2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu sán dây
Lấy phân bằng hai phương pháp:
- Dùng tay bọc túi nilon lấy phân qua trực tràng bò, dê, cừụ - Lấy phân ngay sau khi bò, dê, cừu mới thải phân ra ngoàị
Các mẫu phân sau khi lấy xong được để riêng vào túi nilon sạch, có nhãn ghi số thứ tự mẫu, tính biệt, khối, thể trạng, loài gia súc, địa điểm thu thập mẫu và đưa về phòng thí nghiệm để xét nghiệm.
2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu nghiên cứu
Mẫu phân phải đưa về phòng thí nghiệm hoặc cơ sở nghiên cứu để xét nghiệm ngaỵ Nếu mẫu phân chưa xét nghiệm được ngay thì cần bảo quản ở nhiệt độ dưới 10 0C, thời gian bảo quản không quá 7 ngàỵ
Mẫu sán dây được thu thập qua mổ khám gia súc tại các lò mổ, dùng kim giải phẫu hoặc bút lông để lấy sán, đếm số lượng sán sơ bộ, để chúng chết tự nhiên trong nước lã, sau đó đem rửa sạch. Mẫu sán dây sau khi lấy được từ phương pháp mổ
khám thì được lưu giữ trong cồn 70 0 sử dụng cho phương pháp nhuộm Các min và bảo quản ở nhiệt độ - 20 0C để sử dụng tách chiết DNẠ
2.3.3 Phương pháp xét nghiệm phân
•Phương pháp phù nổi
Phương pháp này dựa trên nguyên lý sự chênh lệch về tỷ trọng của dung dịch nước muối (NaCl) bão hòa có tỷ trọng d = 1,18 lớn hơn tỷ trọng của trứng sán dây, làm cho trứng giun sán nổi lên bề mặt dung dịch. Dung dịch nước muối bão hoà pha bằng cách: cho tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu hoặc nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy cho đến khi muối không hoà tan được nữa (thường dùng 380 - 400 gam muối tinh thể không ngậm nước, hoặc 450 gam muối tinh thể ngậm nước). Để nguội, được dung dịch muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán.
Các bước tiến hành:
- Bước 1: lấy 5 - 10 g phân cho vào cốc thủy tinh, rồi cho dung dịch nước muối bão hòa vào khuấy thật kỹ cho tan rồi lọc qua rây lọc.
- Bước 2: lấy dung dịch lọc đổ vào lọ tiêu bản (3 lọ cho một mẫu). Rồi đặt lamen vào giữa lọ tiêu bản, chờ 15 - 20 phút rồi lấy lamen ra, đặt trên lam kính để kiểm trạ
- Bước 3: đọc tiêu bản qua kính hiển vi với độ phóng đại 10 x 10.
•Phương pháp gạn rửa sa lắng
Phương pháp này dựa trên nguyên nguyên lý sự chệnh lệch về tỷ trọng của nước lã sạch có tỷ trọng d = 1 bé hơn tỷ trọng của đốt sán dây, làm cho đốt sán dây chìm xuống đáy nước.
Các bước tiến hành:
• Bước 1: Lấy phân gia súc cần kiểm tra cho vào cốc tam giác, rồi cho nước lã vào khuấy tan phân rồi để yên khoảng 15 phút.
• Bước 2: Đổ nước đi, để lại cặn. Rồi đổ nước vào cho đầy cốc, để yên cho lắng cặn khoảng 15 phút.
• Bước 3: Cứ làm như vậy cho đến khi nước trong thì đổ cặn thu được trên giấỵ Dùng kính lúp soi để tìm đốt sán.
2.3.4 Phương pháp mổ khám phi toàn diện của Skrjabin
Phương pháp mổ khám này tìm thấy tất cả các loại sán dây ký sinh ở cơ quan tiêu hoá của động vật nhai lại, từ đó có thể đánh giá được tỷ lệ nhiễm, mức độ nhiễm, bệnh tích do sán dây gây rạ
Kỹ thuật kiểm tra giết mổ:
Kiểm tra bên ngoài xem da, lông, niêm mạc, thể trạng: béo, gầy, trung bình. Sau khi giết mổ tiến hành kiểm tra các cơ quan bên trong như:
- Ruột non: dùng kéo cắt dọc ruột non, vuốt lấy chất chứa bên trong cho vào xô lắng cặn. Lặp đi lặp lại như vậy đến 5 - 6 lần cho đến khi thấy nước trong xô trong thì dừng lạị Tiếp đó cho vào khay để tìm giun sán và bảo quản.
- Ruột già và manh tràng: lấy chất chứa bên trong cho vào xô, dội nước lắng cặn nhiều lần, sau đó cho vào khay để nhặt giun sán. Đồng thời lộn niêm mạc ruột ra ngoài để kiểm trạ
2.3.5 Phương pháp phân loại sán dây dựa vào hình thái cấu tạo
Nhìn chung, hình thái của sán dây M.benedeni tương đối giống với M.expansa. Có một điểm quan trọng để phân biệt 2 loài là sự sắp xếp của tuyến
giữa đốt. Ở loại M. benedeni tuyến giữa đốt có dạng vạch, nằm tập trung ở giữa đốt sán. Còn tuyến giữa đốt của M. expansa là một dãy dài hình hoa thị. Mẫu sán dây được tiến hành nhuộm Các min để xem hình thái cấu tạo bên trong của sán, sau đó dựa vào khóa phân loại của Phan Thế Việt, Nguyễn Thị Kỳ, Nguyễn Thị Lê (1977) để xác định loàị
•Phương pháp nhuộm Các min
Thuốc nhuộm Các min: Lấy 5g kali sunfat (phèn trắng) nghiền nhỏ trong nước cất 95ml, pha với 2 – 3g Các min, đun cách thủy khoảng 1 giờ. Để nguội, lọc qua giấy lọc, đựng vào lọ có màu, để chống thối người ta thường cho vài giọt focmon hoặc một ít thymol.
Cách tiến hành:
Trước khi nhuộm, sán phải được rửa sạch bằng vòi nước chảy chậm, rồi nhuộm Các min trong vài phút đến 1 giờ. Sau khi nhuộm cần rửa sạch sán bằng nước lã rồi qua giai đoạn rút nước ở sán bằng cồn với các nồng độ từ thấp tới cao (500, 600, 700, 850, 960). Chú ý khi màu nhuộm quá thẫm, có thể làm nhạt màu bằng cách cho vào dung dịch cồn – HCl 1% (cồn 700 99ml pha với 1 ml HCl). Để làm trong suốt sán, từ khi nhuộm và rút nước, ngâm vào dung dịch cacbon-xylon (100 ml xylon hòa với 22g phenol). Sau đó, vớt sán ra, thấm khô, đặt lên phiến kính gắn nhựa mada và có đề nhãn như trong ống nghiệm. Soi kính hiển vi để định loạị Riêng đối với đầu đốt sán dây, không cần nhuộm. Đầu được cắt ra, cho lên phiến kính, nhỏ một giọt glyxerin len, đậy lá kính, soi qua kính hiển vị
2.3.6. Chiết tách DNA của sán dây Moniezia
Tùy theo điều kiện bảo quản mẫu sán dây mà trước khi chiết tách chúng ta cần xử lý mẫụ Nếu mẫu bảo quản cồn 70º thì phải rửa mẫu 3 lần bằng dung dịch PBS; nếu mẫu bảo quản tươi ở điều kiện -20 ºC thì phải để mẫu tan ở nhiệt độ phòng mà không cần phải rửa bằng dung dịch PBS.
Ta thực hiện các bước như sau: Pha 2 dung dịch buffer:
AW1: hút 2,375 ml AW1 và pha với 3,125 ml cồn. AW2: hút 1,663 ml AW2 và pha với 3,837 ml cồn
Nc3, Nd1, Nd2, Kb1, Kb2, Kb3, Kb4, Kb5.
•Sử dụng mỗi kéo riêng cho việc cắt, cân khoảng 25 mg mẫu (sán dây) cho vào 10 ống Eppendorf 1,5 ml hoặc 2 ml có kí hiệu mẫu như trên và nghiền nhỏ.
•Cho 180 µl ALT vào mẫu đã cân tiến hành votex.
•Cho 20 µl Proteinase-K, voltex ủ ở 56 0C trong water bath 3h để mô phân giải hoàn toàn.
•Thêm 200 µl AL, voltex. •Cho 200 µl Ethanol, lắc.
•Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc (Dneasy Mini column), ly tâm 8000 v/phút trong thời gian 1 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào spin column mớị
•Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000v/phút trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào spin column mớị
•Thêm 500 µl buffer AW2 ly tâm 14000v/phút trong 3 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào ống Eppendorf 1,5 ml.
Thêm 100 µl AE, ly tâm 8000v/phút trong 1 phút. Thu lấy dịch có chứa DNA bỏ cột, bảo quản dịch vừa thu được ở - 20 0C.
2.3.7. Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn oligonucleotide (18-24 base) bổ sung với trình tự trên DNA, gồm có mồi xuôi và mồi ngược
•Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã.
•Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã.
•Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc.
•Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30% < G+C <70%.
•Mồi phải bảo đảm đủ dài để bắt cặp chính xác.
•Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
•Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 nu tốt nhất là dưới 1000 nu).
Cách tính nhiệt độ bắt mồi:
- Đối với mồi ≤ 20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính như sau: Tm = [2(A+T) + 4 (G+C)]0C
- Đối với mồi >20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức: Tm = 22 + 1.46[ 2(G + C) + (A + T)]0C
- Việc xác định loài sán dây ở bò, dê, cừu bằng kỹ thuật PCR được căn cứ vào kết quả chạy PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu là:
ITS1-F : 5-GCT GCT ACC CGC ATG ATG TT-3 ITS1-R : 5-GGC AAG CCT ATA GCC GCA AT-3 ITS1-R1 : 5-AGC AAT AGT GCT TTA ACG CGC-3
- Mồi được thiết kế dựa trên cơ sở khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen quốc tế (Genbank) và kết quả sử dụng phần mềm chuyên dụng Blast để so sánh trình tự gen ITS1, 5.8S rRNA của Moniezia benedeni với trình tự gen ITS1, 5.8S rRNA của
Moniezia expansa có trình tự Nucleotide tương đồng 83%. Chúng tôi đã sử dụng
các đoạn Nucleotide giống hệt nhau để thiết kế mồi xuôi ( ITS1-F) và mồi ngược ( ITS1-R) để nhân đoạn trong gen. Ngoài ra, dựa vào đoạn trình tự Nucleotide khác biệt giữa hai loài để thiết kế mồi ngược đặc hiệu (ITS1-R1) dành riêng cho loài
Moniezia expansạ
2.3.8. Tối ưu hóa phản ứng PCR
Mẫu sau khi tiến hành tách chiết DNA được tiến hành chạy PCR để phân loàị Tiến hành pha mix R và R1 cho 11 mẫu:
• Pha R:
- Nước: 22,5 µl x 11 = 247,5 µl.
- Tag PCR Master Mix: 25 µl x 11 = 275 µl. - ITS1- F: 1 µl x 11 = 11 µl.
- ITS1- R: 1 µl x 11 = 11 µl. • Pha R1:
- Nước: 22,5 µl x 11 = 247,5 µl.
- Tag PCR Master Mix: 25 µl x 11 = 275 µl. - ITS1- F: 1 µl x 11 = 11 µl.
- ITS1- R: 1 µl x 11 = 11 µl. • Tối ưu hóa thể tích DNA mẫu:
Để xác định được nồng độ DNA tối ưu nhất khi chạy PCR chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các nồng độ DNA mẫu đã chiết tách theo bảng biến đổi dãy nông độ phản ứng sau:
Bảng 2.1. Biến đổi dãy nồng độ
Dãy nồng độ DNA mẫu
A B C D E F
Cho lần lượt 0,4 µl; 0,5µl; 0,6 µl; 0,7µl ; 0,8µl và 0,9µl DNA mẫu ở các dãy nồng độ như bảng 3.1 cho vào ống PCR (loại ống 0,2ml) tương ứng. Pha các thành phần phản ứng mix R và R1 rồi hút tương ứng 49,6µl; 49,5µl; 49,4µl; 49,3µl; 49,2µl và 49,1µl các thành phần phản ứng được pha trộn ở trên cho vào các ống PCR đã được cho DNA khuôn trước đấỵ Cho tất cả các ống PCR vào máy nhân gen và vận hành máỵ Sau đó chạy điện di, đọc kết quả trên máy và chọn nồng độ DNA mẫu có kết quả tốt nhất để dung cho phản ứng PCR phân loại sán dây Monieziạ
• Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi:
Cho lần lượt 0,5µl DNA mẫu cho vào ống PCR (loại ống 0,2ml) tương ứng, ống đối chứng âm cho nước free DNAse, RNAsẹ Pha các thành phần phản ứng mix R và R1 rồi hút 49,5µl các thành phần phản ứng được pha trộn ở trên cho vào các ống PCR đã được cho DNA khuôn trước đấỵ Cho tất cả các ống PCR vào máy nhân gen và vận hành máỵ Để xác định nhiệt độ gắn tối ưu của các cặp mồi ITS1-F, ITS1-R, ITS1-R1, chúng tôi thực hiện phản ứng gradient- PCR với dãy thay đổi nhiệt độ gắn của mồi từ 480C đến 560C (gradient temperature). Phản ứng được thực hiện thao chu trình nhiệt như sau:
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng gradient-PCR
1 chu kỳ Lặp lại 30 lần 48-560C 720C 95 0C 95 0C 720C 100C ∞ 10 phút 1 phút 1 phút 1 phút 1 phút
Bảng 2.2. Biến đổi dãy nhiệt độ Dãy nhiệt độ (0C) Mồi A B C D E (ITS1-F;ITS1-R) 48 50 52 54 56 (ITS1-F;ITS1-R1) 48 50 52 54 56 • Thành phần cho một phản ứng PCR (50 µl) gồm: - 0,5 µl mẫu DNA (khoảng 0,1-0,3 µg DNA/µl). - 49,5 µl R và R1 cho từng mẫụ
• Tiến hành bố trí sơ đồ mẫu như sau: tính từ trái qua phải
Nd1(R), Nd1(R1), Nd2(R), Nd2(R1), Nc1(R), Nc1(R1), Nc2(R), Nc2(R1), Nc3(R), Nc3(R1), Kb1(R), Kb1(R1), Kb2(R), Kb2(R1), Kb3(R), Kb3(R1), Kb4(R), Kb4(R1), Kb5(R), Kb5(R1).
• Sản phẩm sau khi chạy PCR được chạy điện di:
Chuẩn bị thạch agarose:
- Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lược vào khuôn.
- Pha TBE 1X: dùng cốc đong 100 ml TBE 10X pha với 900 ml nước cất. - Pha 130 ml gel agarose 2%: cân 2,6 g agarose cho vào bình thủy tinh và thêm 127,4 ml TBE 1X sau đó đun dưới lò vi sóng khoảng 1 phút 30 giây cho agarose tan hoàn toàn.
- Khi dung dịch gel agarose xuống khoảng 50 0C cho thêm 5,2 µl thuốc nhuộm ethyldiumbromidẹ
- Gài lược tạo giếng sau đó tiến hành đổ gel. Trong quá trình đổ gel chú tránh tạo bọt khí.
- Sau khi gel đông hoàn toàn thì rút lược và cho TBE 1X vào để bảo quản gel sau đó chạy điện dị
Nạp mẫu:
- Hút 1 µl loading buffer và 5 µl mẫu DNA sau khi đã chạy PCR tiến hành mix và sau đó tra mẫu vào giếng.
- Marker: hút 0,6 µl DNA lađer, thêm 4,5 µl nước tinh khiết và 1 µl loading buffer trộn đều sau đó tra vào giếng.
- Sơ đồ mẫu như sau: tính từ trái qua phải: Nd1(R), Nd1(R1), Nd2(R), Nd2(R1), Nc1(R), Nc1(R1), Nc2(R), Nc2(R1), Nc3(R), Nc3(R1), Kb1(R), Kb1(R1), Kb2(R), Kb2(R1), Kb3(R), Kb3(R1), Kb4(R), Kb4(R1), Kb5(R), Kb5(R1), Marker.
- Chạy điện di ở 110 - 115V trong thời gian 45 phút đến 1 giờ.
- Đọc kết quả bằng máy đọc và chụp ảnh gel (Model Bioprint-Vilber Lourmat).
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu về tỷ lệ nhiễm được tính bằng công thức sau: - Tỷ lệ nhiễm (%) = Số gia súc bị nhiễmSố gia súc điều tra x 100
Số liệu về tỷ lệ nhiễm sán dây ở các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái, tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo lứa tuổi được xử lí theo phương pháp thống kê sinh học. Kết quả được phân tích thống kê bằng phần mềm Excel 2003, sử dụng ANOVẠ Giá trị của P < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
CHƯƠNG IIỊ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM SÁN DÂY Ở GIA SÚC ĂN CỎ (BÒ, DÊ, CỪU) 3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và 3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên
Tiến hành thu mẫu ở 286 gia súc tại Đắc Lắc, Ninh Thuận và Khánh Hòa để phân tích tình hình nhiễm sán dâỵKết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại ở các tỉnh
Tỉnh Số gia súc điều tra
(con) Số gia súc nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Đắc Lắc 82 11 13,41 Ninh Thuận 93 13 13,97 Khánh Hòa 111 17 15,31 Cộng 286 41 14,33 Hình 3.1. Trứng sán dây Moniezia sp
Tổng số gia súc được điều tra là 286 con, trong đó tỉnh Đắc Lắc là 82 con, Ninh Thuận là 93 con và Khánh Hòa là 111 con. Kết quả xét nghiệm các mẫu phân thu thập được ở các địa phương cho thấy tỷ lệ nhiễm sán dây ở các tỉnh Đắc Lắc, Ninh Thuận và Khánh Hòa lần lượt là 13,41%; 13,97%; 15,31% và tỷ lệ nhiễm