide - Đặt lam lò nhiệt độ 65oC khoảng 10-20 phút đến paraffin bắt đầu tan chảy dính mơ vào lam Đánh giá biểu gen ARID1A mức dịch mã Trong đề tài này, mô U NBTK tươi cố định dung dịch formalin 10% đúc khối paraffin (FFPE) Mẫu FFPE cắt thành lát mỏng khoảng 4-5 m dán lên lam Các lát mô nhuộm HMMD tự động máy BenchMark XT Ventana (Roche, Mỹ) theo Protocol #1: BCl2 40RTU Độ pha loãng kháng thể kháng COL11A1 (anti-COL11A1) (rabbit polyclonal Cat # HPA005456, Sigma-Aldrich) với tỷ lệ 1:500 Hệ thống phát chất tạo màu DAB (3,3'-Diaminobenzidine) xúc tác enzyme HRP (horseradish peroxidase – peroxidase từ cải ngựa) cho tín hiệu màu nâu Hạch lympho người bình thường sử dụng làm đối chứng dương Quy trình nhuộm HMMD: Trong đó, trước nhỏ kháng thể ARID1A vào lam quy trình chạy máy trải qua bước khử paraffin dung dịch Ezpred lộ kháng nguyên dung dịch CC1 95oC thời gian 30 phút Sau k hi nhỏ kháng thể ARID1A, ủ vịng 30 phút máy tự động nhuộm DAB kit Xử lý hình ảnh Hình ảnh hóa mô miễn dịch sau nhuộm quét máy Axio Zen.Z1 Scanner (Đức) vật kính 20X Sau phân tích hình ảnh đo mức độ biểu protein ARID1A mô U NBTK ImageJ Sử dụng tính Colour Deconvolution để phân tách màu chọn hình ảnh phân tích H&E DAB gồm có màu: DAB - màu vàng nâu, Hematoxylin - màu xanh, Eosin - màu hồng Xử lý số liệu Phân tích thống kê Microsoft Excel 2010 Student’s t-test sử dụng để phân tích mối tương quan biểu protein COL11A1 đặc điểm lâm sàng bệnh UNBTK Hình ảnh hóa mơ miễn dịch quét máy Axio Zen.Z1 Scanner phân tích phần mềm ImageJ Biểu đồ vẽ GraphPad Prism B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân Trong 23 mẫu chọn lọc để tiến hành nghiên cứu, có 69,57% (16/23) nam 30,43% (7/23) nữ Bệnh nhân UNBTK có độ tuổi trung bình 36 tháng, 26,09% (6/23) 18 tháng 73,91% (17/23) từ 18 tháng trở lên Giai đoạn phân theo hệ thống INRGSS bao gồm: giai đoạn L1 (13,04%), L2 (13,04%); M (52,17%); MS (8,71%) có 13,04% chưa xác định giai đoạn Có khoảng mẫu (26,09%) khuếch đại MYCN 17 mẫu (73,91%) khơng có MYCN khuếch đại Biểu protein COL11A1 Để đánh giá mức độ biểu protein COL11A1 mẫu UNBTK nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể kháng COL11A1 Hình cho thấy phân loại biểu protein cao, trung bình không biểu COL11A1 mô Phần trăm biểu hiện COL11A1 mẫu khối u tính theo phương pháp Immunoratio dựa vào phần mềm ImageJ Kết cho thấy 23 mẫu tiến hành nhuộm hóa mơ miễn dịch, có mẫu khơng biểu protein COL11A1 (NB16, NB 43, NB 86 NB 102) chiếm 17,39%, mẫu UNBTK (26,09%) biểu COL11A1 thấp, 13 mẫu (56,52%) hiểu cao COL11A1, (Hình 2) Biểu trung bình bình Biểu cao Col11A1 Khơng biểu Hình Ba mức độ biểu Col11A1trong mơ NB Hình Biểu Col11A1 tất mô NB Tương quan biểu gen COL11A1 mRNA với yếu tố lâm sàng UNBTK Để tìm hiểu mối tương quan biểu mRNA gen COL11A1 với đặc điểm lâm sàng giới tính, độ tuổi, giai đoạn bệnh khuếch đại gen MYCN, tiến hành phân tích giá trị biểu COL11A1 mRNA với yếu tố lâm sàng kiểm định Student’s t-test Kết trình bày hình 4, cho thấy biểu COL11A1 mRNA có khác biệt nhóm khuếch đại MYCN không khuếch đại MYCN với mức ý nghĩa thống kê p-value = 0,04 Trong đó, khác biệt nhóm bệnh nhân nam nữ; nhóm tuổi 18 tháng 18 tháng; nhóm bệnh nhân giai đoạn L1, L2, MS giai đoạn M khơng có ý nghĩa thống kê Hình 5: Mối tương quan biểu COL11A1 mRNA đặc điểm lâm sàng: (A) giới tính (nam nữ), (B) độ tuổ ạn theo hệ thống phân loại INRGSS (L1, L2, M MS) (D) Có khơng có khuếch đại gen MYCN (thống kê Student’s t-test; P-value < 0,05 (*), ns: non-significant – khơng có ý nghĩa thống kê) BÀN LUẬN: UNBTK dạng u đặc ác tính phổ biến trẻ em Trong UNBTK, yếu tố mô học, tuổi, giai đoạn, biến đổi NST khuếch đại MYCN yếu tố tiên lượng quan trọng để phân loại nhóm nguy đánh giá điều trị UNBTK Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót nhóm nguy cao thấp, khoảng 50% [2, 26] Do đó, cần nhiều nổ lực nghiên cứu không yếu tố lâm sàng mà yếu tố sinh học phân tử để dự đốn kết tiên lượng xác cho bệnh nhân UNBTK Trong nghiên cứu này, lần chúng tơi phân tích biểu gen COL11A1 mức độ phiên mã dịch mã nhóm bệnh nhân UNBTK Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu quốc tế nước cơng bố khía cạnh Với kỹ thuật Real-time RT PCR cổ điển, nhận thấy COL11A1 mRNA biểu thấp đa số mẫu UNBTK (85%) mối tương quan khuếch đại gen MYCN COL11A1 mRNA có ý nghĩa thống kê, vậy; COL11A1 yếu tố tiên lượng tiềm nhóm bệnh nhân có khơng có khuếch đại MYCN Trong 23 mẫu UNBTK khảo sát biểu protein hóa mơ miễn dịch, có 88.9% trường hợp biểu protein thấp (Hình 3) Kết tương đồng với mẫu biểu thấp mRNA (Hình 1) Tuy nhiên, mẫu NB06 có khác biệt hai kết biểu mRNA thấp biểu protein cao NB106 mẫu paraffin nên RNA bị đứt gãy bị phân hủy, đồng thời việc tách chiết mẫu paraffin cịn nhiều hạn chế nên khơng thu lượng RNA mẫu mô tươi Trong nghiên cứu hạn chế số lượng mẫu nghiên cứu biểu protein COL11A1 nên chưa đánh giá mối liên hệ thay đổi biểu COL11A1 với yếu tố lâm sàng Hơn nữa, UNBTK tần số đoạn 1p chiếm tỷ lệ cao 25-35% [19] gen COL11A1 nằm vị trí 1p35.3 nên có khả giảm biểu COL11A1 liên quan đến đoạn 1p Trong nghiên cứu chưa có liệu cụ thể đoạn NST mẫu UNBTK cần có nghiên cứu đánh giá mối tương quan biểu COL11A1 đoạn 1p Ngoài ra, protein COL11A1 biểu nhiều nhân mẫu khơng có khuếch đại MYCN có biểu COL11A1 tế bào chất mẫu có MYCN khuếch đại, Điều gợi ý có mối liên biểu COL11A1 khuếch đại gen MYCN Tuy nhiên, nghiên cứu dừng lại mức độ quan sát vị trí protein COL11A1 KẾT LUẬN COL11A1 mã hóa protein COL11A1, tiểu phần phức hợp SWI/SNF có vai trị liên kết với DNA điều hòa biểu gen tham gia điều hòa trình sửa sai DNA, tăng sinh biệt hóa tế bào nghiên cứu đánh giá biểu gen UNBTK Kết cho thấy gen COL11A1 biểu thấp biểu mức độ phiên mã dịch mã hầu hết khối u Sự biểu COL11A1 mRNA nhóm có khơng có khuếch đại MYCN khác biệt có ý nghĩa thống kê Do đó, COL11A1 biomarker tiềm tiên lượng điều trị UNBTK TÀI LIỆU THAM KHẢO: Attiyeh, E F., London, W B., Mosse, Y P., Wang, Q., Winter, C., Khazi, D., Children's Oncology, G (2005) Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in neuroblastoma N Engl J Med, 353(21), 2243-2253 doi: 10.1056/NEJMoa052399 Bosse, K R., & Maris, J M (2015) Advances in the translational genomics of neuroblastoma: From improving risk stratification and revealing novel biology to identifying actionable genomic alterations Cancer doi: 10.1002/cncr.29706 Bosse, K R., & Maris, J M (2016) Advances in the translational genomics of neuroblastoma: From improving risk stratification and revealing novel biology to identifying actionable genomic alterations Cancer, 122(1), 20-33 doi: 10.1002/cncr.29706 Canene-Adams, K (2013) Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry Methods Enzymol, 533, 225-233 doi: 10.1016/B978-0-12420067-8.00015-5 Cohn, S L., Pearson, A D., London, W B., Monclair, T., Ambros, P F., Brodeur, G M., Force, I T (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 27(2), 289-297 doi: 10.1200/JCO.2008.16.6785 Esiashvili, N., Anderson, C., & Katzenstein, H M (2009) Neuroblastoma Curr Probl Cancer, 33(6), 333-360 doi: 10.1016/j.currproblcancer.2009.12.001 Esiashvili, N., Goodman, M., Ward, K., Marcus, R B., Jr., & Johnstone, P A (2007) Neuroblastoma in adults: Incidence and survival analysis based on SEER data Pediatr Blood Cancer, 49(1), 41-46 doi: 10.1002/pbc.20859 Irwin, M S., & Park, J R (2015) Neuroblastoma: paradigm for precision medicine Pediatr Clin North Am, 62(1), 225-256 doi: 10.1016/j.pcl.2014.09.015 Jearaphunt, M., Noonin, C., Jiravanichpaisal, P., Nakamura, S., Tassanakajon, A., Soderhall, I., & Soderhall, K (2014) Caspase-1-like regulation of the proPO-system and role of ppA and caspase-1-like cleaved peptides from proPO in innate immunity PLoS Pathog, 10(4), e1004059 doi: 10.1371/journal.ppat.1004059 10 Kadler, K (1995) Extracellular matrix 1: Fibril-forming collagens Protein Profile, 2(5), 491-619 11 Louis, C U., & Shohet, J M (2015) Neuroblastoma: molecular pathogenesis and therapy Annu Rev Med, 66, 49-63 doi: 10.1146/annurev-med-011514-023121 12 Maris, J M (2010) Recent advances in neuroblastoma N Engl J Med, 362(23), 22022211 doi: 10.1056/NEJMra0804577 13 Miller, E J., & Matukas, V J (1969) Chick cartilage collagen: a new type of alpha chain not present in bone or skin of the species Proc Natl Acad Sci U S A, 64(4), 12641268 14 Monclair, T., Brodeur, G M., Ambros, P F., Brisse, H J., Cecchetto, G., Holmes, K., Force, I T (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) staging system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 27(2), 298-303 doi: 10.1200/JCO.2008.16.6876 15 Park, J R., Eggert, A., & Caron, H (2010) Neuroblastoma: biology, prognosis, and treatment Hematol Oncol Clin North Am, 24(1), 65-86 doi: 10.1016/j.hoc.2009.11.011 16 Ricard-Blum, S (2011) The collagen family Cold Spring Harb Perspect Biol, 3(1), a004978 doi: 10.1101/cshperspect.a004978 17 Sabatelli, P., Gualandi, F., Gara, S K., Grumati, P., Zamparelli, A., Martoni, E., Wagener, R (2012) Expression of collagen VI alpha5 and alpha6 chains in human muscle and in Duchenne muscular dystrophy-related muscle fibrosis Matrix Biol, 31(3), 187-196 doi: 10.1016/j.matbio.2011.12.003 18 Sausen, M., Leary, R J., Jones, S., Wu, J., Reynolds, C P., Liu, X., Hogarty, M D (2013) Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma Nat Genet, 45(1), 12-17 doi: 10.1038/ng.2493 19 Schleiermacher, G., Janoueix-Lerosey, I., & Delattre, O (2014) Recent insights into the biology of neuroblastoma Int J Cancer, 135(10), 2249-2261 doi: 10.1002/ijc.29077 20 Selcukbiricik, F., Tural, D., Esatoglu, N., Kocak, S., & Mandel, N M (2011) A very rare adult case with neuroblastoma Case Rep Oncol, 4(3), 481-486 doi: 10.1159/000332761 21 Sharp, S E., Gelfand, M J., & Shulkin, B L (2011) Pediatrics: diagnosis of neuroblastoma Semin Nucl Med, 41(5), 345-353 doi: 10.1053/j.semnuclmed.2011.05.001 22 Stiller, C A., & Parkin, D M (1992) International variations in the incidence of neuroblastoma Int J Cancer, 52(4), 538-543 23 T.B.V.Ho, T N T D K., Vietname surveillence of Neuroblastoma 2005 - 2010 (2011) Vietnamese medicine and pharmacy journal(235), 45-50 24 Thorner, P S (2014) The molecular genetic profile of neuroblastoma MINISYMPOSIUM: PATHOLOGY OF PAEDIATRIC NEOPLASMS, 20 25 Tran, M T., Baglin, J., Tran, T T., Hoang, K T., Phung, L T., Read, A., & Greaves, R F (2014) Development of a new biochemical test to diagnose and monitor neuroblastoma in Vietnam: homovanillic and vanillylmandelic acid by gas chromatography-mass spectrometry Clin Biochem, 47(3), 206-215 doi: 10.1016/j.clinbiochem.2013.11.016 26 Vũ Đình Quang, N X H., Nguyễn Thị Phương Mai,, Phùng Tuyết Lan, T Đ H., Trần Ngọc Sơn, Hoàng Ngọc Thạch, Bùi Khắc Hiếu,, & Ngô Diễm Ngọc, N T L (2013) Đánh giá khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh Nhi Khoa, (1), 68-67 ... KẾT QUẢ NGHIÊN C? ?U A MỞ Đ? ?U TỔNG QUAN ĐỀ TÀI U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u rắn nằm hộp sọ ung thư phổ biến trẻ em Đây u ác tính hệ thần kinh giao cảm có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh. .. bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần kinh Khối u khu trú bên thể, tất 2A khối u nhìn thấy bị loại bỏ ph? ?u thuật Hạch lympho không chứa tế bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần. .. TRƯỜNG PHÂN TÍCH BI? ?U HIỆN COLLLAGEN TYPE XI ALPHA (COL11A1) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU