sử dụng kỹ thuật microsatellite để phát hiện mất đoạn trên nhiễm sắc thể 11 của tế bào u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE ĐỂ PHÁT HIỆN MẤT ĐOẠN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 11 CỦA TẾ BÀO U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN NGUYỄN NHẬT QUỲNH NHƢ Tp Hồ Chí Minh, tháng 05/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE ĐỂ PHÁT HIỆN MẤT ĐOẠN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 11 CỦA TẾ BÀO U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, tháng 05/2018 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thơng tin chung: Tên đề tài: Sử dụng kỹ thuật Microsatellite để phát đoạn nhiễm sắc thể 11 tế bào u nguyên bào thần kinh Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Nhật Quỳnh Như Điện thoại: 0937327294 Email: nnqnhu@ump.edu.vn Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Trung tâm Y sinh học Phân tử Thời gian thực hiện: Mục tiêu: Khảo sát đoạn cánh ngắn NST (1p) cánh dài NST 11 (11q) khối u bệnh nhân UNBTK Nội dung chính: Tách DNA gen (gDNA) từ 17 mẫu khối u mẫu máu đối chứng bệnh nhân UNBTK Phát đoạn 1p 11q phương pháp PCR sử dụng microsatellite marker điện di SDS-PAGE mẫu kiểm tra lại phương pháp MLPA Phân tích kết - Kết đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Về đào tạo: cử nhân  Cơng bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): không  Sách/chương sách (Tên sách/chương sách, năm xuất bản): khơng  Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn giải pháp chưa đăng ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ patent giải pháp đăng ký sở hữu trí tuệ): khơng Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại:  Kết nghiên cứu chuyển giao (Tên sản phẩm, tên đơn vị nhận chuyển giao, giá trị chuyển giao): không  Phạm vi địa ứng dụng kết nghiên cứu (tên đơn vị ứng dụng kết nghiên cứu/tên giảng trích dẫn kết NC sử dụng giảng dạy đại học sau đại học): kết sử dụng làm sở cho cơng tác chẩn đốn, quản lý tư vấn cho bệnh nhân gia đình người mắc bệnh u nguyên bào thần kinh MỤC LỤC MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .6 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU .7 I TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Giới thiệu chung: Phân chia giai đoạn bệnh Biến đổi cấu trúc NST 11q 10 II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO .23 PHỤ LỤC 24 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Lê Thị Kim Hịa Cơng nghệ sinh học ĐH Khoa học Tự Nhiên TP.HCM Nguyễn Nhật Quỳnh Như Y sinh học phân tử ĐH Y Dược TP.HCM Nguyễn Đồn Phương Un Cơng nghệ sinh học Đại học Quốc tế- ĐH Quốc gia TP HCM Trần Thị Bích Thủy Công nghệ sinh học Đại học Quốc tế- ĐH Quốc gia TP HCM Bệnh viện Nhi Đồng Hồ Trần Bản Bùi Chí Bảo Y sinh học phân tử Đơn vị phối hợp chính: Bệnh viện Nhi Đồng -Nơi thực đề tài: ĐH Y Dược TP.HCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng ĐH Y Dược TP.HCM DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Bảng Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS Bảng Kết đo mật độ quang gDNA mẫu mô máu Bảng Kết phát LOH 11q microsatellite marker Bảng Đối sánh kết MLPA với microsatellite marker DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt UNBTK Viết đầy đủ U nguyên bào thần kinh Giải nghĩa LOH loss of heterozygosity Mất đoạn dị hợp MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Giới thiệu chung: U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u đặc nằm ngồi hộp sọ u ác tính phổi biến trẻ sơ sinh trẻ nhỏ c nguồn gốc từ tế c đặc tính giống nguyên thần kinh giai đoạn phát triển ph i thai Các tế tham gia vào trình hình thành hệ thần kinh giao cảm Do đ , U NBTK c thể xuất ất kì vị trí thuộc hệ thần kinh giao cảm tuyến tủy thượng thận, hạch thần kinh giao cảm cột sống ổ ụng U nguyên bào thần kinh (UNBTK) ung thư phổ biến trẻ em 15 tuổi, chiếm 15% số trường hợp tử vong loại ung thư trẻ em Khối u phát sinh trình phát triển hệ thống thần kinh giao cảm hầu hết khối u nguyên phát nằm vùng bụng, đ phổ biến vị trí tủy thường thận (trên 50%) [1-3] Bệnh nhân UNBTK thường điều trị phương pháp đa m thức kết hợp phẫu thuật, hóa trị, xạ trị; nhiên, hiệu điều trị khơng cao, tình trạng tái phát cịn cao UNBTK có đặc điểm mơ học phức tạp gây kh khăn việc tiên lượng bệnh, nghiên cứu UNBTK mở rộng nghiên cứu sinh học phân tử bệnh – sở giúp tiên lượng điều trị bệnh hiệu MYCN gen sinh ung (oncogene) đ ng vai trò quan trọng phát triển thần kinh khuếch đại MYCN xem yếu tố tiên lượng xấu (nhóm nguy cao) xảy khoảng 20% trường hợp UNBTK Tuy nhiên, khoảng 50% bệnh nhân UNBTK tình trạng di lúc chẩn đốn gần 65% trường hợp di kh ng c khuếch đại MYCN [4] Do đ , phân tích yếu tố di truyền khác liên quan đến phát triển UNBTK thuộc nh m nguy cao cần thiết Phân chia giai đoạn bệnh Phân chia giai đoạn U NBTK q trình có nhiều tranh luận, có hai hệ thống phân giai đoạn U NBTK Đầu tiên, hệ thống phân giai đoạn U NBTK quốc tế (International Neuroblastoma Staging System - INSS) phát triển vào năm 1971 dựa chẩn đốn hình ảnh sử dụng ởi Nh m Nghiên Cứu Ung Thư trẻ em (Children’s Cancer Study Group) INSS chia làm giai đoạn: 1, 2, 3, 4S Năm 1993, hệ thống phân loại điều chỉnh thành nh m dựa theo phẫu thuật cắt ỏ khối u tình trạng lan rộng khối u, ao gồm: giai đoạn 1, 2A, 2B, 3, 4S (10.1200/JCO.1993.11.8.1466) Chữ “S” nghĩa đặc iệt (special) 4S ệnh lây lan với vị trí di xác định gan, tủy xương, da trẻ 12 tháng tuổi Đây hệ th ng phân loại FDA chấp nhận sử dụng rộng rãi giới Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Giai đoạn Đặc điểm Khối u khu trú loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật, c kh ng c dư lượng khối u kính hiển vi; hạch lympho kh ng chứa tế khối u hạch khối u c chứa nguyên thần kinh 2A Khối u khu trú ên thể, kh ng phải tất khối u c thể nhìn thấy ị loại ỏ ằng phẫu thuật Hạch lympho kh ng chứa tế khối u hạch khối u c chứa nguyên thần kinh 2B Khối u nằm ên thể c kh ng thể ị loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật Gần hạch lympho khối u c chứa nguyên thần kinh ung thư kh ng lan đến hạch lympho phía ên thể nơi đ Khối u chưa di xa c số đặc điểm sau: - Khối u kh ng thể loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật lan sang phía ên thể N c thể kh ng thể lan đến hạch lympho gần đ - Khối u khu trú vị trí nguyên phát nằm ên thể N đầu lan sang hạch lympho gần đ kh ng nằm phía ên khác thể - Khối u nằm thể phát triển lan sang hai ên kh ng thể loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật Khối u lan sang vị trí xa hạch lympho xa, xương, gan, da, tủy xương, quan khác 4S (“special” neuroblastoma) Trẻ tuổi Khối u nằm ên thể N c thể lây lan sang hạch lympho phía thể kh ng lan sang hạch lympho phía khác U NBTK di sang gan, da, và/hoặc tủy xương Tuy nhiên, kh ng 10% tế tủy xương ung thư, chuẩn đốn hình ảnh MIBG scan kh ng cho thấy ung thư lan sang xương tủy xương Vì giai đoạn khối u khu trú phân loại dựa vào mức độ phẫu thuật cắt ỏ khối u nên hệ thống phân loại kh ng phù hợp với hệ thống phân nh m nguy U NBTK quốc tế (International Neuroblastoma Risk Group – INRG) tiền điều trị Mặc dù nhiều nước giới chấp nhận INSS c nhiều kh khăn phải đối mặt như: khối u kh phân loại dựa vào phạm vi phẫu thuật, việc so sánh thử nghiệm lâm sàng dựa vào INSS kh khăn, ệnh nhân c khối u khu trú dự đốn c suy thoái khối u kh ng phân giai đoạn dựa vào tiêu chí INSS Nhận nhiều giới hạn INSS, chuyên gia từ nước Úc, Trung Quốc, châu ÂU, Nhật Bắc Mỹ phát triển hệ thống phân loại dựa INRG (INRG staging system – INRGSS) dựa tiêu chí lâm sàng yếu tố nguy xác định ởi hình ảnh (image-defined risk factors –IDRF) Các giai đoạn theo INRGSS sau: Bảng Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS Giai đoạn L1 (Localized tumor) Mô tả Khối u khu trú, kh ng c ất kỳ yếu tố IDRF (Phụ lục 1) Khối u phải nằm khoang thể cổ, ngực, ụng xương chậu L2 (Locoregional tumor) Khối u khu trú với diện nhiều IDRF (Phụ lục 1) Khối u nằm liên tục ên khoang thể (ví dụ, khối u nằm ên trái ụng nằm ên trái ngực) M (metastatic disease) Bệnh di xa (ngoại trừ giai đoạn MS), kh ng liền kề với khối u nguyên phát, ngoại trừ xác định thuộc giai đoạn MS Khối u di đến hạch ạch huyết ộ phận khác thể MS (Specific metastasis) Giai đoạn di trẻ em nhỏ 18 tháng khối u di đến da, gan và/hoặc tủy xương Kh ng 10% tế bào ung thư tủy xương Biến đổi cấu trúc NST 11q Mất đoạn dị hợp (loss of heterozygosity – LOH) cánh dài NST 11 (11q) thường xảy UNBTK Tấn suất đột biến đoạn 11q khác cao UNBTK Mất đoạn 11p, có khoảng 21% bệnh nhân UNBTK có LOH 11p vị trí thường xảy 11q23 LOH 11p liên quan đến hiệu điều trị với tỷ lệ sống sót khoảng 45% yếu tố sử dung phân loại nh m nguy Những vùng bị có chứa gen ức chế khối u (gene suppressor gene) chưa xác định rõ [3, 5] Việc phát LOH 11q - yếu tố tiên lượng đắc lực cho trường hợp không khuếch đại MYCN hỗ trợ cho việc phân loại nh m nguy UNBTK Trong nghiên cứu này, sử dụng microsatellite marker chuyên biệt để phát LOH 11q 17 mẫu UNBTK phương pháp PCR điện di SDS-PAGE 10 Bên cạnh đ chúng t i sử dụng thêm microsatellite marker phát LOH 1q để so sánh tương quan bệnh nhân có xảy đột biến đoạn đồng thời nhiễm sắc thể 1p 11q Sau đ , kết kiểm tra lại phương pháp MLPA – phát trường hợp đoạn lặp đoạn nhỏ với độ xác cao II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu m máu UNBTK thu nhận sau phẫu thuật bệnh viện Nhi Đồng II; mô u trữ m i trường DMEM, 10% FBS, 1% Penicillin-Steptomycin mẫu máu giữ ống có chứa EDTA để tránh đ ng máu vận chuyển trung tâm Y Sinh Học phân tử - Đại học Y Dược TP HCM Mẫu bảo quản tủ -80oC 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết DNA từ mô u Tách chiết DNA gen (gDNA) từ mơ UNBTK theo quy trình “Genomic DNA PREP from human tissue” Mẫu m ly giải TES buffer Protease K, ủ qua đêm TES buffer có vai trò hòa tan DNA bảo vệ DNA tránh bị phân hủy; proteinase K sử dụng để loại bỏ protein Sau đ , hỗn hợp cho vào ống Vacutainer (BD, Mỹ) bổ sung Phenol/Chloroform/isopropanol với tỷ lệ 25:24:1 Protrein bị biến tính tan lớp giữa, cịn nucleic acid giữ lớp nước phía Lớp có chứa nucleic acid bổ sung với chloroform: isopropanol lần để đảm bảo loại bỏ tạp chất RNA Ly tâm chuyển dịch vào ống mới, thêm cồn tuyệt đối đảo nhẹ ống tay Ly tâm thu nhận DNA hòa tan nước khử ion Bảo quản 4oC kiểm tra chất lượng DNA gel agarose 1% Tách chiết DNA từ máu Đối với máu, gDNA tách chiết Illustra-blood genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare) Quy trình tách máu gồm ước sau: - Thêm 20 ml dung dịch Proteinase K vào 200 µl máu tồn phần, votex máy - Thêm 400µl dung dịch Lysis, votex máy - Ủ mẫu 56oC 10 phút 11 - Thêm 200 ml ethanol 100% votex Rửa DNA - Chuyển hỗn hợp chuẩn bị vào cột quay Máy ly tâm 8000 vòng/phút 60 giây - Bỏ ống thu chứa dung dịch chảy qua Đặt cột vào ống thu - Thêm 500 µl Wash Buffer I Máy ly tâm 10000 vòng / phút 60 giây, loại bỏ dung dịch chảy qua - Thêm 500 µl Wash Buffer II Máy ly tâm tốc độ 14000 vòng / phút phút, loại bỏ dung dịch chảy qua - Ly tâm tốc độ tối đa để loại bỏ phần lại dung dịch - Chuyển sang ống microcentrifuge vơ trùng 1.5 mL DNA pha lỗng - Thêm 200 µl đệm Elution vào màng cột - Ủ mẫu RT phút, ly tâm 10000 vòng / phút phút DNA sau thu nhận bảo quản -20oC Định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA Định lượng kiểm tra chất lượng DNA phương pháp đo quang phổ sử dụng máy Nanodrop (Thermo Scientific, Vietnam) Các ước thao tác máy Nanodrop sau: - Khởi động máy tính gắn kết nối sẵn với máy Nanodrop - Mở phần mềm Nonadrop hiển thị máy tính - Chọn tính đo Nucleic Acid để đo mẫu DNA - Làm máy trước tiến hành đo mẫu thao tác “ lank” hiển thị phần mềm - Thêm 2ul nước cất (DNA free water) dung dịch pha loãng DNA Elution để rửa máy - Kiểm tra lại việc rửa máy cách đo nồng độ dung dịch rửa số hiển thị nồng độ máy - Thêm 2ul DNA cần đo vào máy tiến hành đo mẫu 12 - Sau lần đo mẫu thực ước rửa để đảm bảo độ xác khác biệt mẫu DNA, tránh trùng mẫu Các mẫu có tỷ lệ mật độ quang ước s ng 260/280 nm đạt từ 1,8-2,0 sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA Kiểm tra độ phân mảnh DNA gel agarose 1% Microsatellite marker Microsatellite đoạn DNA ngắn có trình tự lặp lại thường nằm vùng intron vùng không mã hóa khác gen, thay đổi số lượng trình tự lặp lại khơng thay đổi chức gen Microsatellite sử dụng làm thị (marker) để xác định vị trí chuyên biệt nhiễm sắt thể (NST) - Các microsatellite marker sử dụng để phát LOH 11q: D11S908, D11S4094, D11S925, D11S4127, D11S1338*, D11S4090, D11S1760* (*: primer hai marker sử dụng để phát LOH 11p) - Các microsatellite marker sử dụng để phát LOH 1p: D1S2143, D1S468, DS2145, D1S164, GGAA30B06 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) Thiết lập phản ứng PCR với thành phần phản ứng bao gồm: 1X HotMaster Taq Buffer; 100ng gDNA, 50 µmol dNTP; 0,2µ primer 1U HotMaster Taq DNA polymerase (Takara, Nhật Bản) gDNA mẫu máu làm đối chứng Chương trình nhiệt: phút 98oC để biến tính DNA, 30 phút 57oC để bắt cặp kéo dài 72oC vòng phút chảy máy Mastercycler@ProS (Eppendorf, Đức) Điện di SDS-PAGE Điện di sản phẩm PCR gel Polyacryamide 10% với dung dịch nạp mẫu (Eppendorf, Đức) giờ, chạy 85V máy chạy điện di Bio-Rad nhiệt độ phòng Sau điện di, gel nhuộm với dung dịch 1000x SYBR Green I (Molecular Probes, Mỹ) với độ pha loãng 1:10000 30 phút Hình ảnh điện chụp ánh sáng UV VisionWorks®LS Software MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) 13 DNA tách chiết sau kiểm tra độ tinh sử dụng cho phản ứng MLPA điện di mao quản Sử dụng SALA® MLPA® probemix P251 (MRC-Holland) chuyên biệt cho UNBTK để phát thay đổi số vị trí NST khác Probemix chứa 46 probe chuyên biệt cho NST (1p36.2-1p36.3), 3, 11 (11q23) khuếch đại vùng trình tự 130 -490bp Kết phân tích phần mềm GeneMaker v1.97 (Softgenetics, State College, PA) Phương pháp MLPA c độ tin cậy cao nên phù hợp để kiểm chuẩn phát đoạn 1p 11q UNBTK Các giai đoạn thực phản ứng MLPA: - Giai đoạn biến tính DNA: lấy 5,0 µl DNA (có nồng độ 50 – 250 ng) cho vào tube 0,2 ml, biến tính DNA 98oC phút - Giai đoạn lai: bổ sung 3,0 µl hỗn hợp hybridization master mix vào tube phản ứng (gồm 1,5 µl SALSA MLPA Buffer 1,5 µl probemix), 98oC phút, sau đ lai 60oC từ 16 - 20 - Giai đoạn nối đoạn probe: thêm 32,0 µl hỗn hợp Ligase-65 master mix (gồm 25,0 µl nước; 3,0 µl Ligase buffer A; 3,0 µl Ligase buffer B 1,0 µl enzyme Ligase-65) vào tube phản ứng, trộn đều, ủ 54oC 15 phút để nối probe gắn huỳnh quang, sau đ tăng nhiệt độ lên 98oC phút để phá hủy enzyme Ligase-65 sau phản ứng nối - Giai đoạn khuyết đại số lượng probe: thêm 10,0 µl hỗn hợp polymerase master mix (gồm 7,5 µl nước; 2,0 µl SALSA PCR primer 0,5 µl SALSA polymerase) vào tube tiến hành phản ứng PCR với chương trình nhiệt sau: 35 chu kỳ gồm 98oC 30 giây; 60oC 30 giây; 72oC 60 giây, giai đoạn kết thúc 72oC 20 phút - Giai đoạn phân tách đoạn: sản phẩm sau kết thúc phản ứng MLPA phân tách đoạn hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP với thể tích gồm 32,0 µl Hi-di formamide; 2,0 µl Beckman D1-labeled CEQ size standard 600 2,0 µl sản phẩm MLPA Điều kiện phân tách: nhiệt độ mao quản 50oC, biến tính 90oC giây, điện ơm mẫu kV 30 giây, điện phân tách đoạn 4,8 kV 60 giây 14 Sau kết thúc điện di, kết phân tích phần mềm GeneMarker ver 1.91 (Softgenetics) để phát đột biến NST 11q Kết MLPA mẫu hiển thị dạng bảng biểu đồ sóng Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) sản phẩm pro e Kích thước peak xác định nhờ so sánh với thang kích thước mẫu đối chứng để tính tỉ lệ DQ (Dosage quotients) Nh m đối chứng thực phản ứng MLPA đồng thời với mẫu bệnh nhân cho kết tỷ lệ đỉnh sóng Đối với người ình thường, tỷ lệ đỉnh sóng so với nhóm chứng 1±0.3 Nếu tỷ lệ đỉnh sóng < 0,7 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến đoạn dị hợp tử Tỷ lệ đỉnh sóng >1,3 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến lặp đoạn dị hợp tử Trường hợp tỷ lệ đỉnh sóng =0, bệnh nhân mang đột biến đoạn đồng hợp tử B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đánh giá chất lƣợng gDNA tách chiết gDNA tách chiết đo mật độ quang kiểm tra độ phân mảnh phương pháp điện di gel agarose Kết cho thấy nồng độ gDNA từ mơ u (trung bình 213.9 ng/µl) cao gDNA từ mẫu máu (trung bình 37.7 ng/µl) Hầu hết mẫu (mơ máu) c độ tinh cao, ngoại trừ hai mẫu NB75 NB98 c độ tinh thấp (Bảng 1) Bảng Kết đo mật độ quang gDNA mẫu mơ máu No Sample Concentration(ng/µl) Purity of DNA 260/280 Tumor Blood Tumor Blood NB75 214,8 12,1 17,8 1,43 NB82 69,8 58,3 1,79 1,87 NB87 24,8 43,1 1,79 1,89 NB89 75,8 58,5 1,82 1,9 15 NB96 329,8 42,1 1,86 1,94 NB97 470,8 31,6 1,81 1,82 NB98 213,9 13,5 1,81 1,21 NB99 168,8 37,7 1,84 1,84 NB100 162,9 44,3 1,78 1,82 10 NB102 524,3 47,5 1,80 1,85 11 NB103 335,1 36,3 1,82 1,76 12 NB104 156,4 51,0 1,79 1,75 13 NB107 88,0 31,0 1,78 1,82 14 NB109 254,0 25,0 1,75 1,75 15 NB110 321,2 28,7 1,85 1,86 16 NB111 50.8 31,1 1,72 1.86 17 NB112 386.9 62,0 1,78 1.93 Kết điện di (hình 1) cho thấy hầu hết mẫu kh ng c smear, ăng điện di sáng rõ, trừ gDNA mẫu máu NB75 (giếng 20), NB98 (giếng 8) NB102 (giếng 2) ăng điện di mờ (tương quan với nồng độ DNA Bảng 1); điều chứng tỏ kết tách chiết DNA tốt, DNA không bị đứt gãy 16 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình Kết điện di gDNA mẫu mô máu UNBTK 1: Mô NB102, 2: Máu NB102, 3: Mô NB100, 4: Máu NB100, 5: Mô NB99, 6: Máu NB99, 7: Mô NB98, 8: Máu NB98, 9: Mô NB97, 10: Máu NB97, 11: Mô NB96, 12: Máu NB96, 13: Mô NB89, 14: Máu NB89, 15: Mô NB87, 16: Máu NB87, 17: Mô NB82, 18: Máu NB82, 19: Mô NB75, 20: Máu NB75 Phát đoạn 11q microsatellite marker Phản ứng PCR tối ưu h a nhiệt độ bắt cặp mồi từ 50oC đến 58oC để tìm điều kiện nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite marker Nhiệt độ bắt cặp tối ưu tất cặp mồi marker phát LOH 1p 58oC; đ , marker phát LOH 11q, nhiệt độ tối ưu cặp mồi cho D11S908 50oC marker lại 57oC Với nhiệt độ tối ưu này, mồi marker chạy PCR mẫu UNBTK sau đ điện di SDS-PAGE phát đoạn 1p 11q Kết cho thấy 17 mẫu UNBTK, c trường hợp (41,2%) đoan cánh ngắn NST 1; đ 62,5% marker D1S164 vị trí 1p36.23, ngồi cịn vị trí 1p36.3 (D1S468) 1p36.1 (GGAA30B06) Đối với LOH 11q, 11trường hợp (64,7%) đoạn cánh dài NST 11; đ 91% xảy vị trí 11p23 (D11S4127, D11S4090, D11S925) Đặc biệt có tổng cộng trường hợp (29,4%) vừa đoạn cánh ngắn NST 1p vừa đoạn cánh dài NST 11 (Bảng 2) 17 Bảng Kết phát LOH 11q microsatellite marker Tên mẫu Tuổi Giai đoạn Khuếch đại MYCN NB75 24 M + - - NB82 12 M - + + NB87 48 ND - + - NB89 12 L2 - + - NB96 48 M + - + NB97 48 L2 - + + NB98 48 ND - - - NB99 24 ND - + + NB100 60 ND - - + NB102 36 L2 - - - NB103 ND - + + NB104 60 ND - + + NB107 48 M - - + NB109 24 L2 - + + NB110 48 L2 - - + NB111 108 ND - - - NB112 12 L1 - - + Kết phân tích MLPA 18 LOH 1p LOH 11q Sau chạy MLPA, kết phân tích tổng quát biểu thị qua biểu đồ tỷ lệ đỉnh sóng (Height Radio Plot – HRP) Các điểm xanh lục biểu thi gen ình thường Hình Biểu đồ tỷ lệ đỉnh sóng HRP (A) Đối chứng - người ình thường; (B) Đột biến đoạn; (C) Đột biến lặp đoạn/ khuếch đại; (D) kh ng c đột biến bệnh nhân, điểm màu đỏ biểu thị gen có số lượng bất thường Nếu điểm vạch ngưỡng dưới, tức probe điểm kh ng khuếch đại gen mục tiêu bị đồng hợp dị hợp; điểm màu đỏ vạch ngưỡng trên, nghĩa probe điểm khuếch đại hay c đột biến lặp đoạn (Hình 2) Hơn nữa, đỉnh sóng probe bệnh nhân UNBTK đối sánh với đỉnh sóng người ình thường kết đột biến dựa vào tương quan đỉnh sóng, cụ thể dựa vào thương số liều lượng DQ (Dosage Quotient) mẫu UNBTK (NB82, NB89, NB97, NB99, NB100, NB104, NB109) chạy MLPA để phát biến đổi bất thường NST 1p 11q Kết phân tích MLPA đối sánh với kết sử dụng microsatellite marker trình bày Bảng 3, cho thấy 19 hai kết tương đồng với c trường hợp LOH 1p trường hợp LOH 11q Bảng Đối sánh kết MLPA với microsatellite marker STT Tên 1p mẫu 11q Microsatellite MLPA NB82 + + NB89 + + NB97 + + NB99 + + Vị trí 1p36.22 1p35.3 1p13 1p36.23 1p36.22 1p36.23 1p35.3 Microsatellite MLPA + + - - + + + + Vị trí 11q23 11q23 11q22 11q23 11q22.3 NB100 - - + + 11q23.3 11q22.1 NB104 + + 1p36 + + 1p36.23 NB109 + + 1p35.3 11q23 11q23.3 + + 11q22.3 1p13.3 BÀN LUẬN Tình hình diễn tiến bệnh UNBTK phức tạp đ ác sĩ lâm sàng kh kiểm soát bệnh chuẩn đoán tiên lượng bệnh dựa yếu tố lâm sàng tuổi tác, giai đoạn mô học Do đ , việc phát yếu tố tiên lượng dựa sở 20 sinh học phân tử c ý nghĩa v quan trọng việc tiên lượng bệnh điều trị bệnh hiệu Nghiên cứu chúng t i phát mẫu UNBTK thu nhận từ bệnh viện Nhi Đồng II có đoạn cánh ngắn NST cánh dài NST 11 Theo hệ thống phân loại nh m nguy quốc tế (INRG – International Neuroblastoma Risk Group) (2009), việc đánh giá nh m nguy cao dựa vào độ tuổi 18 tháng, giai đoạn M đặc biệt khuếch đại gen MYCN có tỷ lệ sống sót thấp 50% trường hợp khơng khuếch đại MYCN xem xét đánh giá dựa biến đổi NST Cụ thể, bệnh nhân thuộc giai đoạn L1 có LOH 1p tỷ lệ sống sót 75-85%, khơng có LOH 1p có tỷ lệ sống 85%; bệnh nhân thuộc giai đoạn L2 có LOH 11q tỷ lệ sống sót 50-75%, ngược lại khơng có LOH 11q tỷ lệ sống 75-85% [6] Điều mang ý nghĩa đáng kể giúp ác sĩ phân loại nh m nguy cụ thể rõ ràng nhằm đưa liệu pháp điều trị hiệu Kết nghiên cứu chúng t i phát tần số đột biến LOH 1p 62,5% LOH 11qlà 64,7% Con số cao gần gấp đ i so với nghiên cứu Edward F Attiyeh cộng năm 2005 Họ phát 23% (209/915) trường hợp UNBTK có LOH 1p36 34% (307/915) trường hợp có LOH 11q23 Ngồi nghiên cứu cho biết có mối tương quan LOH 1p với giai đoạn (theo INSS) khuếch đại MYCN LOH 11p phát hầu hết trường hợp khuếch đại MYCN [3] Sự khác biệt chênh lệch cỡ mẫu hai nghiên cứu Chính vậy, chúng tơi tăng số lượng mẫu để đánh giá LOH 1p 11q thời gian tới, đồng thời tìm hiểu mối tương quan biến đối NST với đặc điểm lâm sàng tuổi, giai đoạn, mô học khuếch đại MYCN bệnh nhân UNBTK Việt Nam KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ Kết luận Với phương pháp PCR dựa microsatellite marker MLPA chúng t i phát 62,5% trường hợp đoạn cánh ngắn NST 64,7% trường hợp đoạn 21 cánh dài NST11 bệnh nhân UNBTK bệnh viện Nhi Đồng II Một lần nữa, nghiên cứu góp phần phân loại nhóm nguy cho bệnh nhân UNBTK Kiến nghị Mặc dù nghiên cứu đạt kết định việc đánh giá đoạn dị hợp NST 11q nhóm bệnh nhân U NBTK số hạn chế mang tính khách quan Trong nghiên cứu, thiếu th ng tin giai đoạn 17 mẫu nên số lượng mẫu đựa đưa vào đánh giá mối tương thấp Hơn nữa, nhóm mẫu thuộc yếu tố lâm sàng khách chưa cân đối mặt số lượng nên có khả dẫn đến đánh giá mối tương quan biểu LOH 11q với đặc điểm lâm sàng khuếch đại MYCN mang tính tương đối Nghiên cứu hạn chế số lượng mẫu U NBTK để khảo sát biểu đoạn dị hợp 11q nên chưa thể đánh giá mối liên hệ biểu LOH 11q với yếu tố lâm sàng Tiếp theo, tăng cỡ mẫu nghiên cứu tìm mối tương quan LOH 1p 11q với đặc trung lâm sàng khuếch đại MYCN nhằm tiên lượng lựa chọn tìm phương pháp điều trị tốt 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Schleiermacher, G., I Janoueix-Lerosey, and O Delattre, Recent insights into the biology of neuroblastoma Int J Cancer, 2014 135(10): p 2249-61 Mueller, S and K.K Matthay, Neuroblastoma: biology and staging Curr Oncol Rep, 2009 11(6): p 431-8 Attiyeh, E.F., et al., Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in neuroblastoma N Engl J Med, 2005 353(21): p 2243-53 Schmidt, M.L., et al., Favorable prognosis for patients 12 to 18 months of age with stage nonamplified MYCN neuroblastoma: a Children's Cancer Group Study J Clin Oncol, 2005 23(27): p 6474-80 Thorner, P.S., The molecular genetic profile of neuroblastoma MINISYMPOSIUM: PATHOLOGY OF PAEDIATRIC NEOPLASMS, 2014: p 20 Cohn, S.L., et al., The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 2009 27(2): p 289-97 23 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng yếu tố nguy đƣợc xác định thơng qua hình ảnh khối u nguyên bào thần kinh Khối u lan hai khoang thể cổ - ngực, ngực – ụng, ụng – xương chậu Cổ Khối u bọc động mạch và/hoặc động mạch đốt xương sống và/hoặc tĩnh mạch cảnh Khối u nén khí quản và/hoặc phế quản Khối u trung thất thấp hơn, xâm nhập vào chỗ nối đốt sống T9 T12 Chỗ nối cổ-ngực Khối u ọc đám rối cánh tay Khối u ọc mạch máu xương đòn, động mạch đốt xương sống Khối u đè nén quản Khoang ụng – ngực Khối u ọc động mạch chủ và/hoặc tĩnh mạch chủ Bụng/xương chậu Khối u xâm nhập vào cửa gan dây nối gan với tá tràng Khối u xâm nhập hai bên cuống thận Khối u vùng xương chậu qua khe h ng Khối u lan vào bên cột sống Khối u di đến quan/cấu trúc: thận, gan, màng tim, hoành, tuyến tụy 24 ... thuật Microsatellite để phát đoạn nhiễm sắc thể 11 tế bào u nguyên bào thần kinh Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Nhật Quỳnh Như Điện thoại: 0937327294 Email: nnqnhu@ump.edu.vn Đơn vị quản lý chuyên... TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE ĐỂ PHÁT HIỆN MẤT ĐOẠN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 11 CỦA TẾ BÀO U NGUYÊN... TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Giới thi? ?u chung: U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u đặc nằm hộp sọ u ác tính phổi biến trẻ sơ sinh trẻ nhỏ c nguồn gốc từ tế c đặc tính giống nguyên thần kinh giai đoạn phát