sử dụng kỹ thuật pcr để phân loại sán dây moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này: Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Nguyễn Đức Tân - Phân Viện trưởng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS. Lê Đức Quyết - Phó trưởng Bộ môn Ký sinh trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Ký sinh trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Loan ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3 1.1.1. Trên thế giới 3 1.1.2. Trong nước 4 1.2. ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 4 1.3. CHU KỲ SINH HỌC CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 8 1.4. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở BÒ, DÊ, CỪU DO SÁN DÂY MONIEZIA GÂY RA 10 1.4.1. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 10 1.4.2 Tình hình nhiễm sán dây theo lứa tuổi 11 1.4.3 Tình hình nhiễm sán dây theo mùa 12 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI SÁN DÂY 13 1.5.1. Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm 13 1.5.2. Phương pháp chẩn đoán trên gia súc chết 16 1.5.3. Phương pháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo 17 1.5.4. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR 18 1.5.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) 18 1.5.4.2. Phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật PCR 29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. ĐỐI TƯỢNG 31 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 31 2.2.1. Nguyên vật liệu 31 2.2.2. Thiết bị chủ yếu 32 iii 2.3. Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu sán dây 32 2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu nghiên cứu 32 2.3.3. Phương pháp xét nghiệm phân 33 2.3.4. Phương pháp mổ khám phi toàn diện của Skrjabin 34 2.3.5. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào hình thái cấu tạo 34 2.3.6. Chiết tách DNA của sán dây Moniezia 35 2.3.7. Thiết kế mồi 36 2.3.8. Tối ưu hóa phản ứng PCR 38 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 41 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM SÁN DÂY Ở GIA SÚC ĂN CỎ (BÒ, DÊ, CỪU) 42 3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên 42 3.1.2. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 43 3.1.3. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 44 3.1.4. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ 45 3.1.5. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo lứa tuổi 47 3.2. XÁC ĐịNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CÁC MIN 49 3.3. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PCR 52 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA sán dây 52 3.3.2. Xác định nồng độ DNA mẫu 52 3.3.3. Xác định nhiệt độ tối ưu cho một số cặp mồi 53 3.3.3. Xác định thành phần loài sán dây bằng phản ứng PCR 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58 1. KẾT LUẬN 58 2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 11 Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia theo lứa tuổi 12 Bảng 2.1. Biến đổi dãy nồng độ 38 Bảng 2.2. Biến đổi dãy nhiệt độ 40 Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại ở các tỉnh 42 Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 44 Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 44 Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ 45 Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo lứa tuổi 48 Bảng 3.6. Kết quả xác định loài sán dây ở bò, dê, cừu bằng phương pháp nhuộm Các min 50 Bảng 3.7. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của một số mồi 54 Bảng 3.8. Kết quả xác định loài bằng phương pháp PCR và phương pháp nhuộm Các min 55 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia 5 Hình 1.2. Hình thái sán dây 5 Hình 1.3. Cấu tạo một đốt thân sán dây Moniezia 6 Hình 1.4. Vòng đời của sán dây Moniezia 8 Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng gradient-PCR 39 Hình 3.1. Trứng sán dây Moniezia sp 42 Hình 3.2. Sán dây Moniezia sp và các đốt sán 49 Hình 3.3. Tuyến giữa đốt của loài Moniezia expansa 51 Hình 3.4. Tuyến giữa đốt của loài Moniezia benedeni 52 Hình 3.5. Kết quả chạy PCR ở các nồng độ DNA mẫu khác nhau 53 Hình 3.6. Kết quả chạy gradient-PCR sử dụng mồi 53 Hình 4.7. Kết quả chạy điện di phân loài sán dây Moniezia 54 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch bệnh trong đó có bệnh sán dây Moniezia thường gặp ở súc vật ăn cỏ nhất là gia súc còn non. Bệnh xảy ra chủ yếu do hai loài sán dây thuộc lớp Cestoda kí sinh ở ruột non. Gia súc bị bệnh sán dây thì gầy yếu, thiếu máu, suy nhược và dễ chết nếu nhiễm nặng. Bệnh ký sinh trùng không gây thành dịch ổ dịch lớn như các bệnh do vi khuẩn và vi rút khác, nhưng thường kéo dài âm ỉ, làm giảm năng suất chăn nuôi, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của gia súc, giảm hiệu quả kinh tế tạo điều kiện cho các bệnh truyền nhiễm phát sinh mà còn tác động không tốt đến chủ trương phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại ở các vùng đồng bào dân tộc thiểu số nhằm xóa đói giảm nghèo, chuyển dịch cơ cấu nông nhiệp. Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có ký sinh trùng ở gia súc cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc tính hình thái học và nuôi cấy. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhưng trong nhiều trường hợp khó khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dưới loài một cách chính xác (McCarthya, Moore, 2000). Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm đúng môi trường thích hợp nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ cho ký sinh trùng, bệnh phẩm đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái sống, nên các phương pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất nhiều hạn chế (Gilbert, 2002; Parida, 2008; Mori và Notomi, 2009). Các phương pháp chẩn đoán truyền thống áp dụng trong lâm sàng và dịch tễ học như xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng hay các sản phẩm của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có những sai số nhất định, tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký sinh trùng cùng tồn tại ở một nơi như đường ruột ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn. Phương pháp sinh học phân tử nhân bản DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu được, đặc biệt là phân tích biến đổi gen/hệ gen được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã bước đầu chứng minh cho kết quả chính xác hơn nhiều so với phương pháp truyền thống (Elnifro et al., 2000; De Lellis et al., 2 2008; Mori và Notomi, 2009). Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có (Galluzzi et al., 2007; Littlewood, 2008). Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những định hướng phát triển vượt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là sự phát triển phương pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) được ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó có ký sinh trùng (Chandler và Colitz, 2006; Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008). Do có tính nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu. Từ thực tế trên, dưới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Sử dụng kỹ thuật PCR để phân loại sán dây Moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ” với mục đích sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định nhanh các loài sán dây phổ biến nhiễm ở một số loại gia suac ăn cỏ làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho gia súc một cách có hiệu quả. Nội dung của đồ án: 1) Đánh giá tình hình nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu ở một số tỉnh Miền Trung và Tây Nguyên, 2) Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu, 3) Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần loài sán dây Moniezia nhiễm ở bò, dê, cừu. Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn các hạn chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.1.1. Trên thế giới Bệnh sán dây ở động vật nhai lại (bò, dê, cừu) do các loài Moniezia expansa và Moniezia benedeni cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu sau: Năm 2001, Borges và cộng sự cho biết bò vùng Saopaulo của Brazin nhiễm một loài sán dây là Moniezia expansa với tỷ lệ là 4,76%. Năm 2003, Achi và cộng sự đã điều tra tình hình nhiễm giun sán ở bò tại các lò mổ ở vùng Savannah của Pháp và xác định loại sán thường gặp nhất là sán dây với tỷ lệ nhiễm là 31%. Nwosu và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê tại Nigeria là 31%. Ở Ethiopia kết quả điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường ruột ở dê cho thấy tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia expansa là 32,2% và số lượng trứng/gam phân là 545,2 trứng (Etana debela, 2002). Trong quá trình điều tra ký sinh trùng đường hô hấp và tiêu hóa ở dê Iceland tác giả Yfirrlot đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm Moniezia expansa là 20%. Ở cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Eeroanska và cộng sự (2005) tại Slovakia là 19,2%. Cũng trên đối tượng cừu, kết quả điều tra của Munib và cộng sự (2006) cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giữa các loài sán dây trên đàn cừu ở Pakistan: tỷ lệ nhiễm M. expansa là 71,3% trong khi đó M. benedeni là 2,17% và số lượng trứng/gam phân (EPG= eggs per gram faeces) tương ứng là 388,85 và 11,8 trứng. Lughano Kusiluka và Dominic Kambarage (2006) cho biết có thể dùng một trong các loại thuốc: Niclosamide (liều 80mg/kg), Resoranttel (75 mg/kg), Paraziquantel (15 mg/kg), Albendazole (5mg/kg), Mebendazole (10 mg/kg) để điều trị bệnh sán dây. Đặc biệt thuốc Benzimidazole có hiệu lực cao trong việc điều trị bệnh sán dây họ Anoplocephatidae. 4 1.1.2. Trong nước Việc nghiên cứu sán dây ở Việt Nam được bắt đầu hơn một thế kỷ nay. Năm 1870, Can de J. lần đầu tiên mô tả loài sán dây Diphyllobothrium latum tìm thấy ở người Nam Bộ (Việt Nam). Sau đó 10 năm mới xuất hiện các công trình nghiên cứu lẻ tẻ về 1 số loài sán dây gây bệnh cho người. Từ đó việc nghiên cứu về thành phần ở người được chú ý hơn, rồi mở rộng phạm vi nghiên cứu sang một số loài động vật hoang dã. Tổng hợp có hệ thống về sán dây ở gia súc nhai lại Việt Nam, Drozdz j. và Malcrewski A. (1971) cho biết, trong họ Acanthocephalidae có giống Moniezia gây bệnh cho dê, cừu; hiếm hơn ở bò, trâu, và các thú nhai lại khác. Giống Moniezia có 2 loài là M. expansa và M. benedeni phân bố khắp các vùng trong cả nước. Theo Phan Địch Lân và cộng sự (1975) bệnh sán dây là một trong những nguyên nhân gây chết ở dê với tỷ lệ khá cao (40%) vì vậy việc khống chế bệnh sán dây cần được quan tâm. Đào Hữu Thanh và Lê Sinh Ngoạn (1980), Phan Địch Lân Và cộng sự (1975), Nguyễn Thế Hùng (1994) cũng xác nhận 2 loài sán dây thuộc giống Moniezia ký sinh ở dê và các thú nhai lại khác. Nguyễn Thị Kim Lan (2000) cho biết, loài M. expansa phổ biến hơn so với loài M. benedeni (hệ số thường gặp loài M. expansa là 100, trong khi loài M. benedeni là 75). Tác giả đã thử nghiệm một số thuốc điều trị bệnh giun sán đường tiêu hóa ở dê và nhận thấy Niclosamid-Tetramisol B và Vermitan rất an toàn và có hiệu quả trong việc điều trị sán dây. 1.2. ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA Sán dây Moniezia có hình dải băng màu trắng, cơ thể dài, hẹp chia thành ba phần: đầu hơi tròn (phần đầu có các giác bám), cổ (là những đốt sán nối tiếp sau đầu, có khả năng sinh ra các đốt thân, cơ quan sinh sản ở các đốt cổ chưa hình thành rõ), thân (gồm những đốt sau cổ, có hình dạng và cấu tạo khác nhau) (Hình 1.1). 5 Thân sán dây gồm ba loại đốt: những đốt chưa thành thục về sinh dục (ở gần cổ), cơ quan sinh dục chưa phát triển đầy đủ, chỉ thấy cơ quan sinh dục đực. Những đốt thành thục về sinh dục (ở giữa thân), cơ quan sinh dục đực và cái, có hệ bài tiết, cấu tạo mỗi đốt tương tự như mỗi cơ thể sán lá nhưng khác là không có hệ tiêu hóa. Những đốt già (ở cuối thân sán), bên trong đốt sán chứa đầy tử cung với vô số trứng sán dây. Ở những đốt già, cơ quan sinh dục đực bị thoái hóa. Những đốt già thường xuyên rụng xuống, rời khỏi cơ thể sán và theo phân ra ngoài. Hình 1.1. Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia Hình 1.2. Hình thái sán dây A. Moniezia expansa ; B. Moniezia benedeni 1. Đầu ; 2. Đốt sán ; 3. Trứng [...]... Nguy n súc c Tân và c ng s (2010) cho bi t t l nhi m sán dây theo loài gia m t s t nh Nam Trung B và Tây Nguyên như sau B ng 1.1 T l nhi m sán dây theo loài gia súc Loài gia súc S gia súc i u tra (con) S gia súc nhi m (con) T l nhi m (%) Bò 333 18 5,41 Dê 392 81 20,66 C u 238 39 16,39 T ng c ng 963 138 14,33 1.4.2 Tình hình nhi m sán dây theo l a tu i Theo k t qu i u tra c a Phan ch Lân và Ph m S Lăng... PHÁP CH N OÁN VÀ PHÂN LO I SÁN DÂY 1.5.1 Chu n oán trong phòng thí nghi m M c ích c a phương pháp này là tìm các t sán ho c tr ng sán dây có trong phân c a gia súc nhai l i K thu t l y phân xét nghi m: trong t ho c trên n n chu ng có ch a s lư ng l n tr ng và u trùng giun sán s ng t do Khi gia c m, gia súc th i phân tr ng và u trùng giun tròn s ng t do có th dính vào phân gây khó khăn cho vi c xét nghi... sinh súc, gia c m t c là tìm giun sán trư ng thành ho c giun sán trong phân nhi m giun sán gia t sán dây, tr ng ho c u trùng ây là nh ng phương pháp thông d ng ánh giá tình hình các àn gia súc, gia c m • Phương pháp tìm giun sán trư ng thành tìm giun sán trư ng thành ho c các t sán dây ư c th i ra theo phân ( c bi t là khi t y giun sán thăm dò), có th dùng que b i phân và quan sát b ng m t thư ng ho... n Th Kim Lan, 2002) Hình 1.4 Vòng i c a sán dây Moniezia ch 9 Vòng - i c a sán dây Moniezia di n ra như sau: t sán già r ng, theo phân dê, c u, bò, trâu ra ngoài (sán dây Moniezia thu c h Anoplocephalidae, b Cyclophyllidea nên không hu tr ng) t sán phân ngo i c nh, gi i phóng nhi u tr ng sán Tr ng sán dây phát tán ư c các loài nh n trong t, t h Oribatidae ăn ph i Vào ư ng tiêu hoá c a nh n t, tr ng... i sán dây ký sinh ru t non c a gia súc nhai l i Gia súc nhai l i là v t ch cu i cùng c a sán, giúp sán hoàn thành vòng và kí sinh giai o n thành th c ch trung gian là nhi u lo i nh n hoàn thành vòng i i, sán dây Moniezia c n v t t thu c h Orbatidae như Galumna, G Obvius, G nigara,Scheloribates laevigatus, S latipes (Tr nh Văn Th nh, 1963; Phan Lân và Nguy n Th Kim Lan, 2002) Hình 1.4 Vòng i c a sán. .. RA 1.4.1 Tình hình nhi m sán dây theo loài gia súc Rao J R và Deorani V P S (1988) cho bi t, xét nghi m phân trâu, bò, dê huy n Port Blair ( n ), th y bò nhi m sán dây Moniezia là 2,1%, dê là 3% Xét nghi m các m u phân c a bò, trâu, dê, c u thung lũng Kangra - trong s 1194 gia súc có 1017 con nhi m t m t n , k t qu là n nhi u lo i ký sinh trùng (85%) Riêng t l nhi m sán dây Moniezia thì bò nhi m 1%,... n gi a u i phân bi t 2 loài là s s p x p c a t có d ng v ch, n m t p trung gi a t sán Tr ng sán cũng có hình 3 c nh ho c 4 c nh hơi tròn, trong u trùng có 6 móc, kích thư c tr ng kho ng 0,063 x 0,086mm V trí c a sán dây Moniezia trong h th ng phân lo i giun sán Trong h th ng phân lo i ng v t nuôi ng v t h c, theo Phan Th Vi t và c ng s (1977), sán dây Moniezia có v trí như sau: L p sán dây Cestoda... host start PCR là không c n thi t K thu t này r t có ích khi: - M u DNA có ít hơn 104 DNA phân t - Ph n ng PCR v i phân t DNA có tr ng lư ng l n - Multiplex PCR PCR t (nested PCR) Là PCR có hai giai o n: giai o n là PCR vòng ngoài) khu ch u là PCR dùng m t c p m i ngoài (g i i m t o n DNA trong o có ch a các trình t c hi u mu n tìm, sau ó dùng s n ph m PCR vòng ngoài này làm khuôn cho vào ng PCR có c... cái thông v i bên ngoài c Hình 1.3 C u t o m t t thân sán dây Moniezia 7 Sán dây Moniezia thu c b Cyclophyllidae nên có c i m t cung phân nhánh, không có l thông v i bên ngoài Tuy n noãn hoàn t p trung có hình kh i Tr ng n m trong t cung Sán Moniezia không tr ng mà t sán già s tách kh i thân và theo phân ra ngoài Hình thái c a Moniezia expansa và Moniezia benedeni có nh ng c i m riêng: M.expansa: dài... cao do ph i m tube PCR vòng trong cho s n ph m PCR vòng ngoài vào PCR t không d ng(non-stop nested PCR) Là PCR t nhưng ư c thi t k vòng trong c hai giai o n PCR vòng ngoài và PCR u ư c th c hi n trong cùng m t tube PCR nh v y mà sau khi hoàn t t PCR vòng ngoài thì ch y ti p chương trình PCR vòng trong ch không c n d ng l i nh s n ph m khu ch i c a PCR vòng ngoài tr thành b n g c cho PCR vòng trong ngay . PCR để phân loại sán dây Moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ với mục đích sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định nhanh các loài sán dây phổ biến nhiễm ở một số loại gia suac ăn cỏ làm cơ sở. 17 1.5.4. Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR 18 1.5.4.1. Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) 18 1.5.4.2. Phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật PCR 29 CHƯƠNG 2. ĐỐI. lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc ở một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên như sau . Bảng 1.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc Loài gia súc Số gia súc điều tra (con) Số gia súc nhiễm