nghiên cứu biểu hiện gene at rich interaction domain (arid1b) trong u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE AT-RICH INTERACTION DOMAIN (ARID1B) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN VÕ VĂN THÀNH NIỆM Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE AT-RICH INTERACTION DOMAIN (ARID1B) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Võ Văn Thành Niệm Đại Học Y Dược TPHCM Bùi Chí Bảo Đại Học Y Dược TPHCM Lê Thị Kim Hòa Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM Trương Đinh Kiều Diễm Đại Học Y Dược TPHCM Đào Trọng Thức Đại học Quốc Tế Hồ Trần Bản Bệnh viện Nhi Đồng II Trương Đình Khải Bệnh viện Nhi Đồng II Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại Học Y Dược TPHCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng II MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 KẾT LUẬN 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALK Anaplastic Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase ARID1A/B AT-rich interactive domain 1A and B B2M Beta 2-microglobulin BAF BRG1-associated factor COG Children’s oncology Group GWAS Genome-wide association studies HRP Horseradish peroxidase INRGSS INRG staging system INSS International Neuroblastoma Staging System mRNA Messenger Ribonucleic acid MYCN V-Myc Avian Myelocytomatosis Oncogene Neuroblastoma Derived Homolog PBAF Polybromo BRG1-associated factor RNA Ribonucleic acid RT-PCR SWI/SNF U NBTK Viral Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction Sucrose non-fermenting/mating-type switching U nguyên bào thần kinh DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vị trí gene ARID1B nhiễm sắc thể số 10 Hình 2: Phức hợp SWI/SNF biến đổi cấu trúc chromatin điều hòa phiên mã 11 Hình 3: Phức hợp biến đổi chromatin SWI/SNF 12 Hình 4: Tỉ lệ sống sót nhóm bệnh nhân có họ gene ARID1 có đột biến không đột biến 14 Hình 5: Hình ảnh điện di RNA tổng số mẫu U NBTK M: thang kích thước (kb), mẫu đại diện NB30, NB40, NB55 thể tính nguyên vẹn kích thước RNA tổng số sau tách chiết 24 Hình 6: Biểu đồ Waterfall thể biểu mRNA gen ARID1B mức độ phiên mã 25 Hình 7: Mối tương quan biểu ARID1B mRNA đặc điểm lâm sàng 27 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Bảng 2: Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS Bảng 3: Lược đồ phân loại nhóm nguy U NBTK trước điều trị theo hệ thống INRGSS Bảng 4: Thành phần phản ứng tổng hợp Cdna 18 Bảng 5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 18 Bảng 6: Chương trình nhiệt tổng hợp cDNA 18 Bảng 7: Thành phần phản ứng real-time RT-PCR 19 Bảng 8: Thống kê yếu tố lâm sàng 21 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI U nguyên bào thần kinh (U NBTK) khối u rắn nằm hộp sọ ung thư phổ biến trẻ em Đây u ác tính hệ thần kinh giao cảm có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh thời kỳ phôi thai [1, 2] Khối u khởi phát mô hệ thần kinh giao cảm, điển hình vùng tủy thượng thận hạch cạnh cột sống, biểu tổn thương lớn vùng bụng (60%), sau ngực (15%), xương chậu (5%) chuỗi hạch giao cảm cổ tử cung (5%) [3] Tuổi tác,giai đoạn đặc điểm sinh học có vai trị quan trọng tiên lượng bệnh sử dụng để phân nhóm nguy điều trị bệnh Trẻ em mắc U NBTK thường điều trị đa mơ thức, kết hợp phẫu thuật, hóa xạ trị bệnh nhân nguy cao hỗ trợ điều trị chuyên sâu cấy ghép tế bào gốc Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót bệnh nhân nguy cao 50% điều trị liều cao U NBTK dạng u đặc ác tính phổ biến trẻ em với khoảng 90% trường hợp chuẩn đoán trước tuổi [4] Bệnh chiếm 20% loại ung thư phát thời kỳ mang thai, khoảng 8-10% trường hợp ung thư trẻ em nguyên nhân gây tử vong cho 15% ung thư trẻ em [2, 5] Bệnh xảy tuổi niên người lớn, khoảng 10% trường hợp chuẩn đoán sau 10 tuổi tỷ lệ mắc phải bệnh nhân độ tuổi 30-39 tuổi khoảng 0,2 trường hợp triệu người năm [6] Tỷ lệ mắc phải trẻ em nam cao so với nữ trẻ em da trắng cao đáng kể so với chủng tộc khác [7] Trên giới, U NBTK chiếm khoảng 7,8% ung thư trẻ em Mỹ có khoảng 650 trường hợp mắc năm Theo SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Report), tỷ lệ mắc phải xấp xỉ 9,5 trường hợp triệu trẻ em Các khảo sát U NBTK thực nước công nghiệp khác Tỷ lệ mắc U NBTK cao nước có thu nhập cao châu Âu, Bắc Mỹ thấp nước có thu nhập thấp Châu Phi, Châu Á Mỹ Latin Các nước Đông Á Nam Á Ấn Độ Trung Quốc có tỷ lệ mắc U NBTK thấp so với Nhật Bản [8] Hầu hết bệnh nhân U NBTK giai đoạn di thời điểm chẩn đốn nên có tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 60 trường hợp chẩn đốn mắc U NBTK bệnh viện Nhi Trung Ương [9] Theo ghi nhận bệnh viện Nhi Đồng từ năm 2005 đến 2010, U NBTK thường phát trễ khoảng 93% trường hợp giai đoạn thời điểm chẩn đốn tỷ lệ sống sót sau năm nhỏ 10% [10] Khoảng 70-80% bệnh nhân U NBTK phát giai đoạn di căn, thường di đến quan hạch bạch huyết, gan, xương, tủy xương da Não phổi hai quan gặp khối u di nhiều bệnh nhân nguy cao chữa trị tái phát thường phát có di vị trí Các biểu triệu chứng lâm sàng có liên quan đến vị trí khối u ngun phát tiến triển bệnh Đối với U NBTK vùng bụng (30%), bệnh nhân có triệu chứng căng bụng, sưng, đau chí tắc nghẽn đường ruột Trong trường hợp khối u chèn ép mạch máu thận, bệnh nhân thường tăng huyết áp Bệnh di có triệu chứng liên quan đến vị trí khác đau cục bộ, bị đau, sưng bầm quanh hốc mắt khối u di đến xương quanh mắt mô mềm Nhiều bệnh nhân bỏ ăn, giảm cân, suy nhược, đau xương tiêu chảy mạn tính Các khối u xuất phát từ các hạch giao cảm cạnh cột sống tăng trưởng qua lỗ xương sống vào ống tủy làm chèn ép dây thần kinh cột sống, gây triệu chứng liên quan đến thần kinh yếu ớt, khập khiễng, tê liệt bàng quang ruột chức Khi khối u di đến cổ, chúng gây hội chứng Horner (sa mí mắt, co đồng tử, lõm mắt) Trẻ sơ sinh mắc U NBTK thuộc giai đoạn 4S (theo INSS) thường có bụng sưng lên khối u di đến gan; cục bướu nhỏ xuất da da đổi màu Ngược lại, bệnh nhân mắc U NBTK giai đoạn khu trú thường khơng có biểu triệu chứng Khoảng 90% trường hợp U NBTK, tế bào khối u sản xuất kích thích tố catecholamine cao, cụ thể homovanillic acid (HVA) vanillylmandelic acid (VMA) nước tiểu Tỷ lệ HVA:VMA cao khối u khơng biệt hóa, tiên lượng xấu; ngược lại hàm lượng VMA cao khối u biệt hóa tiến triển [11, 12] Tùy thuộc vào vị trí khối u yếu tố khác, bác sĩ sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để chẩn đốn U NBTK Thơng thường, xét nghiệm chẩn đốn hình ảnh chụp X-Quang, chụp cắt lớp vi tính (CT – Computerized Axial Tomography), chụp cắt lớp xạ positron (PET-Positron Emission Tomography) chụp cộng hưởng từ (MRI – magnetic Resonance Imaging) thường sử dụng để xác định ví trí khối u, vùng di Ngồi cịn sử dụng chất hóa học có gắn phóng xạ metaiodobenzylguanidine (MIBG – radioiodine-labeled metaiodobenzylguanidine) có chứa lượng nhỏ i-ốt phóng xạ MIBG tương tự norepinephrine, hormone sản xuất tế bào thần kinh giao cảm Chất tiêm vào tĩnh mạch, vận chuyển máu gắn vào tế bào U NBTK Khối u tăng hấp thu MIBG phát máy quét chất phóng xạ Chất cịn sử dụng biện pháp điều trị [12, 13] Phân chia giai đoạn U NBTK q trình có nhiều tranh luận, có hai hệ thống phân giai đoạn U NBTK Đầu tiên, hệ thống phân giai đoạn U NBTK quốc tế (International Neuroblastoma Staging System - INSS) phát triển vào năm 1971 dựa chẩn đốn hình ảnh sử dụng Nhóm Nghiên Cứu Ung Thư trẻ em (Children’s Cancer Study Group) INSS chia làm giai đoạn: 1, 2, 3, 4S Năm 1993, hệ thống phân loại điều chỉnh thành nhóm dựa theo phẫu thuật cắt bỏ khối u tình trạng lan rộng khối u, bao gồm: giai đoạn 1, 2A, 2B, 3, 4S (10.1200/JCO.1993.11.8.1466) Chữ “S” nghĩa đặc biệt (special) 4S bệnh lây lan với vị trí di xác định gan, tủy xương, da trẻ 12 tháng tuổi Đây hệ thông phân loại FDA chấp nhận sử dụng rộng rãi giới Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS điều chỉnh (Brodeur, 1993) Giai đoạn Đặc điểm Khối u khu trú loại bỏ hoàn toàn phẫu thuật, có khơng có dư lượng khối u kính hiển vi; hạch lympho khơng chứa tế bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần kinh Khối u khu trú bên thể, tất 2A khối u nhìn thấy bị loại bỏ phẫu thuật Hạch lympho không chứa tế bào khối u hạch khối u có chứa nguyên bào thần kinh 2B Khối u nằm bên thể có khơng thể bị loại bỏ hoàn toàn phẫu thuật Gần hạch lympho ngồi khối u có chứa ngun bào thần kinh ung thư khơng lan đến hạch lympho phía bên thể nơi Khối u chưa di xa có số đặc điểm sau: - Khối u khơng thể loại bỏ hồn tồn phẫu thuật lan sang phía bên thể Nó khơng thể lan đến hạch lympho gần - Khối u khu trú vị trí nguyên phát nằm bên thể Nó bắt đầu lan sang hạch lympho gần khơng nằm phía bên khác thể - Khối u nằm thể phát triển lan sang hai bên loại bỏ hoàn toàn phẫu thuật Khối u lan sang vị trí xa hạch lympho xa, xương, gan, da, tủy xương, quan khác Trẻ tuổi Khối u nằm bên thể Nó lây lan sang hạch lympho phía thể khơng 4S (“special” lan sang hạch lympho phía khác U NBTK di sang gan, neuroblastoma) da, và/hoặc tủy xương Tuy nhiên, không 10% tế bào tủy xương ung thư, chuẩn đốn hình ảnh MIBG scan khơng cho thấy ung thư lan sang xương tủy xương Vì giai đoạn khối u khu trú phân loại dựa vào mức độ phẫu thuật cắt bỏ khối u nên hệ thống phân loại không phù hợp với hệ thống phân nhóm nguy U NBTK quốc tế (International Neuroblastoma Risk Group – INRG) tiền điều trị Mặc dù nhiều nước giới chấp nhận INSS có nhiều khó khăn phải đối mặt như: khối u khó phân loại dựa vào phạm vi phẫu thuật, việc so sánh thử nghiệm lâm sàng dựa vào INSS khó khăn, bệnh nhân có khối u khu trú dự đốn có suy thối khối u không phân giai đoạn dựa vào tiêu chí INSS Nhận nhiều giới hạn INSS, chuyên gia từ nước Úc, Trung Quốc, châu ÂU, Nhật Bắc Mỹ phát triển hệ thống phân loại dựa INRG (INRG staging system – INRGSS) dựa tiêu chí lâm sàng yếu tố nguy xác định hình ảnh (image-defined risk factors –IDRF) Các giai đoạn theo INRGSS sau: 13 Ly tâm khô với tốc độ tối đa phút Chuyển cột lọc vào ống 1.5ml khơng RNase Bước thu nhận mRNA 14 Thêm 30µl nước không RNase vào màng lọc 15 Ly tâm lạnh với tốc độ 10 000 rpm phút Bỏ cột lọc, đậy nắp ống 1,5 ml ghi lên ống 16 Bảo quản RNA ly trích -800C Kiểm tra số lượng chất lượng RNA tổng số RNA tổng số sau tách chiết đo nồng độ máy đo quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) bước sóng 260nm Kiểm tra độ tinh RNA dựa tỷ lệ OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1.8 – 2.0 Song song với đo nồng độ RNA, RNA điện di gel agarose sau: RNA pha trộn với formamide với tỷ lệ RNA: formamide : 3, hỗn hợp trộn với dung dịch nạp mẫu GelRed (Công ty Nam Khoa) Sau đó, hỗn hợp gia nhiệt 65oC để biến tính RNA; sau phút chuyển hỗn hợp lên đá ủ phút Hút toàn hỗn hợp nạp vào giếng gel agaroase 1.2 %, điện di với điện 100V, 30 phút Băng điện di quan sát soi gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ) Tổng hợp cDNA Tổng hợp cDNA từ mRNA bước việc định lượng biểu gen RT-PCR Chất lượng cDNA trực tiếp phụ thuộc vào chất lượng RNA Do nồng độ RNA cần xác định trước sử dụng cho phản ứng phiên mã ngược Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Nhật Bản) theo bước sau: Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp Bảng 4: Thành phần phản ứng tổng hợp Cdna Thành phần Thể tích Random mers (50 μM) µl dNTP Mixture (10 mM cho loại) µl RNA khn (< 1µg) H2O khơng có RNase Bổ sung cho đủ 10 µl Tổng thể tích 10 µl Bước 2: Ủ hỗn hợp 65oC phút, sau đặt lên đá Bước 3: Chuẩn bị phản ứng với tổng thể tích 20 µl Bảng 5: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA Thành phần Thể tích Hỗn hợp từ bước 10 µl X PrimeScript Buffer µl RNase Inhibitor (40 U/ μl) 0.5 µl (20 unit) PrimeScript RTase (200 U/ μl) µl (200 unit) H2O khơng có RNase Bổ sung cho đủ 10 µl Tổng thể tích 10 µl Sau hịa trộn nhẹ nhàng Bước 4: Chạy phản ứng với điều kiện sau: Bảng 6: Chương trình nhiệt tổng hợp cDNA Nhiệt độ Thời gian 30oC 10 phút 50oC 30 phút 70oC 15 phút Sau chạy xong phản ứng phiên mã ngược, cDNA bảo quản -20oC Real-time RT PCR cDNA sau tổng hợp sử dụng để thực phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) Kit chạy phản ứng máy MasterCycler® RealPlex (Eppendorf, Đức) Mồi dùng để khuếch đại trình tự gen ARID1A bảng 3-1 Beta 2-microglobulin (B2M ) sử dụng làm đối chứng nội Mẫu đối chứng dương cDNA từ mô hạch đốt sống lưng (human dorsal root ganglion) người bình thường (Clontech, Mỹ) Phản ứng thực với thành phần sau: Bảng 7: Thành phần phản ứng real-time RT-PCR Thành phần SYBRPremix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X) Thể tích 10 µl Mồi xi (5µM) 0.8 µl Mồi ngược (5µM) 0.8 µl cDNA (50ng) µl Nước cất vơ trùng 6.4 µl Tổng 20 µl Khuếch đại trình tự gen theo chương trình luân nhiệt: biến tính phút 95oC, sau chạy 40 chu kỳ với biến tính giây 95oC bắt cặp/kéo dài vòng 30 giây 58oC Sau lần chạy xác định độ đặc hiệu mồi phản ứng phân tích nhiệt độ tách mạch Định lượng biểu mRNA Có hai phương pháp định lượng khác Real-time RT-PCR: định lượng tuyệt đối định lượng tương đối Định lượng tuyệt đối xác định số lượng phiên mã mục tiêu đưa vào mối tương quan tín hiệu huỳnh quang với đường chuẩn Trong đó, định lượng tương đối đo lường thay đổi tương đối mức độ biểu mRNA hay thể mối quan hệ tăng giảm số lượng mẫu thử nghiệm so với mẫu đối chứng Định lượng tương đối khơng cần định lượng gen mục tiêu mà cịn cần có mặt gen “giữ nhà” (housekeeping gene), tức gene biểu ổn định hầu hết tế bào, giai đoạn phát triển, khơng bị ảnh hưởng việc xử lý thí nghiệm nhằm loại trừ thay đổi khác lượng RNA đưa vào hiệu phiên mã ngược Trong số trường hợp, không cần thiết phải xác định số lượng tuyệt đối, cần báo cáo thay đổi tương đối biểu gen đủ Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp định lượng tương đối để đánh giá biểu gen ARID1A U NBTK Để so sánh biểu mRNA gen ARID1A so với mẫu đối chứng, sử dụng công thức tính tốn biểu gen đơn chuẩn hóa Livak: Mức độ thay đổi biểu gen = 2-∆∆Ct ∆∆𝐶𝑡 = (𝐶𝑡𝐴𝑅𝐼𝐷1𝐴 − 𝐶𝑡𝐵2𝑀 )𝑚ẫ𝑢 𝑈𝑁𝐵𝑇𝐾 − (𝐶𝑡𝐴𝑅𝐼𝐷1𝐴 − 𝐶𝑡𝐵2𝑀 )𝑚ẫ𝑢 𝑐ℎứ𝑛𝑔 Trong đó, Ct chu kỳ ngưỡng B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ: Đặc điểm lâm sàng mẫu U NBTK Trong nghiên cứu này, tiến hành thu thập khối u sinh thiết từ bệnh nhi U NBTK bệnh viện Nhi Đồng thời gian 27 tháng, từ 05/2014 đến 08/20116 Kết thu 45 mẫu khối u từ 45 bệnh nhân U NBTK khác có ghi nhận đặc điểm lâm sàng sau: giới tính, độ tuổi, giai đoạn bệnh khuếch đại gen MYCN (Bảng 8) Trong 45 mẫu chọn lọc để tiến hành nghiên cứu, có 66,67% (30/45) nam 33,33% (15/45) nữ Bệnh nhân UNBTK có độ tuổi từ đến 168 tháng trung bình 38 tháng, 24,44% (11/45) 18 tháng 75,56% (34/45) từ 18 tháng trở lên Giai đoạn phân theo hệ thống INRGSS bao gồm: giai đoạn L1: 8,89% ( 4/45), L2: 13,33% (6/45); M: 33,33% (15/45); MS: (4,45%) có 40% (18/45) chưa xác định giai đoạn Có khoảng 38 mẫu (84,44%) không khuếch đại MYCN mẫu (15,56%) có MYCN khuếch đại Bảng 8: Thống kê yếu tố lâm sàng STT Mẫu Giới tính Tuổi NB 18 M NB 30 Giai đoạn Tình INSS MYCN 36 L2 - M 36 M - NB 37 M 60 M - NB 40 F L1 - NB 43 M 24 M + NB 48 M 36 M - NB 49 M 24 M + NB 51 F 132 M - NB 52 F 72 M - trạng 10 NB 53 M 36 M - 11 NB 55 M 12 MS - 12 NB 59 M MS + 13 NB 60 M 72 L2 - 14 NB 62 M 24 L1 - 15 NB 63 M 36 L2 - 16 NB 64 M 168 L2 - 17 NB 65 M 144 M - 18 NB 67 M 48 M - 19 NB 68 M 24 M - 20 NB 70 F 12 L2 - 21 NB 71 F 36 M - 22 NB 72 M 48 M - 23 NB 73 M 48 L1 - 24 NB 74 F 24 L1 - 25 NB 76 M 24 M - 26 NB 78 F 24 M - 27 NB 79 M 24 L2 + 28 NB 80 F 36 L1 - 29 NB 81 M 12 L1 - 30 NB 83 M M - 31 NB 84 M 36 L2 - 32 NB 85 M 15 M + 33 NB 88 F 12 M + 34 NB 89 M 12 L2 - 35 NB 91 M L1 - 36 NB 92 M 24 L2 - 37 NB 93 F 36 M - 38 NB 94 F 24 M - 39 NB 96 M 48 M + 40 NB 97 F 48 L2 - 41 NB 98 M 48 M - 42 NB 99 F 24 M - 43 NB 100 F 60 M - 44 NB 102 M 36 L2 - 45 NB 103 F MS - Tách chiết, đánh giá số lượng chất lượng RNA tổng số Tất mẫu mô tươi mô đông lạnh bệnh nhân U NBTK tách chiết RNA tổng số RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Đức) có độ tinh cao với OD260nm/280nm nằm khoảng 1,77 – 2,1 A260nm/230nm > 1,7 Hàm lượng RNA tổng số trung bình mẫu U NBTK 128,82 ng/µl Cùng với đo nồng độ RNA, sản phẩm tiến hành điện di gel agarose để đánh giá sơ chất lượng RNA sau tách chiết trước tổng hợp cDNA (Hình 3) Tính ngun vẹn RNA đánh giá dựa vào kích thước độ sáng băng điện di gel Ở tế bào động vật có vú nói chung người nói riêng, hai băng điện di gel agarose đại diện cho hai tiểu phần ribosome RNA (rRNA) 28S 18S với kích thước khoảng 5kb 1,9kb Kết điện di Hình cho thấy mẫu RNA tách chiết phân làm băng rõ rệt khoảng kích thước 5kp 1,9 kp có vệt sáng đứt gãy lượng nhỏ RNA Ngồi ra, quan sát hình điện di thấy có băng sáng kích thước 5kp sản phẩm RNA lẫn lượng DNA Tuy nhiên, việc thiết kế mồi bắt đặc hiệu mRNA gen ARID1B không bắt DNA nên đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng PCR Hình 5: Hình ảnh điện di RNA tổng số mẫu U NBTK M: thang kích thước (kb), mẫu đại diện NB30, NB40, NB55 thể tính nguyên vẹn kích thước RNA tổng số sau tách chiết Biểu mRNA gen ARID1B Trước tiến hành khuếch đại mRNA gen ARID1B, mồi phát mRNA gen ARID1B tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp với cặp mồi bắt mRNA gen giữ nhà B2M nhiệt độ 52oC, 54oC, 56oC, 58oC 60oC Nhiệt độ lai tối ưu hai cặp mồi 58oC phản ứng Real time RT-PCR có sản phẩm đặc hiệu xuất đỉnh chảy phản ứng khuếch đại cDNA gen ARID1B B2M, nhiệt độ khoảng 85oC 82oC Sản phẩm khuếch đại điện di giải trình tự Sanger Kết giải trình đoạn gen khuếch đại với trình tự kích thước với trình tự tham khảo Chính vậy, chúng tơi tiến hành phản ứng với cặp mồi gen ARID1Bvà B2M mẫu U NBTK mẫu đối chứng Hình 6: Biểu đồ Waterfall thể biểu mRNA gen ARID1B mức độ phiên mã Mức độ biểu mRNA 45 mẫu U NBTK phân tích dựa phương pháp ∆∆Ct Mỗi côt biểu thị giá trị 2- ∆∆Ct biểu ARID1A mô U NBTK mơ bình thường, cột màu đỏ: mẫu biểu mRNA cao, cột màu xanh lá: mẫu hiện mRNA thấp, cột màu xanh dương: mẫu không hiện mRNA Sự biểu mRNA gen ARID1B mơ U NBTK so với mơ bình thường phân tích dựa phương pháp 2-∆∆Ct Livak Giá trị 2-∆∆Ct lớn nghĩa mRNA gen ARID1B U NBTK cao so với mơ bình thường ngược lại, giá trị nhỏ biểu thấp Kết đánh giá biểu mRNA ARID1A mẫu U NBTK trình bày Hình Trên 45 mẫu UNBTK (thí nghiệm lặp lại lần) để đánh giá biểu mRNA gen ARID1B so với mẫu đối chứng thông qua phương pháp 2-Ct, kết cho thấy có 19 mẫu UNBTK (42,22%) biểu thấp mRNA gen ARID1B 21 mẫu UNBTK (46,67%) biểu mRNA ARID1B cao so với mẫu bình thường mẫu (11,11%) có giảm biểu protein ARID1B (Hình 4) Mối tương quan biểu gen ARID1B với yếu tố tiên lượng lâm sàng Để tìm hiểu mối tương quan biểu mRNA gen ARID1B với đặc điểm lâm sàng giới tính, độ tuổi, giai đoạn bệnh khuếch đại gen MYCN, chúng tơi tiến hành phân tích giá trị biểu ARID1B mRNA với yếu tố lâm sàng kiểm định Student’s ttest Theo hệ thống phân loại nhóm nguy INRG, yếu tố lâm sàng độ tuổi, giai đoạn có vai trị quan trọng tiên lượng bệnh U NBTK Những bệnh nhi nhỏ 18 tháng tuổi có tiên lượng tốt thời gian sống lâu so với bệnh nhi lớn 18 tháng tuổi nên phân chia làm hai quần thể U NBTK nhỏ 18 tháng 24,44% (11/45) 75,56% (34/45) từ 18 tháng trở lên để đánh giá mối liên hệ biểu gen ARID1B với độ tuổi Kết cho thấy khơng có khác biệt nhóm bệnh nhân lớn 18 tháng nhỏ 18 tháng Về giai đoạn bệnh, chúng tơi phân chia giai đoạn thành hai nhóm nhóm bệnh nhân thuộc giai đoạn L1, L2 MS thường có tiên lượng tốt bệnh nhân giai đoạn có khối u chưa di xa (giai đoạn L1/2) có khả tự suy thối (giai đoạn MS), chiếm 46,67% (24/45 mẫu); nhóm bệnh nhân thuộc giai đoạn M có tiên lượng xấu khối u di xa, chiếm 53,33% (21/45 mẫu) Kết cho thấy khơng có khác biệt nhóm nguy cao nhóm nguy thấp Ngồi giới tính nam nữ đánh giá mối tương quan với biểu gen ARID1B Kết cho thấy khơng có mối liên quan biểu mRNA ARID1B nhóm bệnh nhân nam nữ Hình 7: Mối tương quan biểu ARID1B mRNA đặc điểm lâm sàng (A) độ tuổi (< 18 tháng ≥ 18 tháng), (B) Giai đoạn theo hệ thống phân loại INRGSS (L1, L2, M MS), (C) giới tính (nam nữ) (D) Có khơng có khuếch đại gen MYCN (thống kê Student’s t-test ns: non-significant – khơng có ý nghĩa thống kê) Ngoài yếu tố lâm sàng, khuếch đại gen MYCN đánh giá thời điểm chẩn đoán xem yếu tố tiên lượng độc lập U NBTK Những mẫu U NBTK có khuếch đại gen MYCN xếp vào nhóm nguy cao với tỷ lệ sống sót 50% độ tuổi giai đoạn bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân tích mối tương quan biểu mRNA ARID1B với khuếch đại MYCN kiểm định Student’s t-test Kết cho thấy khơng có mối tương quan biểu mRNA ARID1B với khuếch đại MYCN Cụ thể, biểu mRNA ARID1B khơng có khác biệt nhóm khuếch đại MYCN (38/45 mẫu; 84,44%) không khuếch đại MYCN (7/45 mẫu; 15,56%) BÀN LUẬN: UNBTK dạng u đặc ác tính phổ biến trẻ em Trong UNBTK, yếu tố mô học, tuổi, giai đoạn, biến đổi NST khuếch đại MYCN yếu tố tiên lượng quan trọng để phân loại nhóm nguy đánh giá điều trị UNBTK Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót nhóm nguy cao thấp, khoảng 50% (8, 4) Do đó, cần nhiều nổ lực nghiên cứu khơng yếu tố lâm sàng mà yếu tố sinh học phân tử để dự đoán kết tiên lượng xác cho bệnh nhân UNBTK Trong nghiên cứu này, lần chúng tơi phân tích biểu gen ARID1B mức độ phiên mã dịch mã nhóm bệnh nhân UNBTK Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu quốc tế nước công bố khía cạnh Với kỹ thuật RT-qPCR cổ điển, nhận thấy ARID1B mRNA biểu cao đa số mẫu UNBTK (46,67%) chưa tìm thấy tương quan biểu mRNA ARID1B yếu tố lâm sàng khác Nhiều nghiên cứu cho thấy phức hợp phiên mã bao gồm ARID1A ARID1B quan trọng chu kỳ tăng trưởng tế bào thông qua việc hòa biểu gen MYC[21] kết nghiên cứu lại chưa tìm thấy mối tương quan biểu ARID1B khuếch đại MYCN Vì cần tiến hành thêm nghiên cứu khác tương tác điều hịa biểu MYCN ARID1B có MYCN yếu tố quang trọng điều trị U nguyên bào thần kinh Một phân tích cho thấy đột biến đoạn tồn trình tự mã hóa ARIDB làm tăng khác biệt khả sống cịn bệnh nhân có đột biến ARID1B / A bệnh nhân không đột biến (tỷ số nguy cơ, HR 6.41, khoảng tin cậy 95%, CI 1.93-21.25, P = 0.0024, log-rank test) Tỷ lệ sống trung bình bệnh nhân có ARID1 đột biến thấp so với thay đổi di truyền khác đánh giá, bao gồm khuếch đại MYCN cho thấy ARID1B nguyên nhân dẫn đến thất bại điều trị sụ tái phát bệnh nhân[4] KẾT LUẬN ARID1B mã hóa protein ARID1B, tiểu phần phức hợp SWI/SNF có vai trị liên kết với DNA điều hòa biểu gen tham gia điều hịa q trình sửa sai DNA, tăng sinh biệt hóa tế bào nghiên cứu đánh giá biểu gen UNBTK Kết cho thấy gen ARID1B biểu cao mức độ phiên mã hầu hết khối u, cụ thể có 19 mẫu UNBTK (42,22%) biểu thấp mRNA gen ARID1B 21 mẫu UNBTK (46,67%) biểu mRNA ARID1B cao so với mẫu bình thường mẫu (11,11%) có giảm biểu ARID1B Ngồi ra, có khơng có mối liên hệ biểu gen ARID1B với độ tuổi, giới tính, giai đoạn khuếch đại gen MYCN Mặc dù nghiên cứu đạt kết định đánh giá biểu gen ARID1B nhóm bệnh nhân U NBTK cịn số hạn chế mang tính khách quan Trong nghiên cứu, thiếu thông tin giai đoạn mẫu nên số lượng mẫu đựa đưa vào đánh giá mối tương thấp Hơn nữa, nhóm mẫu thuộc yếu tố lâm sàng khách chưa cân đối mặt số lượng nên có khả dẫn đến đánh giá mối tương quan biểu mRNA ARID1B với đặc điểm lâm sàng khuếch đại MYCN mang tính tương đối Nghiên cứu hạn chế số lượng mẫu U NBTK để khảo sát biểu Chưa thể so sánh biểu protein với mRNA gen ARID1B để đến đánh giá mối liên hệ biểu protein ARID1B với yếu tố lâm sàng Nhận khuyết điểm nghiên cứu mình, chúng tơi có vài kiến nghị để cải thiện độ tin cậy đề tài phát triển rộng để có sở liệu tồn diện vai trò ARID1B U NBTK, cụ thể sau: - Thu thập đầy đủ thông tin yếu tố lâm sàng bệnh nhân theo dõi sống sót bệnh nhân - Đánh giá biểu protein ARID1B mối liên hệ biểu ARID1B với đặc điểm lâm sàng - Nghiên cứu vai trò hoạt động ARID1B biệt hóa tăng sinh U NBTK TÀI LIỆU THAM KHẢO: Bosse, K R., & Maris, J M (2015) Advances in the translational genomics of neuroblastoma: From improving risk stratification and revealing novel biology to identifying actionable genomic alterations Cancer doi: 10.1002/cncr.29706 Cohn, S L., Pearson, A D., London, W B., Monclair, T., Ambros, P F., Brodeur, G M., Force, I T (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 27(2), 289-297 doi: 10.1200/JCO.2008.16.6785 Esiashvili, N., Anderson, C., & Katzenstein, H M (2009) Neuroblastoma Curr Probl Cancer, 33(6), 333-360 doi: 10.1016/j.currproblcancer.2009.12.001 Esiashvili, N., Goodman, M., Ward, K., Marcus, R B., Jr., & Johnstone, P A (2007) Neuroblastoma in adults: Incidence and survival analysis based on SEER data Pediatr Blood Cancer, 49(1), 41-46 doi: 10.1002/pbc.20859 Fujimoto, A., Totoki, Y., Abe, T., Boroevich, K A., Hosoda, F., Nguyen, H H., Nakagawa, H (2012) Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators Nat Genet, 44(7), 760-764 doi: 10.1038/ng.2291 Ho, L., & Crabtree, G R (2010) Chromatin remodelling during development Nature, 463(7280), 474-484 doi: 10.1038/nature08911 Irwin, M S., & Park, J R (2015) Neuroblastoma: paradigm for precision medicine Pediatr Clin North Am, 62(1), 225-256 doi: 10.1016/j.pcl.2014.09.015 Jones, D T., Jager, N., Kool, M., Zichner, T., Hutter, B., Sultan, M., Lichter, P (2012) Dissecting the genomic complexity underlying medulloblastoma Nature, 488(7409), 100-105 doi: 10.1038/nature11284 Jones, S., Wang, T L., Shih Ie, M., Mao, T L., Nakayama, K., Roden, R., Papadopoulos, N (2010) Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma Science, 330(6001), 228-231 doi: 10.1126/science.1196333 10 Maris, J M (2010) Recent advances in neuroblastoma N Engl J Med, 362(23), 22022211 doi: 10.1056/NEJMra0804577 11 Nagl, N G., Jr., Zweitzig, D R., Thimmapaya, B., Beck, G R., Jr., & Moran, E (2006) The c-myc gene is a direct target of mammalian SWI/SNF-related complexes during differentiation-associated cell cycle arrest Cancer Res, 66(3), 1289-1293 doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-3427 12 Sausen, M., Leary, R J., Jones, S., Wu, J., Reynolds, C P., Liu, X., Hogarty, M D (2013) Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma Nat Genet, 45(1), 12-17 doi: 10.1038/ng.2493 13 Schleiermacher, G., Janoueix-Lerosey, I., & Delattre, O (2014) Recent insights into the biology of neuroblastoma Int J Cancer, 135(10), 2249-2261 doi: 10.1002/ijc.29077 14 Selcukbiricik, F., Tural, D., Esatoglu, N., Kocak, S., & Mandel, N M (2011) A very rare adult case with neuroblastoma Case Rep Oncol, 4(3), 481-486 doi: 10.1159/000332761 15 Sharp, S E., Gelfand, M J., & Shulkin, B L (2011) Pediatrics: diagnosis of neuroblastoma Semin Nucl Med, 41(5), 345-353 doi: 10.1053/j.semnuclmed.2011.05.001 16 Stephens, P J., Tarpey, P S., Davies, H., Van Loo, P., Greenman, C., Wedge, D C., Stratton, M R (2012) The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer Nature, 486(7403), 400-404 doi: 10.1038/nature11017 17 Stiller, C A., & Parkin, D M (1992) International variations in the incidence of neuroblastoma Int J Cancer, 52(4), 538-543 18 T.B.V.Ho, T N T D K., Vietname surveillence of Neuroblastoma 2005 - 2010 (2011) Vietnamese medicine and pharmacy journal(235), 45-50 19 Tran, M T., Baglin, J., Tran, T T., Hoang, K T., Phung, L T., Read, A., & Greaves, R F (2014) Development of a new biochemical test to diagnose and monitor neuroblastoma in Vietnam: homovanillic and vanillylmandelic acid by gas chromatography-mass spectrometry Clin Biochem, 47(3), 206-215 doi: 10.1016/j.clinbiochem.2013.11.016 20 Vũ Đình Quang, N X H., Nguyễn Thị Phương Mai,, Phùng Tuyết Lan, T Đ H., Trần Ngọc Sơn, Hoàng Ngọc Thạch, Bùi Khắc Hiếu,, & Ngô Diễm Ngọc, N T L (2013) Đánh giá khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh Nhi Khoa, (1), 68-67 21 Wang, X., Nagl, N G., Wilsker, D., Van Scoy, M., Pacchione, S., Yaciuk, P., Moran, E (2004) Two related ARID family proteins are alternative subunits of human SWI/SNF complexes Biochem J, 383(Pt 2), 319-325 doi: 10.1042/BJ20040524 ... 4s khuếch đại gen MYCN nghiên c? ?u bệnh nhân U NBTK trước Số lượng m? ?u nghiên c? ?u: 45m? ?u khối u Phương pháp nghiên c? ?u Thu nhận m? ?u khối u M? ?u mô thu nhận bệnh viện Nhi Đồng II Mô sau ph? ?u thuật... xác định gene khối u ức chế[20] Sausen cộng thấy bi? ?u cao gene thành viên phức hợp BAF tế bào tiền thân nơron thần kinh tương quan với ki? ?u hình U nguyên bào thần kinh nguy cao bi? ?u cao gene phức... TRƯỜNG NGHIÊN C? ?U BI? ?U HIỆN GENE AT- RICH INTERACTION DOMAIN (ARID1B) TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN