Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh

Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyê

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

VŨ ĐÌNH QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG,

ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Vũ Đình Quang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG,

ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN

U NGUYÊN BÀO THẦN KINH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62420121

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

2 TS BS Phùng Tuyết Lan

Hà Nội - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là: Vũ Đình Quang, nghiên cứu sinh khóa 2013-2018, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân và TS Phùng Tuyết Lan

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019

NGƯỜI CAM ĐOAN

VŨ ĐÌNH QUANG

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân và TS BS Phùng Tuyết Lan, hai người thầy khoa học đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt 5 năm thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả bệnh nhân và gia đình bệnh nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu này Chính sự đau đớn, mất mát của các em là động lực thôi thúc tôi hoàn thiện nghiên cứu này, cho các em và cho

cả những bệnh nhân sau các em nữa

Tôi xin được cảm ơn tất cả đồng nghiệp ở khoa Di truyền và Sinh học Phân tử, ngôi nhà thứ hai của tôi, đã luôn ở bên tôi những lúc vui, lúc buồn, khi thành công hay khi thất bại

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo và cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn đến các anh chị, bạn bè đồng nghiệp trong bệnh viện Nhi Trung ương và bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec đã cùng tôi đạt được sản phẩm khoa học ngày hôm nay

Tôi xin cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn ở bên tôi

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình của mình, tới bố, tới người mẹ đã khuất, tới người bạn đời yêu thương và hai con của tôi với những

lo lắng, chăm sóc, sẻ chia và tình yêu lớn lao dành cho tôi

Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019

Vũ Đình Quang

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 11

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 Khái quát về u nguyên bào thần kinh 15

1.1.1 Tỷ lệ mắc 15

1.1.2 Nguyên nhân hình thành khối u nguyên bào thần kinh 15

1.1.3 Phôi thai học u nguyên bào thần kinh 16

1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh 18

1.2 Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng u nguyên bào thần kinh 20

1.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh 20

1.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh 26

1.3 Các đặc điểm di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 27

1.3.1 Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể 27

1.3.2 Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể 28

1.3.3 Khuếch đại gen MYCN 30

1.3.4 Sự biến đổi biểu hiện gen trong bệnh u nguyên bào thần kinh 36

1.3.5 U nguyên bào thần kinh di truyền 39

1.3.6 Mô hình biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 40

1.4 Các kỹ thuật di truyền sử dụng để phát hiện các biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 43

1.4.1 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 43

1.4.2 Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối 46

1.4.3 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen 49

1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh u NBTK ở Việt Nam 52

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55

2.1 Đối tượng nghiên cứu 55

2

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 55

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 55

2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 55

2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 56

2.1.5 Cỡ mẫu: 56

2.1.6 Thiết kế nghiên cứu 57

2.2 Phương pháp nghiên cứu 57

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm 57

2.2.2 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 58

2.2.3 Kỹ thuật tách chiết DNA 60

2.2.4 Kỹ thuật MLPA 61

2.2.5 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen 63

2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 64

2.3.1 Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u nguyên bào thần kinh 64

2.3.2 Nghiên cứu mối liên quan giữa một số biến đổi di truyền với một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng và điều trị của bệnh nhân 65

2.4 Xử lý số liệu 65

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 65

2.6 Sơ đồ nghiên cứu 67

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 69

3.1 Phát hiện một số bất thường di truyền trên các bệnh nhân nhi mắc u nguyên bào thần kinh 69

3.1.1 Xác định trạng thái khuếch đại gen MYCN bằng kỹ thuật FISH 69

3.1.2 Xác định một số biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật MLPA và CGH 76

3.1.3 Quy trình xét nghiệm biến đổi di truyền trên bệnh nhân u NBTK 93

3

3.2 Xác định mối liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên

lượng và định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh 95

3.2.1 Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với tuổi chẩn đoán 95

3.2.2 Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giới tính 98

3.2.3 Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giai đoạn bệnh 99

3.2.4 Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số VMA/HVA 103

3.2.5 Mối liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số LDH 107

3.2.6 Mối quan hệ giữa trạng thái gen MYCN với trạng thái biệt hóa của tế bào 109

3.2.7 Mối quan hệ giữa trạng thái gen MYCN với tiên lượng mô bệnh học

111

3.2.8 Ý nghĩa các biến đổi di truyền với điều trị 114

KẾT LUẬN 120

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 121

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC 1 DANH SÁCH BỆNH NHÂN PL01 PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ MLPA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN PL10 PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ TÁCH DNA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN PL15

CNV Copy number variation Thay đổi về số lượng bản sao

EFS Event-free survival Tỷ lệ sống không bệnh FISH Fluorescent in-situ

INRGSS International Neuroblastoma

Risk Group Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh theo

nhóm nguy cơ INSS International Neuroblastoma

Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh quốc tế LDH Lactate Dehydrogenase Lactate Dehydrogenase LTS Life-threatening symptom Triệu chứng đe dọa sự sống

5

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

MIBG Meta-iodobenzyl-guanidine Meta-iodobenzyl-guanidine MKI Mitosis karyorrhexis Index Chỉ số nhân chia/nhân tan MLPA Multiplex ligation-dependent

probe amplification

Khuếch đại đa mồi dựa vào

phản ứng nối

Aberration

Biến đổi về số lượng nhiễm

sắc thể NGF Nerve growth factor Yếu tố tăng trưởng thần kinh

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Aberration

Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc

thể

VMA Vanillyl-mandellic Acid Vanillyl-mandellic Acid

6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INRGSS 22

Bảng 1.2 Bảng phân loại nhóm nguy cơ u NBTK 23

Bảng 1.3 Bảng phân nhóm điều trị các bệnh nhân nguy cơ không cao 25 Bảng 1.4 Các mất đoạn trong hệ gen ở các khối u NBTK 41

Bảng 3.1 Phân bố trạng thái gen MYCN trong nghiên cứu này 72

Bảng 3.2 Phân bố các dạng khuếch đại gen MYCN trong nghiên cứu này 72 Bảng 3.3 So sánh kết quả nghiên cứu tỷ lệ khuếch đại gen MYCN ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố 73

Bảng 3.4 Kết quả phân tích 10 mẫu bằng kỹ thuật MLPA 77

Bảng 3.5 Kết quả lai so sánh hệ gen của 6 bệnh nhân u NBTK 85

Bảng 3.6 Số lượng các dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể tìm được 89 Bảng 3.7 Số lượng các dạng biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể tìm được 90 Bảng 3.8 So sánh kết quả phát hiện CNV trên nhiễm sắc thể số 2 và 17 bằng kỹ thuật MLPA và CGH 92

Bảng 3.9 Phân bố bệnh nhân theo tuổi 95

Bảng 3.10 Phân bố trạng thái gen MYCN theo các nhóm tuổi 97

Bảng 3.11 Phân bố trạng thái gen MYCN theo giới tính 99

Bảng 3.12 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo đoạn giai đoạn bệnh ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố 101

Bảng 3.13 Kết quả HVA niệu 103

Bảng 3.13 Kết quả VMA niệu 104

Bảng 3.15 Kết quả chỉ số LDH huyết thanh 107

Bảng 3.16 Kết quả phân tích sự biệt hoá của tế bào 109

7

Bảng 3.17 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo các mức độ biệt

hóa của khối u ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố 109 Bảng 3.18 Kết quả tiên lượng mô bệnh học 112 Bảng 3.19 So sánh kết quả nghiên cứu phân bố theo tiên lượng mô bệnh

học ở nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố 113

Bảng 3.20 Ý nghĩa trong đánh giá nguy cơ của khuếch đại gen MYCN 115 Bảng 3.21 Ý nghĩa trong điều trị của kết quả lai so sánh hệ gen 116

8

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bốn con đường của sự thoái triển ngẫu nhiên 17

Hình 1.2 Vị trí gen MYCN trên nhiễm sắc thể số 2 32

Hình 1.3 Mô hình tương tác của protein mycN với các protein khác 33

Hình 1.4 Tỷ lệ sống không bệnh 3 năm ở trẻ nhỏ (dưới 1 tuổi) theo trạng thái gen MYCN 35

Hình 1.5 Tỷ lệ sống chung và sống không bệnh của bệnh nhân có khối u di căn kèm khuếch đại gen MYCN 36

Hình 1.6 Con đường dẫn truyền tín hiệu của thụ thể TrkA 37

Hình 1.7 Mối quan hệ giữa mất đoạn 1p, thêm đoạn 17q và khuếch đại gen MYCN trong 260 khối u NBTK nguyên phát 41

Hình 1.8 Mô hình biến đổi di truyền bệnh u NBTK 42

Hình 1.9 Nguyên lý của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 45

Hình 1.10 Nguyên lý của kỹ thuật MLPA 48

Hình 1.12 Biến đổi nhiễm sắc thể số 2 và 17 được đánh giá bằng kỹ thuật MLPA 49

Hình 1.11 Nguyên lý của kỹ thuật CGH 51

Hình 1.13 Biến đổi bộ nhiễm sắc thể số được đánh giá bằng kỹ thuật CGH 52

Hình 2.1 Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 58

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 67

Hình 3.1 Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB160902 70

Hình 3.2 Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB160801 71

Hình 3.3 Hình ảnh kết quả FISH của bệnh nhân NB161105P 71

9

Hình 3.4 Tỷ lệ các loại mẫu bệnh phẩm thực hiện kỹ thuật FISH 75

Hình 3.5 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB150807 78

Hình 3.6 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB170301 79

Hình 3.7 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB160101 80

Hình 3.8 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB161006 81

Hình 3.9 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB170203 82

Hình 3.10 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170201 85

Hình 3.11 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170301 86

Hình 3.12 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170404 87

Hình 3.13 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170203 87

Hình 3.14 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170505 88

Hình 3.15 Kết quả lai so sánh hệ gen của bệnh nhân NB170106 88

Hình 3.16 Tỷ lệ các dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể ở u NBTK 90

Hình 3.17 Tỷ lệ các dạng biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể ở u NBTK 91

Hình 3.18 Phân bố bệnh theo giai đoạn 100

Hình 3.19 Phân bố trạng thái gen MYCN theo giai đoạn 100

Hình 3.20 Phân bố bệnh nhân khuếch đại gen MYCN theo chỉ số VMA 102 Hình 3.21 Phân bố bệnh nhân khuếch đại gen MYCN theo chỉ số HVA 105 Hình 3.22 Phân bố trạng thái gen MYCN theo tỷ lệ VMA/HVA 105

Hình 3.23 Phân bố trạng thái gen MYCN theo nồng độ LDH 106

Hình 3.24 Phân bố trạng thái gen MYCN theo mức độ biệt hoá 108

Hình 3.25 Các nhóm tiên lượng (TL) mô bệnh học 110 Hình 3.26 Phân bố trạng thái gen MYCN theo tiên lượng mô bệnh học 112 Phụ lục 2.1 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151005 PL10 Phụ lục 2.2 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151103 PL11 Phụ lục 2.3 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB151108 PL12

10

Phụ lục 2.4 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB160102 PL13 Phụ lục 2.5 Kết quả MLPA của bệnh nhân NB161005 PL14

11

MỞ ĐẦU

Ung thư là hậu quả của sự mất điều hòa tăng sinh tế bào, ở đó các tế bào tăng sinh không kìm hãm và hình thành các khối u trong cơ thể Khối u tập hợp các tế bào phát triển không kiểm soát, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan tổ chức xung quanh Nếu các tế bào này chỉ phát triển tại chỗ, không lan rộng trong cơ thể thì đó là khối u lành tính (benign tumor) Còn nếu các tế bào này

có các biến đổi bất thường về bộ máy di truyền làm thay đổi hình dạng và bản chất bề mặt tế bào thì sẽ hình thành nên các khối u ác tính Các tế bào ung thư này có xu hướng lan rộng ra các nội quan lân cận cũng như theo đường máu và bạch huyết đến các vị trí xa trong cơ thể để hình thành nên các khối u mới Hiện tượng này được gọi là di căn và thường xảy ra vào giai đoạn muộn của bệnh Hiện nay có khoảng 200 bệnh ung thư khác nhau, trong đó ung thư nhi chiếm khoảng 2% tổng số các loại ung thư

Mặc dù ung thư nhi, với một tỷ lệ nhỏ như vậy, không phổ biến, nhưng đây chính là nguyên nhân thứ hai gây ra tử vong ở trẻ em, xếp sau tai nạn ở các nước phương Tây hay các bệnh truyền nhiễm ở các nước đang phát triển Có khoảng 130 trẻ mắc ung thư mới trên 1 triệu trẻ em nhỏ hơn 15 tuổi mỗi năm Kết quả điều trị ung thư ở trẻ em đã được cải thiện một cách đáng kể và hiện nay có trên 75% số ca được điều trị thành công

U NBTK là loại ung thư chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dưới 6 tuổi), hiếm khi tìm thấy trên trẻ hơn 10 tuổi Đây là loại ung thư đứng thứ 6 trong số các ung thư nhi xếp sau bệnh bạch cầu, u não… Khối u NBTK là khối

u có biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào các đặc điểm sinh học bao gồm tuổi chẩn đoán, giai đoạn bệnh, tính chất mô bệnh học và các biến đổi trong bộ máy

di truyền Một số bất thường gen và nhiễm sắc thể đặc hiệu được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc tiên lượng, phân nhóm nguy cơ và lựa chọn phác đồ

cho bệnh nhân nhi mắc u NBTK Đó là khuếch đại gen MYCN hay các biến đổi nhiễm sắc thể Khuếch đại gen MYCN, dạng đột biến làm tăng số lượng bản sao

12

của gen lên nhiều lần, là yếu tố di truyền được sàng lọc đầu tiên Các bệnh nhân mang đột biến này đều có tiên lượng xấu, cần phải được điều trị bằng phác đồ mạnh Một trong những kỹ thuật di truyền đang được sử dụng phổ biến để phát hiện đột biến gen này là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Các biến đổi nhiễm sắc thể, như mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1, mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11, thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 17…, là yếu tố góp phần quan trọng vào việc lựa chọn phác đồ điều trị cho các bệnh nhân nguy cơ thấp, phụ thuộc vào dạng biến đổi là số lượng hay cấu trúc bộ nhiễm sắc thể Có nhiều kỹ thuật di truyền được sử dụng để phát hiện các biến đổi này như kỹ thuật kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối (MLPA) hay kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH) Việc phát hiện các biến đổi di truyền này ở Việt Nam vẫn chưa được thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân Vì vậy, từ nhiều năm nay, nhu cầu xét nghiệm di truyền cho bệnh u NBTK luôn được đặt ra

Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu

“Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh” được tiến hành với các mục tiêu sau:

1 Phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào thần kinh

2 Xác định mối liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh

Nội dung nghiên cứu của luận án

1 Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u NBTK

- Phát hiện khuếch đại gen MYCN trên tất cả các bệnh nhân u NBTK

bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

- Phát hiện các biến đổi nhiễm sắc thể trên một số bệnh nhân u NBTK nguy cơ thấp bằng kỹ thuật MLPA

Phân tích mối liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với tuổi chẩn đoán,

giới tính, giai đoạn bệnh, nồng độ VMA, HVA, LDH, trạng thái biệt hóa của tế bào và tiên lượng mô bệnh học bằng các đánh giá thống kê

3 Áp dụng kết quả phân tích biến đổi di truyền trong định hướng điều trị bệnh u NBTK

Khuếch đại gen MYCN và kết quả biến đổi bộ nhiễm sắc thể cùng với

các đặc điểm sinh học khác của khối u NBTK được sử dụng trong phân nhóm nguy cơ theo hướng dẫn của tổ chức u NBTK quốc tế và lựa chọn cách thức điều trị tối ưu cho bệnh nhân theo phác đồ của tổ chức Ung thư nhi Quốc tế

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn luận án

- Cung cấp thông tin về biến đổi gen/ nhiễm sắc thể trên các bệnh nhân u NBTK, từ đó xây dựng cơ sở dữ liệu về di truyền tại Việt Nam

- Xác định mối liên quan giữa biến đổi di truyền với một số yếu tố có giá trị tiên lượng khác trong bệnh u NBTK, hỗ trợ các nhà lâm sàng trong tiên lượng bệnh

- Áp dụng các biến đổi di truyền trong điều trị bệnh u NBTK, góp phần phân nhóm bệnh nhân, lựa chọn phác đồ tối ưu (giảm lượng hóa chất, điều trị đích…) để đạt được kết quả điều trị tốt nhất cho từng bệnh nhân Đây chính

là xu hướng cá nhân hóa trong điều trị ung thư hiện đại

Tính mới của luận án

- Các biến đổi di truyền có giá trị tiên lượng trên khối u NBTK được xác định bằng các kỹ thuật di truyền hiện đại, lần đầu tiên được áp dụng tại Việt

Nam Sự khuếch đại gen MYCN, đột biến di truyền được sàng lọc trước hết,

được phát hiện bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Các biến đổi nhiễm sắc

14

thể trên một số bệnh nhân không khuếch đại gen MYCN lần đầu tiên được đánh

giá bằng kỹ thuật MLPA và kỹ thuật lai so sánh hệ gen Các kết quả này góp phần vào việc phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ và đưa ra tiên lượng điều trị

- Các đặc điểm về di truyền của khối u NBTK được sử dụng vào việc định hướng điều trị phù hợp cho các bệnh nhân u NBTK Nhóm bệnh nhân có

khuếch đại gen MYCN được điều trị theo phác đồ nguy cơ trung bình hoặc cao,

tùy thuộc vào giai đoạn bệnh Còn với các bệnh nhân không có khuếch đại gen

MYCN và ở nhóm nguy cơ thấp, kết quả phân tích bộ nhiễm sắc thể là yếu tố

quan trọng trong việc quyết định điều trị hóa chất hay có thể chỉ cần theo dõi định kỳ bệnh nhân Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam có ý nghĩa định hướng cá nhân hóa điều trị cho bệnh nhân u NBTK, giúp giảm bớt độc tính và cho kết quả tốt

15

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về u nguyên bào thần kinh

1.1.1 Tỷ lệ mắc

U NBTK lại là dạng ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm đầu tiên của cuộc đời [15] Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dưới 15 tuổi [16] Hàng năm có khoảng 700 ca mới ở Hoa Kỳ [73], 150

ca mới ở Pháp [105], 50-60 ca mới tại Bệnh viện Nhi Trung ương, Việt Nam Mặc dù chỉ chiếm tỷ lệ khoảng 6%, u NBTK lại là nguyên nhân của 15% số ca

tử vong do ung thư ở trẻ em [89]

Tuổi chẩn đoán trung bình cho u NBTK là khoảng 18 tháng [56] Một vài trường hợp thậm chí còn có thể phát hiện dưới siêu âm ngay từ giai đoạn bào thai Gần 90% số trường hợp mắc u NBTK là dưới 5 tuổi, hiếm bệnh nhân trên 10 tuổi

1.1.2 Nguyên nhân hình thành khối u nguyên bào thần kinh

Nguyên nhân của phần lớn khối u NBTK hiện nay vẫn chưa biết rõ [14] Khối u này hình thành khi các NBTK không thể biệt hóa hoàn toàn thành các

tế bào thần kinh hay tế bào tủy thượng thận Thay vào đó, chúng liên tục lớn lên và phân chia không kiểm soát Tại thời điểm khối u đã có kích thước đủ lớn

để gây ra các triệu chứng bệnh, nó không thể biệt hóa tiếp nữa mà phát triển và

di căn nếu không được điều trị

Sự kiện một số nguyên bào thần kinh không thể biệt hóa và dừng phân chia là do kết quả các bất thường di truyền trong tế bào [100], dẫn đến việc bật các gen tiền ung thư (thường là các gen giúp tế bào lớn lên, phân chia hoặc tồn tại) và tắt các gen ức chế khối u (là các gen làm chậm sự phân chia hoặc làm cho tế bào chết đúng thời điểm) Các biến đổi di truyền đó có thể do di truyền

từ bố mẹ, hoặc phát sinh mới trong đời sống cá thể

Khoảng 8% các khối u NBTK có tính chất gia đình Đó thường là các

16

bệnh nhân có tuổi chẩn đoán sớm (9 tháng) và đột biến gen ALK và/hoặc

PHOX2B di truyền từ bố mẹ [56] Còn lại là các khối u không có nguyên nhân

di truyền, mặc dù 10% đến 15% khối u nhóm này có đột biến gen ALK [67]

Một vài biến đổi gen có tác động làm tăng tốc độ phát triển của một khối

u NBTK Ví dụ, khuếch đại gen tiền ung thư MYCN làm khối u phát triển nhanh

và khó điều trị, đột biến gen ức chế khối u ATRX gặp ở các khối u tiến triển

chậm nhưng lại đáp ứng không tốt với điều trị [77]

1.1.3 Phôi thai học u nguyên bào thần kinh

U NBTK là dạng khối u có nguồn gốc phôi bào của hệ thần kinh giao cảm Tế bào khởi đầu khối u là những tế bào tiền thân đang phát triển và chưa biệt hóa hoàn toàn, bắt nguồn từ mô mào thần kinh [99] Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ, và xuất hiện ở nhiều vị trí khác nhau như cổ, ngực, bụng và tiểu khung Các biểu hiện lâm sàng rất đa dạng phụ thuộc vào vị trí u tiên phát và các biểu hiện di căn [79] Một mặt, u NBTK giải thích cho trạng thái bệnh và tỷ lệ tử vong không cân đối giữa các loại ung thư trẻ em Mặt khác

nó biểu hiện tỷ lệ thoái triển ngẫu nhiên cao nhất trong tất cả các loại ung thư của con người Mặt khác, kết quả điều trị trên các bệnh nhân u NBTK đã được cải thiện Tỷ lệ sống trong vòng 5 năm đã tăng từ 52% trong giai đoạn 1975-

1977 lên đến đến 74% từ 1999 đến 2005, tập trung ở nhóm bệnh nhân nguy cơ không cao Trong khi đó, tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân nguy cơ cao chỉ có sự gia tăng khiêm tốn bất chấp sự cải tiến không ngừng các liệu pháp điều trị [56]

1.1.3.1 Sự thoái triển ngẫu nhiên

Sự thoái triển ngẫu nhiên của ung thư được mô tả là sự giảm về kích thước hoặc biến mất hoàn toàn toàn một khối u tiên phát cũng như ở bệnh ung thư đã di căn mà không cần có sự can thiệp về điều trị U NBTK được xem như một loại ung thư có diễn ra sự thoái triển ngẫu nhiên phổ biến, thông qua sự chết hàng loạt các tế bào thần kinh trung ương và ngoại vi còn chưa biệt hóa trong quá trình phát triển phôi (xem hình 1.1) Tuy nhiên, tỷ lệ u NBTK thoái

17

triển ngẫu nhiên vẫn còn chưa rõ ràng [27, 41]

Hình 1.1 Bốn con đường của sự thoái triển ngẫu nhiên

(1) sự thiếu hụt neurotrophin làm khởi động chết theo chương trình trong quá trình phát triển; (2) các tế bào bị tiêu diệt bởi các kháng thể kháng u NBTK

và các tế bào diệt tự nhiên; (3) quá trình làm ngắn đầu mút và chết theo chương trình được kích hoạt bởi nồng độ thấp hay không có enzym telomerase; (4) các biến đổi epigenetics trong sự biểu hiện gen được kiểm soát bởi sự methyl hóa DNA, cải biến histone hay thay đổi trong quá trình

hình thành chất nhiễm sắc [27]

1.1.3.2 Sự biệt hóa

Biệt hóa là một hiện tượng đặc biệt khác xảy ra trên khối u NBTK, ở đó các tế bào NBTK biệt hóa từ dạng tiền thân thành dạng trưởng thành, khi đó khối u NBTK chuyển thành khối u hạch thần kinh lành tính Các đặc điểm di truyền của các tế bào NBTK đang trưởng thành hoặc các tế bào hạch giống với

các NBTK đang thoái triển, ví dụ như gen MYCN không bị đột biến, không mất

đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 và có bộ nhiễm sắc thể gần tam bội Sự biệt

Nguồn: [28]

18

hóa này có thể là ngẫu nhiên hoặc xuất hiện sau hóa trị Tỷ lệ các khối u NBTK

đi theo con đường biệt hóa là thấp hơn các khối u thoái triển theo con đường chết theo chương trình [41, 64]

1.1.3.3 Sự tăng trưởng ác tính

Phần lớn các khối u NBTK ở giai đoạn muộn rất khó thoái triển hoặc tiếp tục biệt hóa Đồng thời có một phần không nhỏ các khối u giai đoạn Ms đã tiến triển thành giai đoạn M (xem thêm phần 1.2.1) Rõ ràng, có một liên kết chặt chẽ giữa sự tăng trưởng ác tính của khối u với các đặc điểm di truyền bất lợi

như khuếch đại gen MYCN, nhiều thay đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể và bộ

nhiễm sắc thể lưỡng bội/ tứ bội [41]

1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh

Các khối u ngoại vi thần kinh gồm có 2 thành phần tế bào là các NBTK (neuroblastic cells)/tế bào hạch (ganglionic cells) và các tế bào đệm Schwann (Schwannian cells) Các NBTK ở khối u sản sinh ra chất kích thích phân bào quan trọng cho các tế bào Schwann tăng sinh và phát triển Ngược lại, các tế bào Schwann lại có thể tiết ra các nhân tố kìm hãm tăng sinh và cảm ứng biệt hóa thiết yếu cho quá trình biệt hóa của các tế bào thần kinh Chính sự tương tác qua lại giữa các NBTK với các tế bào mô đệm Schwann này giải thích cho quá trình trưởng thành của các khối u ngoại vi thần kinh thuận lợi về mặt sinh học Còn các khối u không thuận lợi về mặt sinh học nhìn chung có ít thành phần mô đệm và sự trưởng thành của khối u cũng bị hạn chế [112]

Các khối u NBTK được đánh giá mức độ trưởng thành theo các nhóm tuổi dựa theo 2 đặc điểm hình thái là mức độ biệt hóa của các NBTK và mức

độ phát triển của các tế bào đệm Schwann Đại đa số các trường hợp có thể chẩn đoán thông qua phân tích hình ảnh tế bào học trên tiêu bản nhuộm HE thông thường Chỉ có một nhóm nhỏ cần thêm các dấu ấn miễn dịch huỳnh quang để khẳng định chẩn đoán

U NBTK (neuroblastoma) là khối u có thành phần mô đệm Schwann

19

chiếm dưới 50% toàn bộ khối u Có 3 mức độ biệt hoá là chưa biệt hoá, ít biệt

hoá và đang biệt hóa U NBTK chưa biệt hóa (undifferentiated neuroblastoma)

(chiếm 2-3% tổng số u NBTK) đặc trưng bởi các tế bào u chưa biệt hóa, kích thước nhỏ hoặc trung bình, vành bào tương không rõ ranh giới, nhân có nhiều hình dạng (hình tròn hay dài) và có thể chứa nhiều hạch nhân, không có các sợi

tơ thần kinh U NBTK ít biệt hóa (poorly differentiated neuroblastoma) (chiếm

khoảng 65-75% các u NBTK) là các khối u dưới 5% tế bào có các dấu hiệu biệt hóa cùng với sự xuất hiện các sợi tơ thần kinh U NBTK đang biệt hóa

(differentiating neuroblastoma) (khoảng 5% các u NBTK) thường có nhiều sợi

tơ thần kinh với trên 5% tế bào đang ở các mức độ biệt hóa khác nhau Sự biệt hóa của tế bào thể hiện ở cả nhân (nhân rộng, lệch tâm, chất nhiễm sắc hình túi

và một hạch nhân lồi lên) và bào tương (ưa kiềm, có hai quai) [42]

U hạch nguyên bào thần kinh bao gồm 2 týp là thể hỗn hợp và thể nốt U

hạch NBTK thể hỗn hợp (ganglioneuroblastoma, intermixed) (khoảng 2-3%

các u NBTK) là các khối u giàu mô đệm Schwann với những ổ vi thể các NBTK

ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau cùng nhiều sợi tơ thần kinh phân bố ngẫu nhiên, nhưng thành phần biệt hóa phải chiếm trên 50% toàn khối u U hạch

NBTK thể nốt (ganglioneuroblastoma, nodular) (chiếm 7-8% các u NBTK)

thường là các ổ NBTK (nghèo mô đệm Schwann) kèm theo u hạch NBTK hỗn hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (chủ yếu là mô đệm Schwann), với dấu hiệu đặc trưng là đường phân ranh giới dốc đứng giữa nốt NBTK và mô đệm Schwann phản ánh quá trình phát triển nhanh của các tế bào

ác tính làm tắc nghẽn thành phần mô đệm Schwann [112]

U hạch thần kinh (ganglioneuroma) (thấp hơn 1% các u NBTK) bao gồm

u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch thần kinh biệt hóa U hạch thần kinh đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ưu thế chủ yếu kèm theo các tế bào đang biệt hóa và đã biệt hóa hoàn toàn U hạch thần kinh biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trưởng thành, không có

ít biệt hóa hoặc đang biệt hóa ở trẻ nhỏ tuổi với chỉ số nhân chia/nhân tan thấp

Tỷ lệ sống không bệnh trong 3 năm là 85% Ngược lại, các khối u NBTK không biệt hóa, ít biệt hóa hoặc đang biệt hóa ở trẻ lớn kèm chỉ số nhân chia/nhân tan cao đều được xếp vào nhóm mô bệnh học không thuận lợi với tỷ lệ sống không bệnh trong 3 năm chỉ khoảng 41% [95] Đây là một trong các yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn chiến lược điều trị của các nhà lâm sàng

1.2 Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng u nguyên bào thần kinh

1.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh

U nguyên bào thần kinh là một bệnh lý có đặc điểm lâm sàng đa dạng Tuổi chẩn đoán, giai đoạn, vị trí nguyên phát cũng như di căn, đặc điểm về hình ảnh là những yếu tố lâm sàng có nhiều ý nghĩa trong việc điều trị và tiên lượng bệnh

Độ tuổi chẩn đoán đã được xác định có quan hệ với kết quả điều trị ngay

từ thời điểm ban đầu nghiên cứu và chẩn đoán bệnh u NBTK Tuổi chẩn đoán nhỏ hơn 1 tuổi là một yếu tố tiên lượng thuận lợi do các bệnh nhân ở tuổi này

có khả năng điều trị tốt hơn so với các bệnh nhân nhi lớn tuổi [95] Các nghiên cứu về tuổi tiếp theo đều diễn ra trên trẻ lớn hơn 1 tuổi Ba nghiên cứu của George [47], London [66], Schmidt [88] cùng trong năm 2005 cho thấy có sự khác nhau về tỷ lệ sống không bệnh giữa các bệnh nhân dưới 18 tháng và trên

18 tháng tuổi Từ đó, 18 tháng được lựa chọn như một điểm cắt về tuổi thứ hai

để phân biệt các nhóm tiên lượng khác nhau [36] U NBTK ở trẻ lớn (>13 tuổi)

và người lớn (khoảng 3% tổng số ca) có một số khác biệt về đặc điểm sinh học

21

khác với ở trẻ em như rất hiếm gặp khuếch đại gen MYCN, tỷ lệ dương tính của

catecholamine niệu thấp, ít khi thấy chỉ số LDH huyết thanh tăng cao với tiên lượng bệnh xấu Điều này là do sự tiến triển lặng lẽ và kéo dài, hay gặp tái phát muộn của u NBTK ở trẻ lớn và người lớn, phần lớn dẫn đến tử vong [95]

Khối u NBTK nguyên phát có thể phát triển từ bất cứ vị trí nào của hệ thần kinh giao cảm (bụng, trung thất, cổ hay tiểu khung) Trẻ lớn thường gặp khối u ở tuyến thượng thận, trong khi trẻ nhỏ hay gặp ở trung thất hoặc ở cổ Các khối u ở vùng bụng thường gây ra chướng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn, đôi khi chèn ép mạch máu gây phù nề chi dưới hoặc huyết áp cao Các khối u vùng ngực khó phát hiện hơn, thường tình cờ phát hiện khi bệnh nhân chụp X quang tim phổi Ngoài ra, có khoảng 5-16% số ca u NBTK nằm cạnh cột sống

có thể phát triển lan qua các lỗ giữa thân cột sống xâm lấn vào màng cứng hoặc nội tủy của tủy sống gây nên hội chứng chèn ép rễ thần kinh hay tủy sống Các bệnh nhân này có thể có các triệu chứng như đau, mất cảm giác, giảm vận động hoặc liệt các chi [6] Khoảng 1-5% các trường hợp không tìm thấy u tiên phát

Tế bào u NBTK hoặc theo con đường bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hay hạch xa, hoặc theo đường máu di căn vào tủy xương, xương, gan,

da Ngoài ra, một biểu hiện di căn khác của u NBTK là lồi mắt, u ở đầu (di căn vào hốc mắt/sọ) Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dưới 1 tuổi có một số đặc điểm khác biệt với trẻ lớn: di căn gan và da, có khả năng thoái triển ngẫu nhiên,

và tiên lượng tốt [21] Khoảng hơn 50% số ca, đặc biệt là các bệnh nhân hơn 1 tuổi và có khuếch đại gen MYCN xuất hiện di căn tại thời điểm chẩn đoán [81]

Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ cho phép khảo sát khối u nguyên phát để đánh giá khả năng phẫu thuật cắt bỏ; phát hiện di căn xa để phân loại giai đoạn bệnh; hướng dẫn cho thủ thuật sinh thiết khối u bằng kim nhỏ; và là công cụ theo dõi, đánh giá tiến triển bệnh trong quá trình điều trị (chụp nhấp nháy đồ bằng meta-iodobenzyl-guanidine (MIBG) với đồng vị phóng xạ 123I) [76] Từ năm 2011,

22

hệ thống các yếu tố nguy cơ về hình ảnh đã được thống nhất sử dụng trong phân giai đoạn bệnh u NBTK, tham gia quyết định thời điểm phẫu thuật và theo dõi điều trị của bệnh nhân [45]

Các khối u NBTK thường được chia thành 2 nhóm lớn là giai đoạn khu trú và giai đoạn di căn Từ trước năm 2009, hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh quốc tế (INSS) chia các bệnh nhân thành 5 nhóm theo khả năng phẫu thuật và sự lan tỏa của khối u (giai đoạn 4 và 4S là giai đoạn di căn, giai đoạn 1 đến 3 là giai đoạn khu trú) Giai đoạn 4S (7-10% số ca) xảy ra ở các bệnh nhân nhỏ hơn 12 tháng, có khối u di căn đến gan, tủy xương và da Điểm đặc biệt ở đây là khả năng thoái triển ngẫu nhiên dù khối u tiên phát có kích thước lớn [108] Tỷ lệ sống chung trong 5 năm là 92% [108] Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh theo nhóm nguy cơ (INRGSS) (xem bảng 1.1) ra đời sau năm 2009 sử dụng thêm các yếu tố nguy cơ về hình ảnh, trong

đó giai đoạn L1 và L2 là giai đoạn khu trú, M và Ms là giai đoạn di căn Trong khi hệ thống INSS sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên, hệ thống INRGSS không cần phải phẫu thuật bệnh nhân để xếp giai đoạn Nhờ vậy nhiều bệnh nhân không cần phải can thiệp gì mà vẫn có thể khỏi bệnh, nhất là các bệnh nhân nhỏ hơn 1 tuổi có khối u khu trú [21]

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INRGSS

L1 Khối u khu trú không liên quan đến các tạng thiết yếu và giới

hạn ở một bên của cơ thể L2 Khối u khu trú ở một khu vực kèm theo một hoặc nhiều hơn

yếu tố nguy cơ về hình ảnh

M Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS)

MS Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da,

gan và/hoặc tủy xương

23

Việc phân nhóm bệnh nhân ngay từ ban đầu có ý nghĩa rất lớn đến kết quả điều trị bệnh u NBTK Từ năm 2009, Tổ chức u NBTK Quốc tế sử dụng 4 yếu tố có ý nghĩa tiên lượng là giai đoạn, tuổi chẩn đoán, mô bệnh học và đặc điểm di truyền để phân nhóm nguy cơ cho các khối u NBTK, từ nguy cơ rất thấp, thấp, trung bình đến nguy cơ cao (xem Bảng 1.2) [36]

Bảng 1.2 Bảng phân loại nhóm nguy cơ u NBTK Các ô để trống: bất kì; 11q: cánh dài nhiễm sắc thể số 11; nguy cơ rất thấp khi tỷ lệ sống không bệnh (EFS) trong 5 năm ≥ 85%; nguy cơ thấp khi EFS trong 5 năm > 75% đến ≤ 85%; nguy cơ trung bình khi EFS trong 5 năm ≥

50% đến ≤ 75%; nguy cơ cao khi EFS trong 5 năm <50%

Nhóm nguy cơ trước điều trị

đang biệt hoá

U hạch NBTK thể hỗn hợp

Rất thấp

thần kinh đang biệt hoá hoặc u hạch NBTK thể hỗn hợp

Không khuếch đại

L2 ≥ 18 tháng

- U hạch NBTK thể nốt, đang biệt hoá

- U NBTK đang biệt hoá

Không khuếch đại

U hạch NBTK thể nốt, ít hoặc không biệt hoá

Không

Nhóm nguy cơ trước điều trị

Trong khi các bệnh nhân nguy cơ cao cần phải điều trị hoá chất tối đa,

xạ trị và ghép tế bào gốc [33], các bệnh nhân nguy cơ rất thấp và nguy cơ thấp mang biến đổi di truyền dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể (NCA) có xu hướng thoái triển ngẫu nhiên; nên hiện nay nhiều phác đồ khuyến cáo có thể theo dõi không hoá chất hay phẫu thuật Trong phác đồ điều trị cho các bệnh nhân u NBTK nguy cơ không cao, tổ chức Ung thư Nhi Quốc tế chia những bệnh nhân này thành 10 nhóm (6 nhóm nguy cơ thấp được đánh số từ 1 đến 6,

và 4 nhóm nguy cơ cao, từ 7 đến 10) tương ứng với liều lượng hóa trị tăng dần Bên cạnh tuổi, giai đoạn, sự có mặt hay không của triệu chứng đe dọa sự sống (LTS), dạng biến đổi bộ nhiễm sắc thể giữ một vai trò quan trọng (xem bảng 1.3) [75]

25

Bảng 1.3 Bảng phân nhóm điều trị các bệnh nhân nguy cơ không cao các ô để trống: bất kì; -: không khuếch đại gen MYCN; +: có khuếch đại gen MYCN; NCA: biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể; SCA: biến đổi về cấu trúc

hạch NBTK thể nốt, ít hoặc không biệt hoá

Phác đồ điều trị bệnh nhân u NBTK nguy cơ không cao cho thấy kết quả rất tốt Đối với những bệnh nhân nguy cơ rất thấp và thấp (như giai đoạn L1, giai đoạn L2 và Ms ít hơn 18 tháng…), tỷ lệ sống không bệnh từ >95% đến 100% trong 3 năm ngay cả khi bệnh nhân chỉ theo theo dõi định kỳ bằng siêu

âm Có một sự tiến triển mạnh mẽ trong điều trị các bệnh nhân u NBTK nguy

26

cơ trung bình Phác đồ mới giúp rút ngắn đợt điều trị, dùng carboplatin thay cho cisplatin, giảm liều tích lũy 60% nhằm giảm độc tính, thời gian điều trị tại bệnh viện và giá thành nhưng vẫn giữ được tỷ lệ sống không bệnh 3 năm khoảng 90% [75]

1.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh

U NBTK là một trong số ít các khối u ở trẻ nhỏ có các chỉ thị khối u đóng vai trò trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi bệnh [106]

1.2.2.1 Chuyển hóa catecholamine

Catecholamine là nhóm nội tiết tố được sản xuất bởi tủy thượng thận, giúp dẫn truyền thần kinh trong não, làm tăng glucose và giải phóng axit béo

để tạo ra năng lượng [103]

Các tế bào u NBTK một mặt không có các túi chứa catecholamine như các tế bào mào thần kinh bình thường Ở các tế bào này, khi giải phóng vào hệ tuần hoàn, catecholamine nhanh chóng biến đổi thành các chất chuyển hoá là VMA và HVA Mặt khác, các tế bào u này thiếu enzyme phenylethanolamine N-methyltransferase để chuyển norepinephrine thành epinephrine nên làm tăng nồng độ các chất chuyển hoá nói trên Khoảng 90% số ca có tăng nồng độ các chất này trong nước tiểu [31] Chính vì vậy, việc sử dụng VMA và HVA niệu làm dấu ấn ung thư có ý nghĩa chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh u NBTK [31, 103]

1.2.2.2 Lactate Dehydrogenase (LDH)

Nồng độ LDH huyết thanh tăng cao cũng có thể cung cấp thêm thông tin

về tiên lượng bệnh ở các bệnh nhân u NBTK, độc lập với giai đoạn, tuổi và các yếu tố khác [52] Phần lớn bệnh nhân nhi có khối u NBTK khu trú có nồng độ LDH bình thường khi chẩn đoán; trong khi đó nồng độ LDH lại tăng cao ở các bệnh nhân giai đoạn M, phản ánh tế bào u phát triển nhanh và khối u nhiều tế bào ác tính, là dấu ấn phân loại để xác định các bệnh nhân nguy cơ cao [31, 108] Trong những trường hợp không thể có các dấu ấn phân tử hiện đại (ví dụ,

27

không làm được kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) sàng lọc khuếch đại

gen MYCN), nồng độ LDH có thể là 1 yếu tố tiên lượng có ý nghĩa trong việc

phân loại nhóm nguy cơ phối hợp cùng giai đoạn bệnh

1.3 Các đặc điểm di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh

Nhiều đặc điểm di truyền của u NBTK, như trạng thái bội thể, sự khuếch đại gen tiền ung thư hay các biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể, hiện nay đã được xác định là có sự liên quan với biểu hiện lâm sàng, tiên lượng bệnh và nguy cơ tái phát sau điều trị [18] Các phát hiện này cho chúng ta một sự hiểu biết sâu sắc cơ chế của sự chuyển dạng và phát triển ác tính hóa, cũng như sự biệt hóa và thoái triển ngẫu nhiên

1.3.1 Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể

Các biến đổi số lượng nhiễm sắc thể ở bệnh u NBTK được xác định trực tiếp qua đếm số lượng nhiễm sắc thể hoặc gián tiếp qua chỉ số DNA nhờ hệ thống đo tế bào theo dòng chảy (flow cytometry)

Với hệ thống đo tế bào theo dòng chảy, các khối u có đa bội nhiễm sắc thể có chỉ số DNA khoảng từ 1,07 đến 2,42 Bown và cộng sự đã phát hiện trong 289 bệnh nhân, dạng lưỡng bội mang biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể chiếm 34% và thường thấy ở các bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng không thuận lợi, giảm khả năng sống; dạng đa bội chiếm 65% và gặp ở các khối u giai đoạn sớm, tuổi chẩn đoán thấp và tiên lượng điều trị tốt [56]

Mặt khác, một phương pháp phân tích di truyền là đánh giá trực tiếp các thay đổi số lượng nhiễm sắc thể dạng lệch bội Kết quả cho thấy có 3 dạng biến đổi phổ biến là dạng gần lưỡng bội (near diploidy), dạng gần tam bội (near triploidy) và dạng gần tứ bội (near tetraploidy) Các dạng này có quan hệ chặt chẽ với tuổi chẩn đoán, giai đoạn và tỷ lệ sống, trong đó các bệnh nhân mang thể gần tam bội có kết quả điều trị tốt hơn một cách rõ ràng [38]

Như vậy, biến đổi số lượng nhiễm sắc thể, dù được xác định gián tiếp hay trực tiếp, là một dấu ấn di truyền có ý nghĩa tiên lượng Ở đó, các khối u

28

có bộ nhiễm sắc thể gần lưỡng bội là không thuận lợi khi so sánh với các khối

u gần tam bội Tuy nhiên, giá trị tiên lượng của chỉ số này chỉ giới hạn ở nhóm bệnh nhân ít hơn 1 tuổi [97]

1.3.2 Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể

Khác với các biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể, các biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể ở u NBTK có nhiều ý nghĩa tiên lượng hơn và thường cho biết tiên lượng xấu đối với bệnh nhân Các dạng biến đổi này rất đa dạng Có những biến đổi đã được chứng minh liên quan mật thiết đến lâm sàng như thêm đoạn nhiễm sắc thể số 17, các mất đoạn ở nhiễm sắc thể số 1, 11 và 14… [97]

1.3.2.1 Thêm đoạn nhiễm sắc thể số 17

Thêm đoạn nhiễm sắc thể số 17 là biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể đầu tiên được tìm thấy trên các bệnh nhân u NBTK Phân tích công thức nhiễm sắc thể với băng G đã phát hiện thấy sự thêm vật liệu di truyền ở cánh dài nhiễm sắc thể số 17 tại vị trí 17q21-qter Gần đây hơn, việc sử dụng kỹ thuật FISH và

kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH) đã xác định được sự có mặt của một vùng vật chất di truyền ít nhất là 25Mb được thêm vào cánh dài nhiễm sắc thể 17 ở khoảng 50% - 75% số ca u NBTK nguyên phát [38]

Đột biến thêm cánh dài nhiễm sắc thể số 17 có quan hệ chặt chẽ với các khối u nguy cơ xấu như giai đoạn bệnh muộn, tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, mang

mất đoạn 1p và khuếch đại gen MYCN [22, 60] Mặc dù vai trò của thêm đoạn

nhiễm sắc thể số 17 đã được phát hiện, nhưng các gen thiết yếu liên quan đến thêm đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 17 vẫn chưa được làm sáng tỏ, dù đã có

một vài gen ứng viên như survivin, topoisomerase II, ncRAN… [13] và gần đây nhất là IGF2BP1 Trong điều kiện ung thư, gen IGF2BP1 tăng cường sự di

chuyển và khả năng xâm lấn của các tế bào và kích thích sự sinh trưởng của chúng, đồng thời tăng cường hoạt hóa sự ác tính của khối u qua việc điều hòa các RNA thông tin đích mã hóa cho một loạt nhân tố tiền ung thư Vì vậy gen này rõ ràng có giá trị tiên lượng xấu, và có tiềm năng trở thành đích điều trị mới

1.3.2.2 Mất đoạn nhiễm sắc thể số 1

Giống như thêm đoạn 17q, mất đoạn nhiễm sắc thể số 1 trong bệnh u NBTK đã được tìm ra từ lâu bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào và làm tiêu bản nhiễm sắc thể Là kết quả của một chuyển đoạn không cân bằng tại vị trí đứt gãy từ 1p22 đến 1p36, biến đổi di truyền này cũng được chứng minh là có tỷ lệ cao trong bệnh u NBTK ở các khối u không thể phẫu thuật và di căn, kết quả điều trị kém Hơn nữa, mất đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 thường đi kèm

với khuếch đại gen MYCN (62%) [109] Trạng thái vùng 1p36 có ý nghĩa tiên

lượng về tiến triển của bệnh ở nhóm nguy cơ thấp [83]

Mất đoạn 1p hay gặp ở bệnh nhân tiên lượng xấu [23] do một vài gen ức chế khối u có thể nằm trên vùng này Đã có một vài gen được phân tích như

HKR3 hay DR3 Tuy nhiên CHD5 mới là một ứng viên sáng giá, vì biểu hiện

của CHD5 bị mất đi ở các dòng tế bào u NBTK và việc phục hồi gen này dẫn đến không còn sự hình thành khối u Biểu hiện cao của CDH5 liên quan đến

nhiều yếu tố thuận lợi và có kết quả điều trị tốt [32, 60]

1.3.2.3 Mất đoạn nhiễm sắc thể số 11

Cùng với sự ra đời và phát triển của kỹ thuật lai so sánh hệ gen, nhiều biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể khác được phát hiện trên các khối u NBTK như mất đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 11 hay mất đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 14… Các biến đổi này dần dần được chứng minh vai trò trong tiên lượng bệnh

và ứng dụng trong phân loại bệnh nhân u NBTK [70]

Mất đoạn nhiễm sắc thể số 11 được tìm thấy ở khoảng 41% khối u

30

NBTK, tại vị trí 11q23.3 và có độ dài khoảng 2,1cM [97] Biến đổi di truyền này luôn xuất hiện cùng các dấu ấn xấu của bệnh (tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, giai đoạn 4, mô bệnh học không thuận lợi), và gần như không đi kèm với khuếch

đại gen MYCN [22] Về ý nghĩa lâm sàng, mất đoạn 11q làm giảm tỷ lệ sống trong 3 năm của nhóm bệnh nhân không có khuếch đại gen MYCN (75% trong

số 98 bệnh nhân có mất đoạn 11q so với 91% của 82 bệnh nhân không có mất đoạn) [50] Chính vì vậy, mất đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 11 là mất đoạn phổ biến nhất ở các khối u NBTK tiên phát và là một dấu ấn cho tiên lượng xấu

của bệnh độc lập với khuếch đại gen MYCN [70]

Gần đây, đã có một số bằng chứng cho thấy sự mất đoạn 11q23.3 dẫn

đến sự vắng mặt của gen H2AFX, một gen góp phần làm thay đổi tính ổn định

của hệ gen cũng như tăng cường sự nhạy cảm với ung thư trên chuột [43]

1.3.2.4 Mất đoạn nhiễm sắc thể số 14

Mất đoạn cánh dài nhiễm sắc thể số 14 cũng là một biến đổi hay gặp trong các khối u NBTK [82] Theo nghiên cứu mới nhất trên 372 khối u tiên phát, 22% số ca có mất đoạn 14q tại vị trí 14q23-qter Đồng thời nghiên cứu này cũng cho thấy sự liên hệ chặt chẽ giữa mất đoạn 11q với mất đoạn 14q trên

các ca bệnh không có khuếch đại gen MYCN ở tất cả các nhóm nguy cơ [38] Mặt khác, vị trí 14q23 là vị trí của gen MAX, một gen có thể dẫn đến sự biểu hiện quá mức gen MYCN gặp ở các khối u NBTK ác tính khi không được biểu

hiện do mất đoạn 14q23 [68]

1.3.3 Khuếch đại gen MYCN

Sự khuếch đại gen được định nghĩa là sự gia tăng số lượng bản sao của một gen trên nhiễm sắc thể Khuếch đại gen, đặc biệt là các gen tiền ung thư, tham gia trực tiếp vào quá trình phát triển cũng như khả năng kháng thuốc của

khối u Ví dụ, khuếch đại gen MYC (MYCN), EGFR, MDM2… gắn liền với các khối u có độ ác tính cao [55] Còn khuếch đại các gen DHFR, TYMS hoặc MET

Khi gen MYCN bị đột biến và sao chép thành rất nhiều bản sao, các bản sao này

kết hợp với nhau thành các cấu trúc vòng ngoài bộ nhiễm sắc thể hay các DM Trong một vài trường hợp, các đoạn này lại hợp nhất trên một nhiễm sắc thể để tạo thành HSR Có một thực tế là ở các khối u nguyên phát, HSR hiếm gặp hơn

so với DM, nhưng nguyên nhân thì vẫn chưa sáng tỏ [34, 54] Trạng thái biểu

hiện của MYCN là một đặc điểm ổn định trong hệ gen u NBTK, và số lượng

bản sao gen này là không thay đổi trong quá trình phát triển của khối u, giữa các vùng khác nhau của khối u, cũng như giữa khối u tiên phát và các khối di căn

Khoảng 70% bệnh nhân u NBTK không khuếch đại gen MYCN có thời

gian sống không bệnh lên đến 18 tháng, trong khi đó con số này ở nhóm có

3-10 bản sao và nhóm có hơn 3-10 bản sao lần lượt là 30% và 5% [58] Đồng thời, khuếch đại gen cho thấy khả năng điều trị không thành công ngay cả ở giai

đoạn sớm Ngược lại, gen MYCN không đột biến lại gặp ở nhóm bệnh nhân giai

đoạn 3 và 4 có cơ hội điều trị thành công

1.3.3.1 Cấu trúc và chức năng của gen MYCN

MYCN là một gen tiền ung thư được biểu hiện bình thường trong sự phát

triển của hệ thống thần kinh và một vài mô nhất định khác MYCN là tên viết tắt của v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived

homolog, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 2, ở vị trí 2p24 (Hình 1.2)

32

Hình 1.2 Vị trí gen MYCN trên nhiễm sắc thể số 2 Gen MYCN nằm nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 2, ở vị trí 2p24, từ cặp

bazơ nitơ 15,940,438 tới 15,947,007

Gen này gồm có 3 exon, trong đó exon 1 không có chức năng mã hóa, 2 exon còn lại mã hóa cho protein mycN có kích thước 60kDa (464 acid amin) [20]

Gen MYCN được biểu hiện ở giai đoạn tiền làm tổ và giữ vai trò thiết

yếu trong sự phát triển hoàn toàn của hệ thống thần kinh: điều hòa sự tăng sinh các tế bào tiền thân thần kinh, tăng kích thước nhân và biệt hóa tế bào Để protein mycN có thể hoạt hóa phiên mã, nó cần phải dimer hóa với protein max, tạo nên phức heterodimer Ở trạng thái nghỉ của tế bào (G0), protein max được biểu hiện mạnh và ưu thế, hình thành các dimer đồng nhất (homodimer) để ức

chế quá trình phiên mã Khi số lượng sản phẩm MYCN tăng lên, như lúc đi vào

chu trình tế bào hoặc do kết quả của sự khuếch đại gen, sự dimer hóa không đồng nhất giữa mycN và max diễn ra Phức hợp heterodimer mycN-max đóng vai trò là chất hoạt hóa sự phiên mã một chuỗi các gen thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào (Hình 1.3) [62, 90]

Nguồn: [21]

33

Hình 1.3 Mô hình tương tác của protein mycN với các protein khác Khuếch đại gen MYCN dẫn tới tăng số lượng protein mycN Quá trình dimer hóa không đồng nhất giữa mycN với max chiếm ưu thế, dẫn đến hoạt hóa phiên mã các gen đích khi có sự tương tác giữa phức hệ mycN/max với vị trí

promoter thông qua một mô hình hộp E (CACGTG) [95]

Vai trò gây ung thư của MYCN đã và đang được nghiên cứu sâu rộng Trong bệnh u NBTK, khuếch đại gen MYCN (từ 50 đến 400 bản sao trong một

tế bào) thường đi kèm với các khối u giai đoạn muộn, ác tính cao [110] Khi biểu hiện có điều kiện gen này trong các dòng tế bào u NBTK nuôi cấy, tỷ lệ phát triển và khả năng di căn của các tế bào ung thư tăng lên đáng kể, tổng hợp DNA cũng tăng và sự thoát ra khỏi chu trình tế bào cũng như sự biệt hóa tế bào thần kinh bị ngăn chặn [34]

1.3.3.2 Các gen khác khuếch đại cùng MYCN

Vùng khuếch đại trên nhiễm sắc thể số 2 có kích thước thay đổi, dao động từ 100 kb đến 1 Mb, nhưng đều có chung một vùng lõi cố định có kích

thước 100-200 kb chứa gen MYCN Điều đó có nghĩa là có các gen khác nằm gần gen MYCN cũng được khuếch đại theo [38] Một trong số đó là DDX1, mã hóa cho RNA helicase, nằm cách MYCN khoảng 300-400kb (vị trí 2p24)

Nguồn: [94]

34

Khoảng 40-50% trường hợp khuếch đại gen MYCN có kèm khuếch đại gen

DDX1 [32]

Các nghiên cứu gần đây với các kỹ thuật cao hơn như kỹ thuật lai so sánh

hệ gen đã phát hiện 6 vùng nhiễm sắc thể khác trong hệ gen cũng được khuếch

đại ở các ca u NBTK có khuếch đại MYCN như MDM2 trên nhiễm sắc thể 12q13 và MYCL trên nhiễm sắc thể 1p32 [49]

Sự khuếch đại các gen trên không xảy ra độc lập mà luôn đi cùng với

khuếch đại gen MYCN và góp phần vào sự ác tính của khối u

1.3.3.3 Vai trò của khuếch đại gen MYCN

Khuếch đại gen MYCN gặp nhiều ở khối u NBTK nguyên phát trên các

bệnh nhân giai đoạn muộn và có kết quả điều trị thấp, cũng như ở các khối u tiến triển nhanh và có tiên lượng xấu Một nghiên cứu quy mô lớn với 3000 bệnh nhân ở Hoa Kỳ cho thấy khuếch đại gen gặp ở khoảng 22% số ca Đồng thời, tỷ lệ sống thêm toàn bộ của trẻ nhỏ có khối u di căn và khuếch đại gen chỉ

là 10% (Hình 1.4) [26] Kết quả nghiên cứu này cho thấy khi khuếch đại MYCN

xảy ra càng muộn, kết quả điều trị càng thấp và ngược lại

gen, ở nhóm có mang đột biến khuếch đại gen chỉ là 10% [26]

Ở một nghiên cứu khác của châu Âu, tỷ lệ sống không bệnh sau 2 năm ở

trẻ nhỏ mang khối u di căn có kèm khuếch đại gen MYCN là khoảng 29% (Hình

36

Hình 1.5 Tỷ lệ sống chung và sống không bệnh của bệnh nhân có khối u di

căn kèm khuếch đại gen MYCN Thời gian sống không bệnh trong 2 năm của 35 bệnh nhân u NBTK có khuếch

đại gen chỉ là 29% với phác đồ điều trị nguy cơ cao [30]

Ngoài khối u NBTK, sự khuếch đại gen MYCN có vai trò sinh ung thư

trong nhiều loại ung thư khác, gồm cả ung thư người lớn và trẻ em, như các khối u buồng trứng giai đoạn muộn, ung thư phổi tế bào nhỏ, sarcoma cơ vân

[34] Đặc biệt, khuếch đại họ gen MYC, gồm MYCN và c-MYC, đã được chứng

minh là có liên quan đến việc hình thành khối u nguyên bào tủy trẻ em Khuếch

đại gen MYCN, gặp ở 10% số bệnh nhân, đi kèm với kết quả điều trị kém giống

u NBTK [24]

1.3.4 Sự biến đổi biểu hiện gen trong bệnh u nguyên bào thần kinh

1.3.4.1 Con đường tín hiệu neurotrophin

Các NBTK giao cảm nhận tín hiệu biến đổi ác tính thành các tế bào u NBTK qua con đường tín hiệu neurotrophin, được điều hòa thông qua họ tyrosine kinase, gồm TrkA, TrkB và TrkC [40]

Sự biểu hiện khác nhau của các thụ thể neurotrophin có sự liên quan chặt

Nguồn: [31]