Tùy theo điều kiện bảo quản mẫu sán dây mà trước khi chiết tách chúng ta cần xử lý mẫụ Nếu mẫu bảo quản cồn 70º thì phải rửa mẫu 3 lần bằng dung dịch PBS; nếu mẫu bảo quản tươi ở điều kiện -20 ºC thì phải để mẫu tan ở nhiệt độ phòng mà không cần phải rửa bằng dung dịch PBS.
Ta thực hiện các bước như sau: Pha 2 dung dịch buffer:
AW1: hút 2,375 ml AW1 và pha với 3,125 ml cồn. AW2: hút 1,663 ml AW2 và pha với 3,837 ml cồn
Nc3, Nd1, Nd2, Kb1, Kb2, Kb3, Kb4, Kb5.
•Sử dụng mỗi kéo riêng cho việc cắt, cân khoảng 25 mg mẫu (sán dây) cho vào 10 ống Eppendorf 1,5 ml hoặc 2 ml có kí hiệu mẫu như trên và nghiền nhỏ.
•Cho 180 µl ALT vào mẫu đã cân tiến hành votex.
•Cho 20 µl Proteinase-K, voltex ủ ở 56 0C trong water bath 3h để mô phân giải hoàn toàn.
•Thêm 200 µl AL, voltex. •Cho 200 µl Ethanol, lắc.
•Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc (Dneasy Mini column), ly tâm 8000 v/phút trong thời gian 1 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào spin column mớị
•Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000v/phút trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào spin column mớị
•Thêm 500 µl buffer AW2 ly tâm 14000v/phút trong 3 phút. Bỏ dịch ly tâm, chuyển cột có màng lọc vào ống Eppendorf 1,5 ml.
Thêm 100 µl AE, ly tâm 8000v/phút trong 1 phút. Thu lấy dịch có chứa DNA bỏ cột, bảo quản dịch vừa thu được ở - 20 0C.
2.3.7. Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn oligonucleotide (18-24 base) bổ sung với trình tự trên DNA, gồm có mồi xuôi và mồi ngược
•Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã.
•Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã.
•Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc.
•Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30% < G+C <70%.
•Mồi phải bảo đảm đủ dài để bắt cặp chính xác.
•Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gen.
•Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 nu tốt nhất là dưới 1000 nu).
Cách tính nhiệt độ bắt mồi:
- Đối với mồi ≤ 20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính như sau: Tm = [2(A+T) + 4 (G+C)]0C
- Đối với mồi >20 nucleotide thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức: Tm = 22 + 1.46[ 2(G + C) + (A + T)]0C
- Việc xác định loài sán dây ở bò, dê, cừu bằng kỹ thuật PCR được căn cứ vào kết quả chạy PCR với 2 cặp mồi đặc hiệu là:
ITS1-F : 5-GCT GCT ACC CGC ATG ATG TT-3 ITS1-R : 5-GGC AAG CCT ATA GCC GCA AT-3 ITS1-R1 : 5-AGC AAT AGT GCT TTA ACG CGC-3
- Mồi được thiết kế dựa trên cơ sở khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen quốc tế (Genbank) và kết quả sử dụng phần mềm chuyên dụng Blast để so sánh trình tự gen ITS1, 5.8S rRNA của Moniezia benedeni với trình tự gen ITS1, 5.8S rRNA của
Moniezia expansa có trình tự Nucleotide tương đồng 83%. Chúng tôi đã sử dụng
các đoạn Nucleotide giống hệt nhau để thiết kế mồi xuôi ( ITS1-F) và mồi ngược ( ITS1-R) để nhân đoạn trong gen. Ngoài ra, dựa vào đoạn trình tự Nucleotide khác biệt giữa hai loài để thiết kế mồi ngược đặc hiệu (ITS1-R1) dành riêng cho loài
Moniezia expansạ
2.3.8. Tối ưu hóa phản ứng PCR
Mẫu sau khi tiến hành tách chiết DNA được tiến hành chạy PCR để phân loàị Tiến hành pha mix R và R1 cho 11 mẫu:
• Pha R:
- Nước: 22,5 µl x 11 = 247,5 µl.
- Tag PCR Master Mix: 25 µl x 11 = 275 µl. - ITS1- F: 1 µl x 11 = 11 µl.
- ITS1- R: 1 µl x 11 = 11 µl. • Pha R1:
- Nước: 22,5 µl x 11 = 247,5 µl.
- Tag PCR Master Mix: 25 µl x 11 = 275 µl. - ITS1- F: 1 µl x 11 = 11 µl.
- ITS1- R: 1 µl x 11 = 11 µl. • Tối ưu hóa thể tích DNA mẫu:
Để xác định được nồng độ DNA tối ưu nhất khi chạy PCR chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các nồng độ DNA mẫu đã chiết tách theo bảng biến đổi dãy nông độ phản ứng sau:
Bảng 2.1. Biến đổi dãy nồng độ
Dãy nồng độ DNA mẫu
A B C D E F
Cho lần lượt 0,4 µl; 0,5µl; 0,6 µl; 0,7µl ; 0,8µl và 0,9µl DNA mẫu ở các dãy nồng độ như bảng 3.1 cho vào ống PCR (loại ống 0,2ml) tương ứng. Pha các thành phần phản ứng mix R và R1 rồi hút tương ứng 49,6µl; 49,5µl; 49,4µl; 49,3µl; 49,2µl và 49,1µl các thành phần phản ứng được pha trộn ở trên cho vào các ống PCR đã được cho DNA khuôn trước đấỵ Cho tất cả các ống PCR vào máy nhân gen và vận hành máỵ Sau đó chạy điện di, đọc kết quả trên máy và chọn nồng độ DNA mẫu có kết quả tốt nhất để dung cho phản ứng PCR phân loại sán dây Monieziạ
• Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi:
Cho lần lượt 0,5µl DNA mẫu cho vào ống PCR (loại ống 0,2ml) tương ứng, ống đối chứng âm cho nước free DNAse, RNAsẹ Pha các thành phần phản ứng mix R và R1 rồi hút 49,5µl các thành phần phản ứng được pha trộn ở trên cho vào các ống PCR đã được cho DNA khuôn trước đấỵ Cho tất cả các ống PCR vào máy nhân gen và vận hành máỵ Để xác định nhiệt độ gắn tối ưu của các cặp mồi ITS1-F, ITS1-R, ITS1-R1, chúng tôi thực hiện phản ứng gradient- PCR với dãy thay đổi nhiệt độ gắn của mồi từ 480C đến 560C (gradient temperature). Phản ứng được thực hiện thao chu trình nhiệt như sau:
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng gradient-PCR
1 chu kỳ Lặp lại 30 lần 48-560C 720C 95 0C 95 0C 720C 100C ∞ 10 phút 1 phút 1 phút 1 phút 1 phút
Bảng 2.2. Biến đổi dãy nhiệt độ Dãy nhiệt độ (0C) Mồi A B C D E (ITS1-F;ITS1-R) 48 50 52 54 56 (ITS1-F;ITS1-R1) 48 50 52 54 56 • Thành phần cho một phản ứng PCR (50 µl) gồm: - 0,5 µl mẫu DNA (khoảng 0,1-0,3 µg DNA/µl). - 49,5 µl R và R1 cho từng mẫụ
• Tiến hành bố trí sơ đồ mẫu như sau: tính từ trái qua phải
Nd1(R), Nd1(R1), Nd2(R), Nd2(R1), Nc1(R), Nc1(R1), Nc2(R), Nc2(R1), Nc3(R), Nc3(R1), Kb1(R), Kb1(R1), Kb2(R), Kb2(R1), Kb3(R), Kb3(R1), Kb4(R), Kb4(R1), Kb5(R), Kb5(R1).
• Sản phẩm sau khi chạy PCR được chạy điện di:
Chuẩn bị thạch agarose:
- Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lược vào khuôn.
- Pha TBE 1X: dùng cốc đong 100 ml TBE 10X pha với 900 ml nước cất. - Pha 130 ml gel agarose 2%: cân 2,6 g agarose cho vào bình thủy tinh và thêm 127,4 ml TBE 1X sau đó đun dưới lò vi sóng khoảng 1 phút 30 giây cho agarose tan hoàn toàn.
- Khi dung dịch gel agarose xuống khoảng 50 0C cho thêm 5,2 µl thuốc nhuộm ethyldiumbromidẹ
- Gài lược tạo giếng sau đó tiến hành đổ gel. Trong quá trình đổ gel chú tránh tạo bọt khí.
- Sau khi gel đông hoàn toàn thì rút lược và cho TBE 1X vào để bảo quản gel sau đó chạy điện dị
Nạp mẫu:
- Hút 1 µl loading buffer và 5 µl mẫu DNA sau khi đã chạy PCR tiến hành mix và sau đó tra mẫu vào giếng.
- Marker: hút 0,6 µl DNA lađer, thêm 4,5 µl nước tinh khiết và 1 µl loading buffer trộn đều sau đó tra vào giếng.
- Sơ đồ mẫu như sau: tính từ trái qua phải: Nd1(R), Nd1(R1), Nd2(R), Nd2(R1), Nc1(R), Nc1(R1), Nc2(R), Nc2(R1), Nc3(R), Nc3(R1), Kb1(R), Kb1(R1), Kb2(R), Kb2(R1), Kb3(R), Kb3(R1), Kb4(R), Kb4(R1), Kb5(R), Kb5(R1), Marker.
- Chạy điện di ở 110 - 115V trong thời gian 45 phút đến 1 giờ.
- Đọc kết quả bằng máy đọc và chụp ảnh gel (Model Bioprint-Vilber Lourmat).
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu về tỷ lệ nhiễm được tính bằng công thức sau: - Tỷ lệ nhiễm (%) = Số gia súc bị nhiễmSố gia súc điều tra x 100
Số liệu về tỷ lệ nhiễm sán dây ở các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái, tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ, tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo lứa tuổi được xử lí theo phương pháp thống kê sinh học. Kết quả được phân tích thống kê bằng phần mềm Excel 2003, sử dụng ANOVẠ Giá trị của P < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
CHƯƠNG IIỊ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÌNH HÌNH NHIỄM SÁN DÂY Ở GIA SÚC ĂN CỎ (BÒ, DÊ, CỪU) 3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và 3.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên
Tiến hành thu mẫu ở 286 gia súc tại Đắc Lắc, Ninh Thuận và Khánh Hòa để phân tích tình hình nhiễm sán dâỵKết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại ở các tỉnh
Tỉnh Số gia súc điều tra
(con) Số gia súc nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Đắc Lắc 82 11 13,41 Ninh Thuận 93 13 13,97 Khánh Hòa 111 17 15,31 Cộng 286 41 14,33 Hình 3.1. Trứng sán dây Moniezia sp
Tổng số gia súc được điều tra là 286 con, trong đó tỉnh Đắc Lắc là 82 con, Ninh Thuận là 93 con và Khánh Hòa là 111 con. Kết quả xét nghiệm các mẫu phân thu thập được ở các địa phương cho thấy tỷ lệ nhiễm sán dây ở các tỉnh Đắc Lắc, Ninh Thuận và Khánh Hòa lần lượt là 13,41%; 13,97%; 15,31% và tỷ lệ nhiễm chung cho 3 tỉnh là 14,33%. Như vậy tỷ lệ nhiễm sán dây ở gia súc nhai lại có sự khác nhau giữa các tỉnh, tuy nhiên sự khác nhau không rõ rệt và không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P > 0,05).
Theo chúng tôi thấy, Khánh Hòa và Ninh Thuận là 2 tỉnh thuộc duyên hải Nam Trung Bộ nên các điều kiện tự nhiên (địa hình, khí hậu…) và các điều kiện kinh tế xã hội tương đối gần giống nhaụ Khí hậu và địa hình tương đối giống nhau nên mức độ phát triển và mật độ vật chủ trung gian là nhện đất thuộc họ Oribatidae cũng ít có sự khác biệt. Đồng thời tập quán và phương thức chăn nuôi cũng có những nét tương đồng. Vì vậy, mức độ lưu hành sán dây trên gia súc nhai lại ít có sự khác biệt giữa 2 tỉnh.
3.1.2. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái
Kết quả xét nghiệm được trình bày ở bảng 3.2, cho thấy đối với bò tỷ lệ nhiễm sán dây ở vùng núi là 6,62% cao hơn so với vùng đồng bằng ven biển 3,70%. Đối với dê tỷ lệ nhiễm của vùng núi là 21,95% và ở đồng bằng là 20,00%. Như vậy tỷ lệ nhiễm sán dây ở vùng núi cao hơn vùng đồng bằng ven biển tuy nhiên sự khác biệt không có nghĩa thống kê (P > 0,05). Nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ gia súc nhai lại ở vùng núi có tỷ lệ nhiễm sán dây cao hơn so với vùng đồng bằng ven biển là do nhiều hộ chăn nuôi gia súc ở các tỉnh miền núi còn khó khăn về mặt kinh tế, vì vậy việc chăm sóc, nuôi dưỡng và phòng bệnh cho gia súc chưa tốt. Điều kiện chăn nuôi kém ảnh hưởng tới sức khỏe của súc vật và sự chống đỡ bệnh tật dẫn đến súc vật dễ nhiễm bệnh hơn.
Từ đó chúng tôi thấy rằng: các cơ sở chăn nuôi và các hộ chăn nuôi gia súc nhai lại cần làm tốt công tác chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh thú y để hạn chế tỷ lệ gia súc nhai lại nhiễm sán dâỵ Đồng thời, khi gia súc đã bị nhiễm sán dây cần phải được điều trị kịp thời và triệt để để bệnh có thể khỏi và không ảnh hưởng đến sự phát triển sau này của gia súc.
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái Bò Dê Cừu Vùng sinh thái ∑ ∑ ∑ ∑ (+) % ∑∑∑∑ (+) % ∑∑∑∑ (+) % Vùng núi 44 3 6,82 41 9 21,95 0 0 0 Đồng bằng ven biển 54 2 3,70 75 15 20,00 72 12 16,67
∑ = số gia súc điều tra, (+) = số gia súc nhiễm, % = tỷ lệ nhiễm
3.1.3. Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc
Trong tổng số 286 con gia súc được lấy mẫu điều tra thuộc 3 tỉnh Đắc Lắc, Khánh Hòa và Ninh Thuận thì số lượng bò là 98 con, dê là 116 con và cừu là 72 con. Kết quả xét nghiệm mẫu cho thấy bò nhiễm sán dây với tỷ lệ thấp nhất (5,10%), kế đến là cừu (16,67%) và cao nhất là dê (20,68%). Như vậy ở đây có sự khác biệt lớn về tình hình nhiễm sán dây giữa bò so với dê và cừu (P < 0,05). Trong khi đó sự khác nhau giữa tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê (20,68%) và cừu (16,67%) là không rõ rệt ( P > 0,05). Bò nhiễm sán dây với tỷ lệ thấp hơn dê và cừu có thể do đặc tính miễn dịch của từng loại khác nhau, do đó mức độ cảm nhiễm với sán dây khác nhaụ Kết quả điều tra xác định tình hình nhiễm sán dây ở từng loài gia súc nhai lại được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc
TT Loài gia súc Số gia súc điều tra (con) Số gia súc nhiễm
(con) Tỷ lệ nhiễm (%) 1 Bò 98 5 5,10 2 Dê 116 24 20,68 3 Cừu 72 12 16,67 Cộng 286 41 14,33
Kết quả điều tra của chúng tôi cho thấy tỷ lệ lưu hành sán dây ở bò nuôi tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên tương đương với vùng Sao Paulo của Brazin là 4,76% (Borges và cộng sự, 2003) và thấp hơn vùng Savanah của Pháp có
tỷ lệ nhiễm là 31% (Achi và cộng sự,2003). Tỷ lệ nhiễm ở dê tương đương với các nghiên cứu ở Miền Bắc Việt Nam là 20,40% (Nguyễn Thị Kim Lan và cộng sự, 1997; Phan Địch Lân và cộng sự, 1998); thấp hơn so với kết quả điều tra ở Nigeria là 31% và ở Ethiopia là 32,2% (Nwosuco và cộng sự 1996; Etana Debela, 2002). Đối với cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Earoanska và cộng sự (2005) tại Slovakia là 19,2% ; cao hơn kết quả nghiên cứu của chúng tôị
3.1.4. Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ
Cũng như các tỉnh Nam Trung Bộ khí hậu ở Khánh Hòa và Ninh Thuận được chia 2 mùa rõ rệt là mùa khô và mùa mưạ Để đánh giá xem tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại có sự khác nhau giữa các mùa hay không chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu ở các địa phương theo mùạ Tổng số mẫu lấy vào mùa khô là 161 mẫu, mùa mưa là 125 mẫụ Số mẫu phân của bò lấy vào mùa khô là 56 và mùa mưa là 42 mẫu, số mẫu phân dê lấy vào mùa khô là 64 mẫu và mùa mưa là 52 mẫu, số mẫu phân cừu lấy vào mùa khô là 41 mẫu và mùa mưa là 31 mẫụ Kết quả xét nghiệm mẫu của từng mùa được phản ánh ở bảng 4.4:
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ
Mùa khô Mùa mưa
TT Loài gia súc Số gia súc điều tra Số gia súc nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Số gia súc điều tra Số gia súc nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) 1 Bò 56 3 5,35 42 2 4,76 2 Dê 64 13 20,31 52 11 21,15 3 Cừu 41 6 14,63 31 6 19,35 Tổng cộng 161 22 13,66 125 19 15,20
Kết quả đánh giá ở bảng 3.4 cho thấy về mùa khô, số bò bị nhiễm sán dây là 3 con, tỷ lệ nhiễm là 5,35%; số dê bị nhiễm là 13 con, tỷ lệ nhiễm là 20,31%; số cừu