Nghiên cứu một số biến đổi di truyền ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho người lớn tại BV bạch mai giai đoạn 2012 2014

Những biến đổi di truyền này cùng với các yếu tố nguy cơ có liên quan đến phân loại, hướng điều trị, kết quả điều trị và chỉ định ghép tế bào gốc cho bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho..

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lơ xê mi (LXM) cấp là một trong các bệnh lý ác tính nhất của hệ tạo

máu, bao gồm lơ xê mi cấp dòng tủy và lơ xê mi cấp dòng lympho Bệnh

thường tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong cao Tại Mỹ, số người mắc bệnh là

20000 ca và 10000 ca tử vong hàng năm

Trước đây, việc chẩn đoán và phân loại lơ xê mi cấp chủ yếu dựa trên

phương pháp hình thái học và nhuộm hóa học tế bào theo FAB ( French –

American – British) Ngày nay, với sự ra đời của máy đếm tế bào dòng chảy

(Flow Cytometry) đã phân loại được các phụ nhóm như lơ xê mi cấp dòng

lympho tế bào B và lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào T Từ năm 2001 Tổ

chức y tế thế giới (WHO) đã phân loại lơ xê mi cấp dựa trên các biến đổi di

truyền và đến năm 2008 phân loại theo di truyền đã được cải tiến và bổ sung

Sự phát hiện và nghiên cứu các biến đổi di truyền đã góp phần rất lớn trong

việc tiên lượng và điều trị cho các bệnh nhân lơ xê mi cấp

Lơ xê mi cấp dòng lympho đặc trưng bằng sự tăng sinh ác tính của các tế

bào tiền thân dòng lympho, có thể có các biến đổi di truyền, dẫn đến sự lấn át

các dòng tế bào khác và rối loạn quá trình sinh máu của cơ thể Lơ xê mi cấp

dòng lympho chiếm khoảng 1% trong số ung thư người lớn và khoảng 25%

ung thư ở trẻ em Lơ xê mi cấp dòng lympho tế bào B chiếm khoảng 88% các

trường hợp[1] Khoảng 60-70% lơ xê mi cấp dòng lympho có các biến đổi di

truyền [2] Các biến đổi di truyền ở lơ xê mi cấp lympho tế bào B có tỷ lệ cao

hơn lơ xê mi cấp lympho tế bào T Những biến đổi di truyền này cùng với các

yếu tố nguy cơ có liên quan đến phân loại, hướng điều trị, kết quả điều trị và

chỉ định ghép tế bào gốc cho bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi di truyền ở bệnh nhân

lơ xê mi cấp dòng lympho Tuy nhiên ở Việt Nam việc ứng dụng các kỹ thuật

Style Definition: TOC 2: Font: (Default) Times New

Roman, 14 pt, Bold, Do not check spelling or grammar, Indent: Left: 0", Space After: 0 pt, Line spacing: Multiple 1.4 li, Tab stops: 6.1", Right,Leader: …

di truyền trong chẩn đoán và điều trị LXM nói chung còn rất hạn chế Trước đây, có những nghiên cứu di truyền về phát hiện Ph1 trong LXM kinh dòng bạch cầu hạt nhưng cũng chỉ dừng ở mức đối tượng nghiên cứu nhỏ mà chưa

áp dụng thường quy, riêng các nghiên cứu di truyền ở bệnh LXM cấp dòng

lympho còn ít hơn nữa Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số biến đổi di truyền ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2012-2014” với mục tiêu sau:

1 Phân tích một số bất thường nhiễm sắc thể và biến đổi gen ABL/BCR, TEL/AML1, MLL/AF4, E2A/PBX1 ở bệnh nhân lơ

xê mi cấp dòng lympho

2 Bước đầu đánh giá kết quả điều trị ở bệnh nhân được phát hiện

có bất thường di truyền

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO

1.1.1 Khái niệm

Lơ xê mi cấp không phải là một bệnh đơn thuần mà là một nhóm bệnh

đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích lũy trong tủy xương và máu ngoại vi những

tế bào tạo máu chưa trưởng thành, ác tính Những tế bào này sẽ dần thay thế

và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào máu bình

thường trong tủy xương [3]

Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) là bệnh lý ác tính do bất thường

nhiễm sắc thể ở tế bào tiền thân dòng lympho B hoặc T ở các giai đoạn phát

triển riêng lẻ Sự tăng sinh và tích tụ Blast (tế bào bất thường) ở tủy xương

dẫn đến ức chế sự tạo máu và thâm nhiễm nhiều cơ quan khác nhất là màng

não, tuyến sinh dục, tuyến ức, gan lách và hạch bạch huyết [4]

Hình 1.1 Sơ đồ biệt hóa tế bào gốc tạo máu

(Chú thích: hematopoietic stem cell - tế bào gốc tạo máu, multipotential stem cell

– tế bào nguồn sinh máu đa năng, lymphoid progenitor cell – tế bào nguồn sinh máu định

hướng dòng lympho, myeloid progenitor cell – tế bào nguồn sinh máu định hướng dòng

tủy, NK cell – tế bào NK, B lymphocyte – tế bào lymphoB, T lymphocyte – tế bào

lymphoT, neutrophil – bạch cầu hạt trung tính, eosinophil – bạch cầu ưa acid, basophil –

bạch cầu ưa bazơ, platelet – tiểu cầu, monocyte – bạch cầu mono, macrophage – đại thực

bào, red blood cell – hồng cầu)

Formatted: 3 Formatted: Indent: First line: 0.39"

Tuổi trung bình của bệnh nhân khi được chẩn đoán là 14 tuổi, có tới 60%

bệnh nhân được chẩn đoán dưới 20 tuổi, 24% bệnh nhân chẩn đoán ở tuổi 45

hoặc hơn, chỉ 11% bệnh nhân được chẩn đoán từ 65 tuổi [5]

1.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh lơ xê mi cấp

Bệnh lơ xê mi cấp được ghi nhận lần đầu tiên năm 1827 bởi Velpeau

Năm 1845, Bennett đặt tên cho bệnh là Leucocythemia (tăng bạch cầu) Sau

đó Virchow đặt tên bệnh là White blood (máu trắng) và cuối cùng chính ông

đã đặt tên bệnh Leukemia (tiếng Hy Lạp nghĩa là máu trắng) được sử dụng

đến tận ngày nay[6],[7],-[8]

Những bệnh nhân đầu tiên được ghi nhận là số lượng bạch cầu tăng cao,

phù hợp bệnh cảnh ung thư máu mạn tính Năm 1889 Ebstein đặt ra thuật ngữ

lơ xê mi cấp (acute leukemia) để mô tả tình trạng bệnh tiến triển cấp tính và

không đáp ứng với các phương pháp điều trị Thực chất hai dạng bệnh này

không chỉ khác nhau về tiến triển cấp tính hay mạn tính mà còn khác nhau về:

biến đổi gen, đặc điểm tế bào ung thư, phương pháp điều trị và tiên lượng

bệnh Đến năm 1990, các cụm từ dòng tủy và dòng lympho được sử dụng để

phân loại lơ xê mi cấp [9],[10]

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh

Phần lớn không rõ nguyên nhân, nhiều yếu tố được gợi ý như virus, tia

xạ, chất độc nhưng chưa có bằng chứng xác nhận Tuy nhiên, quan niệm về

mối tác động qua lại giữa các yếu tố di truyền và môi trường cần được khẳng

định bởi các nghiên cứu về quần thể và dịch tễ học phân tử

1.1.3.1 Yếu tố di truyền

- Yếu tố gia đình: khả năng mắc bệnh cao gấp 3 lần ở những đứa con có

bố hoặc mẹ mắc bệnh lơ xê mi cấp Trong 2 trẻ sinh đôi cùng trứng nếu 1 trẻ

mắc bệnh thì khả năng mắc bệnh của trẻ thứ 2 là 15% và thường xảy ra dưới 2

tuổi [11], [12]

Formatted: Indent: First line: 0.39"

- Bệnh di truyền: tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp trong nhóm các bệnh di truyền như Down, Klinefelter….cao hơn so với nhóm bệnh không di truyền

1.1.3.2 Yếu tố môi trường

Sự tiếp xúc với tia xạ, chất hóa học cũng liên quan đến sự phát triển bệnh lơ xê mi cấp

- Tia xạ: tỷ lệ mắc bệnh trong nhóm nạn nhân sống sót sau vụ nổ bom hạt nhân tại Hirosima và Nagazaki cao gấp 20 lần so với nhóm chứng Tiếp xúc với cường độ trung bình cũng liên quan đến sự phát triển bệnh Trẻ em sống gần những nhà máy điện nguyên tử có tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp cao hơn so với nhóm trẻ em khác Các bức xạ ion cũng gây biến đổi gen tiền ung thư (proto oncogen) thành gen ung thư thực sự (oncogen) [7]

- Các chất hóa học: tỷ lệ mắc bệnh của công nhân trong các nhà máy cao

su, thuộc da thường xuyên tiếp xúc benzene cao hơn so với công nhân các ngành khác Hiện nay, lơ xê mi cấp liên quan đến điều trị hóa chất chiếm 10-15% tổng số lơ xê mi cấp Các thuốc chống ung thư thuộc nhóm ankylan, nitrosourea, procarbazin có khả năng gây ung thư thứ phát cao

1.1.3.3 Virus

Cho đến nay, các nhà huyết học trên thế giới chưa tìm ra được bằng chứng xác nhận mối liên quan trực tiếp giữa bệnh lơ xê mi cấp và virus Tuy nhiên hiện nay có những bằng chứng xác nhận mối liên quan gián tiếp giữa

lơ xê mi cấp và virus: giữa HTLV1 (human T cell leukemia virus 1) và bệnh

lơ xê mi cấp hay u lympho tế bào T [13]

1.1.4 Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho

a Lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng của bệnh lơ xê mi cấp thường không đặc hiệu và liên quan đến quá trình giảm sinh các dòng tế bào máu do sự tăng sinh của các tế bào non ác tính và sự thâm nhiễm của các tế bào này vào các cơ quan Biểu hiện

qua các hội chứng: thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng, thâm nhiễm (gan to, hạch to, lách to, phì đại lợi, tổn thương da, liệt mặt, sụp mí mắt…) [14], [15]

b Cận lâm sàng

- Huyết đồ: đa số các trường hợp thể hiện tình trạng giảm 3 dòng máu ngoại vi và sự xuất hiện tế bào non trong công thức bạch cầu Số lượng bạch cầu

có thể dao động từ dưới 1G/L hoặc tăng cao Theo thống kê của tác giả Tây Đức

về bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho thì số lượng bạch cầu cao trong 59%, bình thường 14%, giảm 27% và trên 90% bệnh nhân có tế bào non ác tính trong công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu dưới 25 G/L gặp trong 30% các trường hợp

- Tủy đồ: Dịch tủy được sử dụng trong các xét nghiệm hình thái học tế bào, hóa học tế bào, miễn dịch tế bào, di truyền tế bào

Tủy đồ bệnh nhân lơ xê mi cấp cho thấy tủy giàu tế bào trừ một số trường hợp thứ phát tủy nghèo tế bào hoặc mật độ bình thường Theo tiêu chuẩn FAB 1986 chẩn đoán xác định lơ xê mi cấp khi tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy chiếm từ 30% tế bào có nhân trong tủy Năm 2001 WHO đưa ra tiêu chuẩn mới về chẩn đoán lơ xê mi cấp khi tỷ lệ tế bào non ác tính từ 20% tế bào có nhân trong tủy [16]

- Sinh thiết tủy xương: chỉ định khi không đủ tiêu chuẩn chẩn đoán lơ xê

mi cấp khi tủy nghèo tế bào Sinh thiết tủy xương cho biết mật độ tế bào tạo máu trong tủy, có hay không có tình trạng xâm lấn tủy, tình trạng xơ

- Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho dựa vào các phương pháp hóa học tế bào, miễn dịch tế bào và di truyền

1.1.5 Các phương pháp phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho

1.1.5.1 Phương pháp hình thái học

Phương pháp hình thái học là phương pháp đầu tiên và căn bản nhất để chẩn đoán và phân loại Lơ xê mi cấp nói chung Từ năm 1970, các nhà khoa học đã thống nhất đưa ra nhiều hệ thống phân loại, trong đó hệ thống phân

loại FAB 1976 được áp dụng rộng rãi hơn cả [17] Mặc dù, sau này có rất nhiều phương pháp phân loại nhưng hệ thống phân loại FAB (1976) vẫn đóng vai trò quan trọng bởi tính thuận tiện, dễ áp dụng rộng rãi ở những khu vực có trình độ khoa học đang phát triển như Việt Nam [18]

Theo phân loại FAB (1976) chẩn đoán lơ xê mi cấp khi tỷ lệ tế bào non

ác tính ≥30% tế bào có nhân trong tủy Trong hệ thống phân loại này, việc phân biệt các thể lơ xê mi cấp chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái và kết quả nhuộm hóa học tế bào [18] Theo đó, lơ xê mi cấp dòng lympho được chia làm 3 dưới nhóm (L1, L2, L3) [19]

- L1: các tế bào bất thường có kích thước nhỏ, tương đối đồng đều, nhân mịn

- L2: các tế bào bất thường kích thước lớn, không đồng đều, nhân thô, thường có hạt nhân to, rõ, nguyên sinh chất rộng vừa, ưa bazơ

- L3: các tế bào bất thường có kích thước lớn, nhân lớn, lưới màu thô, nguyên sinh chất rộng có hốc chế tiết, ưa bazơ vừa

1.1.5.2 Các phương pháp nhuộm hóa học tế bào

Các phương pháp nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã được sử dụng để hỗ trợ hình thái học trong chẩn đoán các thể lơ xê mi cấp Một số phương pháp nhuộm hóa học tế bào chủ yếu được áp dụng trong thực hành lâm sàng [20]

- Nhuộm peroxidase: Enzym peroxidase trong cơ thể người thường gặp trong gan, thận và trong các hạt dòng tủy và mono Phản ứng thường dương tính ở tế bào dòng tủy và mức độ tăng lên tùy theo giai đoạn trưởng thành Các tế bào dòng mono có thể dương tính ở mức độ thấp hơn còn các dòng khác hoàn toàn âm tính

- Nhuộm Sudan đen B: Sudan đen B là chất tan trong lipid, nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào Phản ứng dương tính với các hạt trong bạch

cầu hạt, mức độ tăng lên với mức độ trưởng thành trong tế bào Bạch cầu mono có thể dương tính tùy mức độ còn lympho âm tính

- Nhuộm Esterase: một số loại esterase được dùng để phân biệt bạch cầu hạt trung tính và các độ tuổi của dòng bạch cầu mono NASDCA là cơ chất để nhận biết các esterase có trong tế bào hạt, tiền mono và mono trưởng thành, monoblast thường âm tính Ngược lại các esterase không đặc hiệu lại dùng để nhận biết bạch cầu mono Nhuộm esterase đặc hiệu và không đặc hiệu đều âm tính dòng lympho

- Nhuộm PAS: phản ứng PAS dương tính chỉ ra sự có mặt của các glycogen- là một polymer của glucose cũng như các carbohydrate chứa nhóm chức 1,2-glycol khác PAS thường âm tính các tế bào dòng hạt và mono để phân biệt các tế bào non dòng lympho có biểu hiện dương tính dạng hạt, cục

- Nhuộm Phosphatase kiềm: Phosphatase kiềm là một enzyme rất phổ biến trong các mô của động vật có vú Chúng có tác dụng giải phóng gốc phosphate ra khỏi phosphate hữu cơ Có hai loại Phosphatase kiềm và Phosphatase acid Các tế bào bạch cầu hầu hết đều biểu lộ hoạt tính phosphatase acid ở các mức độ khác nhau, mono có phản ứng mạnh hơn bạch cầu trung tính Lympho T có mức độ dương tính mạnh ở khu vực bộ máy Goolgi còn lympho B chỉ dương tính nhẹ hoặc âm tính và đây là đặc điểm để phân loại trong lơ xê mi cấp dòng lympho

Như vậy, bằng phương pháp nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho khi tế bào bất thường dương tính với PAS và âm tính với phương pháp nhuộm peroxidase, sudan đen B, esterase đặc hiệu và không đặc hiệu

Bảng 1.1 Phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho theo FAB 1986

Sudan Ester PAS

-Tế bào Blast nhỏ, chiếm trên 50%

-Tỷ lệ nhân/nguyên sinh chất cao

-Không có hoặc có hạt nhân nhỏ

(>75% blast)

-Màng nhân đều đặn >75%blast Nói

chung có sự tăng sinh đồng nhất

-Chất nhiễm sắc đậm đặc

Âm tính

Âm tính +++

-Tế bào blast đa dạng hơn, kích

thước to nhỏ không đều

-Tỷ lệ nhân/nguyên sinh chất thấp,

nhiều nguyên sinh chất hơn

-Thấy rõ hạt nhân >25% tế bào

Âm tính +++

Âm tính +++

Hình 1.2 Lơ xê mi cấp dòng lympho thể L1 (vật kính 100)

Hình 1.3 Lơ xê mi cấp dòng lympho thể L2 (vật kính 100)

Hình 1.4 Lơ xê mi cấp dòng lympho thể L3 (vật kính 100)

1.1.5.3 Phương pháp phân loại miễn dịch

Phương pháp phân loại miễn dịch đã được nghiên cứu ứng dụng trong lơ

xê mi cấp từ năm 1970 Từ đó đến nay, phương pháp này không ngừng được cải tiến, từ phân loại miễn dịch trên kính hiển vi huỳnh quang đến phân loại bằng máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry)

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, gián tiếp có nhược điểm là phụ thuộc kỹ thuật làm, người đọc và chỉ phân tích đơn lẻ từng dấu ấn [21]

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy đã thể hiện được những ưu điểm vượt trội Kỹ thuật này không những có thể phân tích một số lượng lớn tế bào mà còn có thể phân tích nhiều dấu ấn miễn dịch khác nhau trên cùng một quần thể tế bào

và cho kết quả nhanh, dễ định lượng và có thể áp dụng để theo dõi bệnh tồn

dư tối thiểu [22]

Phân loại dấu ấn miễn dịch dòng lympho B và T: cách phân loại này được WHO đưa ra năm 2001 khi nhận thấy phân loại theo hình thái không đưa lại hiệu quả cao trong tiên lượng bệnh và đưa ra tiêu chí phân loại dựa vào các dấu ấn miễn dịch

- Các dấu ấn của tế bào lympho B: CD19, CD20, CD22, CD79a, CD10

- Các dấu ấn của tế bào lympho T: CD2, CD3, CD7

Bảng 1.2: Các dấu ấn miễn dịch trên tế bào lympho [13]

- Tế bào dòng lympho B: dấu ấn có tính ổn định từ đầu dòng đến cuối dòng là CD 79a Lơ xê mi cấp dòng lympho B chia thành 4 dưới nhóm, ngày nay nhóm tế bào B trưởng thành xếp vào Burkitt lymphoma [23]

- Ngoài ra các dấu ấn miễn dịch còn để chẩn đoán một số thể lơ xê mi cấp khác nữa là lơ xê mi cấp tế bào NK, lơ xê mi cấp lai tủy-lympho [24]

- Khi tiến hành phân loại các dấu ấn miễn dịch cũng cho thấy rằng, tỷ lệ bất thường dòng lympho B chiếm 70-75% và tiên lượng lơ xê mi cấp dòng lympho B tốt hơn lymphoT [25]

1.1.5.4 Phương pháp di truyền tế bào – sinh học phân tử

Theo WHO (2008) một số bất thường di truyền có thể được sử dụng để chẩn đoán lơ xe mi cấp mà không cần đủ tiêu chuẩn tế bào blast 20% trong tủy xương [26]

Khi nghiên cứu về lơ xê mi cấp dòng lympho có rất nhiều các bất thường

di truyền được ghi nhận Các bất thường này có ý nghĩa rất lớn trong việc tiên lượng bệnh nhân [27]

Bảng 1.3: Các biến đổi di truyền và tiên lượng trong lơ xê mi cấp dòng

lympho [28] [13]

Tốt Trên lưỡng bội: >50 NST (Hight Hyperploid)

Chuyển đoạn t(12;21) và gen lai TEL/AML1

Trung bình

Trên lưỡng bội: 47-50 NST (Hyperploid)

Bộ NST bình thường Chuyển đoạn t(1;19) và gen lai E2A/PBX1

Xấu

Dưới lưỡng bội (Hypoploid), mất NST Chuyển đoạn t(9;22) và gen lai ABL/BCR Chuyển đoạn t(11q23), t(4;11)

Chuyển đoạn t(5;14) và gen lai IL3-IGH

Các bất thường di truyền được ghi nhận 80-90% lơ xê mi cấp lympho B,

vì có giá trị cao trong tiên lượng bệnh nên tổ chức y tế thế giới (WHO) đã sử dụng các bất thường di truyền để phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho B [28] [29] Với dòng lympho T, các bất thường di truyền ghi nhận 50-60% các trường hợp và các bất thường này không có giá trị cao trong tiên lượng bệnh nên WHO không đề cao vai trò các bất thường di truyền trong phân loại lơ xê

mi cấp lympho T [13] [30]

Theo phân loại WHO 2008 đã đề xuất phân loại lơ xê mi cấp lympho (cả

u lympho) tế bào B thành các dưới nhóm sau:

- Dưới nhóm t(9;22)(q34;q11) và gen lai ABL/BCR

- Dưới nhóm có t(v;11q23) và bất thường gen MLL (variant: các nhiễm sắc thể khác nhau)

- Dưới nhóm có t(12;21) và gen lai TEL-AML1 (còn gọi RUNK1)

ETV6 Dưới nhóm có t(1;19) và gen lai E2AETV6 PBX1

- Dưới nhóm có t(5;14)(q31;q32) và gen lai IL3-IGH

- Dưới nhóm có trên lưỡng bội NST

- Dưới nhóm có dưới lưỡng bội NST

Ngoài ra, mỗi loại bất thường di truyền thường có các đặc điểm miễn dịch và hình thái học đặc trưng [31] Theo phân loại miễn dịch chia lơ xê mi lympho thành 3 dưới nhóm là: tiền B, B trưởng thành và tế bào T [14] [32] Theo Thomson bất thường liên quan tới gen E2A thường gặp lơ xê mi cấp thể tiền B, nhất là ở trẻ em.Trong số các bất thường liên quan gen này thì chuyển đoạn t(1;19) tạo ra gen lai E2A-PBX1 là hay gặp nhất- những bệnh nhân này thường có tiên lượng xấu còn chuyển đoạn t (1;14) tạo gen lai TAL1-SCL hay gặp trong lơ xê mi cấp thể tế bào T [33]

Trong lơ xê mi cấp dòng lympho thể nguyên bào lympho thường gặp nhất Trong nhóm này có tới 30% có chuyển đoạn t(9;22) [34], [35] Phân tích gen cho thấy có gen lai gen ABL/BCR

1.1.6 Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho

Mục đích chính trong điều trị lơ xê mi cấp là đạt được và duy trì tình trạng lui bệnh hoàn toàn Việc điều trị tốt bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho đòi hỏi nhiều khía cạnh gồm điều trị nâng đỡ, điều trị đặc hiệu và điều trị dự phòng các biến chứng Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật kết quả điều trị ngày càng tốt nhờ các phương pháp hóa trị liệu, ghép tế bào gốc, điều trị nhắm đích

Các hóa chất trong điều trị lơ xê mi cấp đa phần không đặc hiệu, tác động vào các tế bào ác tính và lành tính nên gây ra nhiều biến chứng khi điều trị mà hiệu quả không cao Sự phát triển của di truyền, sinh học phân tử đã góp phần hiểu rõ cơ chế bệnh sinh và tìm được ra các thuốc điều trị nhắm đích Ví dụ Imatinid (gleevec) trong điều trị lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt

có chuyển đoạn ABL/BCR, Rituximab là kháng thể đơn dòng điều trị u lympho non Hodgkin tế bào B có CD20 dương tính

Về điều trị đặc hiệu lơ xê mi cấp lympho nói chung gồm 4 giai đoạn: điều trị tấn công, điều trị củng cố và tăng cường, điều trị hệ thần kinh trung ương và điều trị duy trì Lơ xê mi cấp lympho là nhóm bệnh lý đa dạng, có nhiều dưới nhóm khác nhau nên phác đồ thuần nhất để điều trị không còn phù hợp Hiện nay, có rất nhiều phác đồ điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho Phác đồ BFM/COG gồm 4 thuốc chính là vincristine, anthracyclin, cortisteroid, L-asparaginase [36] Phác đồ CALGB gồm 4 thuốc trên và thêm cyclophosphamid [37] Phác đồ Hyper-CVAD được cho ít tác dụng phụ hơn phác đồ CALGB, gồm 8 đợt điều tri: course A (vincristine, cyclophosphamid, dexamethasone, doxorubicin) và course B (liều cao methotrexate và cytarabin)[38]

- Course A:

+ Cyclophosphamid: 300 mg/ m2da X 2 lần/ ngày, từ ngày 1-3

+ Mesna: 300 mg/ m2da trước truyền cyclophosphamid 1 giờ, từ ngày 1-3 + Doxorubicin: 50 mg/ m2da, ngày thứ 4

+ Vincristin: 2mg/ m2da, ngày thứ 4, 11

+ Dexamethasone: 40 mg/ m2da, ngày thứ 1-4 và 11-14

- Course B: điều trị sau course A 21 ngày và khi số lượng bạch cầu trung tính > 1G/L, số lượng tiểu cầu > 50G/L

+ Methotrexate: 1g/ m2da, ngày thứ 1

+ Cytarabine: 3000 mg/ m2da X 2 lần/ ngày, ngày thứ 2, 3

+ Calcifolinat: 100 mg/ m2da, ngày thứ 2, 3

Tổng 6-8 đợt cho cả course A và B Với bệnh nhân có Ph1 dương tính, dùng Imatinib 400 mg/ ngày, từ ngày 1-14

Trong những thập niên trước việc phát hiện nhóm thuốc điều trị nhắm đích

đã góp phần cải thiện kết quả điều trị bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho theo các dưới nhóm Bệnh nhân có gen ABL/BCR lựa chọn chất ức chế tyrosine kinase (Imatinib) để điều trị [39], dùng kháng thể đơn dòng CD20 đối với ALL phân nhóm B trưởng thành có CD20 dương tính [40] hay thêm nelarabine điều trị ALL nhóm lympho T tái phát [41]

Giai đoạn điều trị duy trì thường sử dụng 2 thuốc là 6 mercaptopurin và methotrexat, thời gian kéo dài 24-36 tháng

Điều trị tái tấn công sử dụng các thuốc giống như điều trị tấn công và một số thuốc khác như methotrexat liều cao, ara-C, etoposid, 6MP hoặc ghép tủy Hiện nay, ghép tế bào gốc là phương pháp ưu tiên chọn lựa với người lớn

và trẻ em bị lơ xê mi cấp có Ph1 dương tính và những bệnh nhân hóa trị kéo dài để đạt được lui bệnh hoàn toàn

Bảng 1.4 Hệ thống phân loại nguy cơ với lơ xê mi cấp lympho ghép tế bào

gốc [42]

Thấp

Loại tế bào tiền thân lymphoB

Tuổi từ 1 đến 9 và số lượng bạch cầu >50G/L

Trên lưỡng bội >50NST hoặc có gen ETV- CBFA2

Chuyển đoạn t(9;22) với bạch cầu >25G/L

Đáp ứng sớm kém, tái sắp xếp gen MLL với tuổi >12 tháng hoặc điều trị tấn công thất bại

Trong điều trị lơ xê mi cấp lympho, những bệnh nhân có biểu hiện thâm nhiễm thần kinh trung ương được nhiều tác giả quan tâm Điều trị dự phòng bằng tiêm trực tiếp methotrexat vào tủy sống hoặc tia xạ sọ não liều thấp 1200 cGy để tránh sự thâm nhiễm thần kinh trung ương ngay cả ở bệnh nhân có nguy cơ cao (LXM cấp lympho tế bào T hoặc số lượng bạch cầu >100 G/L) Khi bệnh nhân đã có biểu hiện thâm nhiễm thần kinh trung ương biểu hiện bằng các dấu hiệu thần kinh và tế bào non ác tính trong dịch não tủy, bệnh nhân sẽ được tiêm phối hợp methotrexat, ara-C và solumedrol vào tủy sống

1.2 CÁC BẤT THƯỜNG DI TRUYỀN Ở LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO 1.2.1 Các bất thường di truyền ở lơ xê mi cấp dòng lympho B

- Trên lưỡng bội trên 50 NST: loại bất thường này gặp 25-30% LXMc ở trẻ em Các nhóm NST thường gặp thêm là NST số 2, 3, 4, 10, 18, có tiên lượng tốt Tuy nhiên, nếu đi kèm các chuyển đoạn khác thì bệnh chỉ tiên lượng ở mức độ trung bình [43], [44]

- Trên lưỡng bội từ 47-50 NST: nhóm các nhiễm sắc thể hay thêm là 8,

13, 21 Không có nhiều khác biệt về đặc điểm lâm sàng, hình thái, miễn dịch

so với nhóm trên 50 nhiễm sắc thể nhưng có thể tuổi cao hơn và số lượng bạch cầu máu ngoại vi tăng cao hơn [45], [46], [47], [13]

- Bộ nhiễm sắc thể bình thường: chiếm 30% trong số người trưởng thành Nhóm này có tiên lượng trung bình [13]

- Dưới lưỡng bội: có dưới 46 NST Nhóm này không có đặc điểm lâm sàng, hình thái, miễn dịch khác biệt [13]

- Các bất thường về cấu trúc: gặp khoảng 55% ở người trưởng thành Hiệu quả điều trị tùy thuộc loại đột biến khác nhau[13]

1.2.1.1 Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11) và gen lai ABL/BCR

Là chuyển đoạn gen ABL (albenson) trên NST 9q34 và BCR (breakpoint cluster region) trên NST 22q11 Chuyển đoạn này thường gặp bệnh nhân bạch cầu kinh dòng hạt Tuy nhiên khi nghiên cứu bằng kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng khuyếch đại gen- PCR, lai tại chỗ huỳnh quang- FISH, cho thấy dạng đột biến này hay gặp ở lơ xê mi cấp trẻ em và 1/2 người lớn có tiền sử

lơ xê mi kinh có điểm đứt gãy BCR Trong lơ xê mi kinh dòng hạt phân tử chuyển đoạn có kích thước 210 kD, là sản phẩm điểm đứt gãy chính Điểm đứt gãy chính gồm 5 exon từ b1-b5, tương ứng với exon 12-16 của BCR gen Trong vùng Major điểm đứt gãy thường ở giữa b2-b3 hay b3-b4 Trong lơ xê

mi cấp lympho, phân tử chuyển đoạn tạo ra protein có kích thước 190 kD, là

sản phẩm điểm đứt gãy phụ [13], điểm này nằm ở khoảng giữa intron thứ nhất

của BCR gen Ở gen ABL cho dù là LXM kinh dòng bạch cầu hạt hay LXM

cấp lympho thì điểm đứt gãy thường ở intron thứ nhất của ABL gen Đoạn 11

trên cánh dài NST số 22 đứt ra, gắn vào cánh dài NST số 9 còn đoạn 34 trên

cánh dài NST số 9 đứt ra, gắn vào cánh dài NST số 22 NST số 22 bị đứt ở vị trí

băng 11 và chuyển đoạn tương hỗ với vị trí băng 34 của NST số 9

Hình 1.5 Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11)

Bệnh nhân có chuyển đoạn này có đặc điểm hình thái tế bào bất thường:

tế bào lớn, nhân to, thô, nguyên sinh chất có thể thấy hạt Về lâm sàng, bệnh

nhân có chuyển đoạn ABL/BCR thường lớn tuổi, số lượng bạch cầu nhiều,

hay thâm nhiễm nội tạng và hệ thần kinh trung ương [48] [49]

1.2.1.2 Chuyển đoạn t(4;11)(q21;q23) và gen lai MLL/AF4

Năm 1991 Ziemin-van và CS đã phát hiện gen MLL (Myeloid Lymphoid

Leukemia hoặc Mixed lineage leukemia) tại vị trí 11q23, gen này gồm ít nhất

12 exon[50] Nghiên cứu phân tử về MLL, Pui CH (2008) thấy rằng gen MLL

có thể có sự kết hợp đầu N trên gen MLL và đầu C trên 40 gen khác, tạo ra tổ

hợp gen mới [51], AF4 chứa khoảng 20 exon và mã hóa cho protein giàu

Formatted: Condensed by 0.2 pt

serine-proline Trong đó tổ hợp gen MLL/AF4 tạo ra sản phẩm là MLL protein, protein này thúc đẩy hoạt động phiên mã, dẫn đến sự hoạt động bất thường của gen HOX, gây tăng cao số lượng bạch cầu và tế bào bất thường Chuyển đoạn t(4;11) tạo ra ít nhất 10 dạng bảng mã khác nhau của gen MLL/AF4 đã được phát hiện do những điểm đứt gãy nằm trên các intron khác nhau và do hiện tượng ghép nối khác nhau

Chuyển đoạn này thường gặp ở trẻ em dưới 1 tuổi với tần suất 50-70%, người lớn là 5% Bệnh nhân có chuyển đoạn này thường có số lượng bạch cầu tăng cao và hay thâm nhiễm thần kinh trung ương [52] Tỷ lệ sống sót của nhóm này thấp [53] [54]

Hình 1.6: Hình chuyển đoạn t(4;11)(q21;q23) với gen MLL/AF4 1.2.1.3 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) và gen lai E2A/PBX1

Đây là một trong những chuyển đoạn hay gặp trẻ em Chuyển đoạn này

có thể cân bằng t(1;19)(q23;p13) hoặc không cân bằng der(19) (q23;p13) Kết quả của các chuyển đoạn này là sự hoạt động của gen kết thúc của gen E2A

trên NST 19p13 và gen PBX1 trên NST 1q23 [55] [56] [52] Tổ hợp gen E2A/PBX1 mã hóa cho yếu tố hoạt hóa phiên mã liên tục còn gọi là oncoprotein Từ đó làm tế bào tăng sinh quá mức không kiểm soát được Đối với gen E2A điểm đứt gãy xuất hiện một cách chuyên biệt ở vùng itron dài 3.5 kb giữa exon 13 và 14 Còn PBX1 điểm đứt gãy nằm rải rác ở vùng intron dài 50kb ở giữa exon 1 và 2 Bản mã thường gặp nhất là vị trí exon 13 của E2A và exon2 của PBX1

Hình 1.7: Chuyển đoạn t(1;19) và gen lai E2A/PBX1

Với chuyển đoạn này các tế bào bất thường không có nhiều đặc điểm hình thái khác biệt nhưng có đặc điểm dấu ấn miễn dịch có nhiều khác biệt: CD10, CD19 thường dương tính nhưng CD20 âm tính [13] Chuyển đoạn gen E2A/PBX1 có tiên lượng xấu [57]

1.2.1.4 Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) và gen lai TEL/AML1

Chuyển đoạn này không dễ phát hiện khi phân tích karyotypee vì kích thước nhiễm sắc thể thay đổi không đáng kể, thường được phát hiện bằng kỹ thuật PCR, FISH Chuyển đoạn này thường không gặp trên lưỡng bội trên 50 NST nhưng có thể gặp với các bất thường số lượng NST khác [58] Chuyển đoạn này được Romana nhận dạng đầu tiên năm 1994 bằng kỹ thuật FISH

1995 Golub đã chứng minh được tổ hợp gen trong chuyển đoạn này là

TEL/AML1 Gen TEL có kích thước lớn gồm 5 exon nhưng vùng mang điểm đứt gãy có kích thước khoảng 15kb nằm giữa exon 5 và 6 Gen AML1 điểm đứt gãy thường ở itron1 có kích thước lớn hoặc điểm đứt gãy phụ nằm trên intron thứ 2, từ đó tạo ra 2 dạng bản mã khác nhau của gen TEL/AML1 Cả 2 gen này đều mã hóa cho yếu tố điều hòa phiên mã nhân Tổ hợp gen này làm phá vỡ chức năng bình thường của gen TEL và hoặc tạo ra yếu tố ức chế phiên mã làm suy giảm biểu hiện của gen AML1

Hình 1.8: Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) và gen lai TEL/AML1

Về hình thái và đặc điểm miễn dịch của tế bào non có chuyển đoạn này không có nhiều điểm khác biệt Chuyển đoạn này có tiên lượng tốt, nguy cơ bội nhiễm thấp, kết quả điều trị sống khỏi 90% [59] [60]

1.2.2 Các bất thường di truyền ở lơ xê mi cấp dòng lympho T

Các bất thường dòng lympho T cũng tương tự như dòng lympho B, tuy nhiên các bất thường di truyền ở lympho T ít có giá trị tiên lượng [13] nhưng một vài mối liên quan giữa đột biến gen và lâm sàng đã được ghi nhận: các tứ bội thường gặp ở trẻ em, lâm sàng nặng, tế bào non ác tính to [61]

Bảng 1.5: Tần suất xuất hiện các đột biến gen và NST trong lơ xê mi cấp

dòng lympho [62]

lympho trưởng thành

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh lơ xê mi cấp

1.2.3.1 Sự hoạt động của các gen ung thư [63]

Gen bình thường do tác động của các yếu tố tạo nên gen ung thư (oncogen) [8] [64] [28] Sản phẩm của gen ung thư là các protein bất thường,

có hoạt tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa tế bào [65] [6],[10] Các gen ung thư chia làm 4 nhóm chính:

- Oncogen mã hóa protein là yếu tố tăng sinh, gen này hoạt động qua mức làm quá trình sinh sản tế bào mất kiểm soát [64]

- Oncogen mã hóa protein là các thụ thể tiếp nhận tín hiệu trên màng tế bào: vị trí tiếp nhận protein tạo cụm tế bào thay đổi, chỉ tạo được 1 dòng tế bào, tạo ra tính lấn át của các tế bào ác tính trong tủy [6]

- Oncogen mã hóa protein là chất truyền tin từ màng qua bào tương vào tế bào Các protein mang chất truyền tin bị sai lệch dẫn đến sự loạn sản tế bào [65]

- Oncogen nhân là các gen mã hóa cho các protein nằm trong nhân tế bào Khi các oncogen mã hóa cho protein gắn vào DNA, hoạt động như yếu

tố phiên mã sẽ ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình phiên mã, dịch mã, dẫn đến

sự rối loạn sinh sản và biệt hóa tế bào [66]

1.2.3.2 Gen ức chế u

Trong tế bào có những gen kiểm soát sự tăng sinh tế bào- đó là các gen

ức chế u Khi những gen này bị mất hoặc bất hoạt dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, sinh ra u [64] [29] Hiện nay, đã có nhiều gen ức chế u được tìm thấy và trong đó có gen p53 trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 17 Gen p53 điều hòa quá trình phân bào, khi gen p53 bất thường dẫn đến tế bào phân chia mất kiểm soát Đây là nguyên nhân của nhiều bệnh máu ác tính trong đó có lơ xê

mi cấp dòng lympho [67] [68]

1.2.3.3 Hoạt hóa của các oncogen trong bệnh lơ xê mi cấp lympho

Nếu chỉ có 1 oncogen hoạt động thì không gây ra bệnh lý, khi có sự kết hợp của nhiều oncogen hoặc kết hợp với gen ức chế u mới làm tế bào bình thường trở thành ác tính [64] [13] Chuyển dạng ác tính gồm các loại sau:

- Chuyển đoạn hoặc cấu trúc lại nhiễm sắc thể: các chuyển đoạn bất thường giữa các nhiễm sắc thể ( t(9,22) tạo nên gen lai ABL/BCR), thừa hoặc thiếu nhiễm sắc thể (thừa nhiễm sắc thể số 8) [13]

- Đột biến điểm: thay đổi thành phần hay số lượng các nucleotide [56]

- Nhân gen, lặp gen: thừa nhiễm sắc thể số 8, số 21 [56]

- Kết hợp yếu tố khuyếch đại gen: virus gây ung thư gắn bộ gen của mình vào vị trí oncogen, gây tăng sinh tế bào

1.3 CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ LƠ XÊ MI CẤP DÒNG LYMPHO

Trong điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh như tuổi, thể bệnh, đột biến di truyền kèm theo… Theo nghiên cứu của Hoffbran A.V [69] các yếu tố tiên lượng tốt là: nữ giới, trẻ nhỏ (trên 2 tuổi), số lượng bạch cầu thấp, dòng lympho B, bộ nhiễm sắc thể trên lưỡng bội hoặc bình thường, có chuyển đoạn gen TEL/AML1 Những bệnh nhân có tiên lượng xấu là nam giới, lớn tuổi hoặc bệnh nhi dưới 2 tuổi, lơ xê mi cấp dòng lymphoT, có nhiễm sắc thể Ph1 dương tính và có chuyển đoạn 11q23 Theo nghiên cứu của Phạm Quang Vinh và CS, bệnh nhân có chuyển đoạn t(9;22) có thể đạt lui bệnh về mặt tế bào nhưng vẫn mang gen bất thường và thời gian tái phát nhanh, thường 1-3 tháng [70] [71] Theo nghiên cứu của Rowe và CS tỷ lệ sống không bệnh 5 năm ở bệnh nhân Ph1 âm tính và Ph1 dương tính là 41% và 25% [72] Cũng theo nghiên cứu này, bệnh nhân có Ph1 dương âm tính trên 35 tuổi và có số lượng bạch cầu cao (trên 30G/L với thể lympho B và trên 100 G/L với thể lympho T) là những yếu tố nguy cơ cao Những bệnh nhân này tỷ lệ sống

5 năm không bệnh là 29% so với nhóm không có yếu tố nguy cơ cao là 54%

Những bệnh nhân này có thể đáp ứng với hóa trị liệu nhưng tái phát nhanh, thời gian sống không bệnh ngắn Với những bệnh nhân có các bất thường di truyền tiên lượng xấu này nên xem xét ghép tế bào gốc sớm Giá trị tiên lượng của các bất thường di truyền khác nhau ở trẻ em và người lớn

Bảng1.6: Tỷ lệ sống thêm không bệnh theo thời gian của các dưới nhóm bệnh theo bất thường di truyền ở bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho [62]

t(1;19)(q23;p13.3)

20-40% được 3 năm t(9;22)(q34;q11.2)

t(4;11)(q21;q23) [MLL/AF4] 32-40% được 5 năm 10-20% được 3

năm

t(8;14)(q24;q32.3) 75-85% được 5 năm 50-55% được 4

năm Đột biến NOTCH 1 90% được 5 năm 50% được 4 năm

Nhân đoạn NST 21 30% được 5 năm

Theo nghiên cứu Moorman AV và cộng sự trên 2993 bệnh nhân và 1000 bệnh nhân làm gen đã khẳng định vai trò Ph1 là yếu tố quan trọng tiên lượng bệnh [73] Theo đó, tỷ lệ sống không bệnh trong 5 năm của nhóm Ph1 âm tính

và dương tính là 36% và 16% (p<0.01) Trong nhóm Ph1 âm tính, nghiên cứu tiếp khi kết hợp với các biến đổi gen khác cho thấy tỷ lệ sống không bệnh 5 năm

có sự thay đổi (13-24%) tùy loại biến đổi gen: t(4;11), t(8;11), kết hợp bất thường NST (trên 5 NST bất thường) và bất thường số lượng NST dạng trên lưỡng bội (60-78 NST) hoặc dưới lưỡng bội (30-39 NST) Chuyển đoạn t(8;14), dưới lưỡng bội kết hợp các bất thường NST là yếu tố nguy cơ cao trong tiên lượng tái phát và tử vong

Theo nghiên cứu Robert M., ngoài các yếu tố trên còn có một số bất thường di truyền khác như chuyển đoạn MLL/AF4, TEL/AML1 cũng có giá trị tiên lượng bệnh [47] Ngoài ra tỷ lệ tế bào non ác tính trong vòng 1 tuần và sau 4 tuần điều trị cũng có giá trị tiên lượng bệnh

Chỉ 20-40% bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho người lớn điều trị lui bệnh bằng các phác đồ hiện nay[74] Theo đó, chia bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho làm 3 nhóm tiên lượng Nhóm tiên lượng tốt khi: không có các đột biến gen tiên lượng xấu, trẻ tuổi < 30 tuổi, số lượng bạch cầu < 30G/L và đáp ứng điều trị trong vòng 4 tuần Nhóm tiên lượng xấu khi: có các đột biến gen tiên lượng xấu t(9;22), t(4;11), trên 60 tuổi, thể lơ xê mi cấp tiền B với số lượng bạch cầu >100 G/L, không đáp ứng điều trị trong vòng 4 tuần

Tuổi bệnh nhân và số lượng bạch cầu ngoại vi đều ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh [75] [76] Những nghiên cứu trước đây cho thấy bệnh nhân trên

35 tuổi và số lượng bạch cầu máu ngoại vi trên 30 G/L làm giảm thời gian sống lui bệnh [77] Những nghiên cứu sau này cũng đã chỉ ra các chỉ số lâm sàng có ý nghĩa quan trọng trong tiên lượng bệnh, mặc dù các con số làm điểm mốc đánh giá có thể khác nhau ở các nghiên cứu [78] [79]

Theo NCCN (National Comprehensive Cancer Network) 2013, các yếu

tố nguy cơ cao là: dưới lưỡng bội (<44 NST), chuyển đoạn t(v;11q23) hoặc sắp xếp lại gen MLL, chuyển đoạn t(9;22) hoặc gen lai ABL/BCR, công thức NST phức tạp (>5 đột biến NST), số lượng bạch cầu ngoại vi (trên 30 G/L đối với lơ xê mi cấp dòng lympho B và trên 100G/L với lơ xê mi cấp dòng lympho T) Ngoài ra, tuổi cũng là yếu tố tiên lượng quan trọng, theo NCCN lấy mốc đánh giá tuổi là 65 Tuy nhiên, phải làm thêm các các xét nghiệm khác để quyết định phác đồ điều trị phù hợp

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LƠ XÊ MI CẤP LYMPHO TẠI VIỆT NAM

Từ những năm 1974 đã có những nghiên cứu về lơ xê mi cấp tại Việt Nam Theo Nguyễn Thị Minh An, Vũ Thị Minh Châu và cộng sự (1996), Trần Minh Hương (2000), tỷ lệ lơ xê mi cấp ngày càng tăng [80] [81]

Năm 1980, Bạch Quốc Tuyên, Đỗ Xuân Thiêm đã đưa ra bộ xét nghiệm hóa học tế bào để chẩn đoán bệnh theo tiêu chuẩn FAB và vẫn được sử dụng tới ngày nay [82]

Trong những năm tiếp theo Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực đã phân loại lơ xê mi cấp ở bệnh nhân điều trị tại Huế và trên bệnh nhi điều trị tại tại Viện Nhi Trung Ương [9] [83]

Năm 1990 phân loại lơ xê mi cấp dựa trên các dấu ấn màng tế bào được đưa vào Việt Nam Năm 1997 Trần Văn Bé, Lê Hữu Tài đã đưa ra phân loại

lơ xê mi cấp dựa trên các dấu ấn miễn dịch [84]

Năm 2004 Bạch Quốc Khánh, Nguyễn Hà Thanh, Đỗ Trung Phấn đưa ra nhận xét đặc điểm bệnh nhân lơ xê mi cấp lympho điều trị tại viện Huyết Học – Truyền máu Trung Ương [85]

Tiếp đó, Trần Thị Hồng Hà (2007) và Nguyễn Triệu Vân (2009) đã đưa

ra những nhận xét về đặc điểm các dấu ấn miễn dịch dùng trong phân loại bệnh lơ xê mi cấp [86] [87]

Năm 1980 khi bắt đầu nhuộm Giemsa nhiễm sắc thể và sau này là nhuộm băng đã phát hiện nhiều bất thường di truyền ở bệnh nhân lơ xê mi cấp Năm 1986 Nguyễn Ngọc Minh đã đưa ra những nhận xét về bất thường

di truyền bệnh nhân lơ xê mi cấp tại Huế [83] Năm 2003 Phạm Quang Vinh

đã đưa ra những nhận xét về biến đổi nhiễm sắc thể trên 200 bệnh nhân lơ xê

mi cấp dòng tủy và dòng lympho [88] Năm 2007 Nguyễn Thiên Lữ, Phạm Quang Vinh đã sử dụng kỹ thuật PCR, FISH đưa ra nhận xét về đột biến gen ABL/BCR [89]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

43 Bệnh nhân điều trị tại khoa Huyết học- Bệnh viện Bạch Mai có các tiêu chuẩn sau:

 Chẩn đoán xác định lơ xê mi cấp dòng lympho theo WHO 2001 và phân loại theo FAB 1986

 Tuổi từ 16 đến 81

 Chưa điều trị hóa chất trước đó

 Tiêu chuẩn loại trừ: Lơ xê mi kinh chuyển cấp dòng lympho, hội chứng rối loạn sinh tủy chuyển cấp dòng lympho

2.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 108 năm 2014

2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Khoa Huyết học – bệnh viện Bạch Mai

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có hồi cứu và tiến cứu

2.4.2 Nội dung và các biến số nghiên cứu

- Nghiên cứu các bất thường nhiễm sắc thể và đột biến gen ABL/BCR, MLL/AF4, TEL/AML1, E2A/PBX1: tỷ lệ xuất hiện, kiểu biến đổi, thể bệnh hay gặp, đối chiếu đột biến gen và bất thường nhiễm sắc thể

- Nghiên cứu đáp ứng điều trị tấn công gồm: diễn biến điều trị (số ngày điều trị, số ngày bạch cầu dưới 1G/L, số ngày phục hồi bạch cầu trung tính, các biến chứng trong điều trị), kết quả điều trị (LBHT, LBKHT, KLB, tử vong)

2.4.3 Vật liệu nghiên cứu

2.4.3.2 Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu

- Ống nghiệm có chất chống đông EDTA và ông nghiệm có chất chống đông heparin để lấy bệnh phẩm

- Ống nghiệm Ependorf, ống Falcon, chai nuôi cấy vô trùng, pipet, đầu côn nhỏ, lam kéo bệnh phẩm

- Máy ly tâm, máy đếm tế bào, máy Flow Cytometry

- Máy tính phân tích NST, máy PCR

- Kính hiển vi

- Tủ ấm

- Quầy lạnh

2.4.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.4.1 Kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào

Nhuộm peroxydase, nhuộm sudan, nhuộm esterase đặc hiệu và không đặc hiệu, nhuộm PAS

2.4.4.2 Kỹ thuật xét nghiệm phân loại miễn dịch

- Thực hiện bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy treeb máy Navios của hãng Beckman Coulter Hóa chất thực hiện đi cùng hãng máy

- Dịch tủy chống đông bằng EDTA, đếm số lượng tế bào có nhân trong dịch tủy

- Phá hủy hồng cầu bằng dung dịch lysing

- Tách bạch cầu, ủ gắn với các CD

- Nhận định kết quả theo mức độ dương tính với các marker

- Phân nhóm bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho dựa trên mức độ dương tính với các CD trên bề mặt các tế bào non: [10] [90]

+ Lympho B dương tính với các CD: 10, 19, 20,22, 38, 79, TdT + Lympho T dương tính với các CD: 2, 3, 4, 5, 7, 8, CyCD3

2.4.4.3 Kỹ thuật phân tích nhiễm sắc thể

- Sau khi nuôi cấy, kích thích sự phân chia nhiễm sắc thể, làm tiêu bản nhuộm Giêmsa

- Kỹ thuật nhuộm băng G phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể [91]

- Phân tích nhiễm sắc thể trên máy tính theo phần mềm phân tích Ikaros metasystems

2.4.4.4 Kỹ thuật PCR (RT-PCR, Nested PCR) phát hiện các đột biến gen E2A/PBX1, MLL/AF4, TEL/AML1, ABL/BCR

Các bước tiến hành như sau:

- Tách chiết tế bào bạch cầu: Tiến hành tách chiết bạch cầu hạt từ dịch

tủy xương bằng ly tâm gradient tỷ trọng kép

- Tách chiết ARN từ tế bào bạch cầu

- Tổng hợp cDNA: ARN sau khi tách chiết sẽ dùng để tổng hợp cDNA

- Tiến hành PCR

*PCR vòng 1

+ Trộn mẫu cDNA theo các thành phần trong bảng sau:

(Mồi trong nghiên cứu theo mồi của JJM Van Dongen và CS năm 1999 [92])

Thể tích (μl)

5’ GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C 3’ 0,5

Gen

MLL/AF4

Mồi MLL-A (10 pmol/μL) 5’ GTT TGG GCT TCA CAC CAT TCC 3’ 0,5 5’ GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C 3’ 0,5

Gen

E2A/PBX1

Mồi E2A-A (10 pmol/μL) 5’ CAC CAG CCT CAT GCA CAA C 3’ 0,5 Mồi PBX1-B (10 pmol/μL)

5’ TCG CAG GAG ATT CAT CAC G 3’ 0,5

Gen

ABL/BCR

p210

Mồi ABL-a3-B (10pM) 5’ GTT TGG GCT TCA CAC CAT TCC 3’ 0,5

Mồi BCR-b1-A (10pM) 5’ GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C 3’ 0,5

5’ GTTTGGGCTTCACACCATTCC 3’ 0,5

+ Đặt các ống phản ứng đã đánh dấu vào máy PCR (Pro S - Eppendorf)

+ Bắt quá trình khuếch đại sử dụng chương trình sau:

Bắt đầu tan: 95 độ C trong 3 phút

Chu kỳ biến đổi PCR: 94 độ C trong 30 giây: biến tính

35

95 oC → 94 oC → 58 oC → 72 oC → 72 oC → 4 oC

3’ 30’’ 1’ 45’’ 3’ ∞

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single Formatted Table

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single Formatted: Font: 13.5 pt

Formatted: Space Before: 1 pt, Line spacing: single Formatted: Space Before: 6 pt

Formatted: Add space between paragraphs of the same

style

Formatted: Space After: 0 pt, Line spacing: Multiple 1.3 li

58 độ C trong 1 phút : gắn mồi

72 độ C trong 3 phút 45 giây: tổng hợp chuỗi

Số chu kỳ lặp lại: 35 chu kỳ

+ Khi chương trình PCR kết thúc, lấy các ống phản ứng ra khỏi máy chu

Gen

MLL/AF4

Mồi MLL-C (10 pmol/μL) 5’ CAG ATG CTG ACC AAC TCG TGT 3’ 0,5

Mồi AF4-D (10 pmol/μL) 5’ TTC CCC ATT GTG ATT ATA GCC TA 3’ 0,5

Gen

E2A/PBX1

Mồi E2A-C (10 pmol/μL) 5’ CAC CCT CCC TGA CCT GTC T 3’ 0,5 Mồi PBX1-D (10 pmol/μL)

Mồi BCR-b1-C (10pM) 5’ CAG ATG CTG ACC AAC TCG TGT 3’ 0,5

+ Đặt các ống phản ứng đã đánh dấu vào máy PCR (Pro S - Eppendorf)

+ Bắt quá trình khuếch đại sử dụng chương trình sau:

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39", Line

spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Indent: First line: 0.39"

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single Formatted Table

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single

Formatted: Space Before: 0 pt, Line spacing: single Formatted: Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single

Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single Formatted: Font: 13.5 pt Formatted: Line spacing: single Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39", Space

Before: 12 pt, Add space between paragraphs of the same style

Bắt đầu tan: 95 độ C trong 3 phút

Chu kỳ biến đổi PCR: 94 độ C trong 30 giây: biến tính

66 độ C trong 1 phút : gắn mồi

72 độ C trong 3 phút 45 giây: tổng hợp chuỗi

Số chu kỳ lặp lại: 35 chu kỳ

+ Khi chương trình PCR kết thúc, lấy các ống phản ứng ra khỏi máy chu

trình nhiệt

- Điện di sản phẩm PCR

 Nhận định kết quả

 Vòng 1

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Add space between paragraphs of the same

style, Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39", Add space

between paragraphs of the same style, Line spacing: Multiple 1.3 li, Tab stops: 0.52", Left

Formatted Table Formatted: Font: 12 pt, Not Bold

2.4.5 Quy trình nghiên cứu

2.4.5.1 Bệnh nhân vào viện được thăm khám lâm sàng, chỉ định các xét

nghiệm sau:

a Xét nghiệm tế bào máu ngoại vi và tủy đồ

- Tủy đồ: chẩn đoán xác định lơ xê mi cấp theo WHO khi tỷ lệ tế bào

non ác tính ≥ 20% tế bào có nhân trong tủy

- Nhuộm hóa học tế bào với 5 phương pháp: peroxydase, sudan đen,

esterase đặc hiệu, esterase không đặc hiệu, PAS Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng

lympho khi các tế bào non ác tính dương tính với PAS

- Chẩn đoán xác định và phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho theo tiêu

chuẩn WHO 2001

b Xét nghiệm phân loại miễn dịch (thực hiện tại khoa Miễn dịch – Viện

Huyết học Truyền máu Trung ương)

- Bệnh nhân được chỉ định bộ xét nghiệm phân loại miễn dịch cơ bản

gồm 12 marker sau: CD 34, HLA-DR, CD 13, CD33, CD15, CD117, CD2,

CD3, CD19, CD20, CD22, CD45

- Khi có kết quả tủy đồ, kết quả phân loại miễn dịch nghi ngờ dòng

lympho, bệnh nhân sẽ được tiếp tục chỉ định các marker sau:

- CD4, CD5, CD7, CD8, CyCD3 (Lympho T)

- CD10, CD38, CD79, TdT (Lympho B)

c Xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể (thực hiện tại khoa Huyết học – Bệnh

viện Bạch Mai)

d Xét nghiệm phát hiện các đột biến gen: E2A/PBX1, MLL/AF4, TEL/AML1,

ABL/BCR (thực hiện tại khoa Huyết học – Bệnh viện Bạch Mai)

d.e Giải trình tự gen: để kiểm tra một số mẫu gen dương tính (thực hiện tại

trung tâm genetic)

e.f Các xét nghiệm cơ bản, theo dõi điều trị:

- Xét nghiệm tế bào máu ngoại vi: 3 lần/ tuần

Formatted: 3, Space Before: 12 pt

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Formatted: Condensed by 0.3 pt Formatted: Not Expanded by / Condensed by

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.51", Line

spacing: Multiple 1.4 li, Tab stops: 0.64", Left

- Xét nghiệm hóa sinh

- Xét nghiệm đông máu

- Xét nghiệm vi sinh: HIV, HCV, HBsAg

- Chẩn đoán Hình: XQ ngực, siêu âm ổ bụng

- Điện tâm đồ

2.4.5.2 Giải thích cho bệnh nhân và người nhà về tình hình bệnh và

phương án điều trị

2.4.5.3 Lập hồ sơ chi tiết

2.4.5.4 Điều trị theo phác đồ Hyper-CVAD

2.4.5.5 Theo dõi và đánh giá điều trị

- Thời gian điều trị: bắt đầu từ ngày dùng hóa chất tới khi ra viện

- Thời gian số lượng bạch cầu dưới 1G/L

- Thời gian số lượng bạch cầu phục hồi: thời gian từ khi số lượng bạch

cầu<1 G/L tới khi số lượng bạch cầu >1G/L

- Đánh giá biến chứng nhiễm trùng sau điều trị

- Đánh giá biến chứng rối loạn đông máu: chẩn đoán tình trạng đông

máu rải rác lòng mạch (DIC) theo hiệp hội đông cầm máu 2001 Chẩn đoán

DIC khi ≥ 5 điểm

Bảng 2.1: Bảng điểm đánh giá DIC (đông máu nội mạc rải rác)

Formatted: Line spacing: Multiple 1.4 li

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.48", Tab stops:

0.59", Left

- Đánh giá kết quả điều trị theo NCCN 2013: đánh giá kết quả điều trị

sau đợt điều trị tấn công

+ Tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn:

 Không có Blast máu ngoại vi hoặc bệnh nhân ổn định trên lâm sàng

 Tủy đồ: blast dưới 5% tế bào có nhân trong tủy

 Tế bào máu ngoại vi: số lượng bạch cầu >1 G/L, số lượng tiểu cầu

>100 G/L

 Không tái phát trong vòng 4 tuần

+ Tiêu chuẩn lui bệnh không hoàn toàn:

Giống tiêu chuẩn lui bệnh hoàn toàn nhưng số lượng tiểu cầu máu ngoại

vi dưới 100G/L hoặc số lượng bạch cầu trung tính dưới 1 G/L

+ Tiêu chuẩn không lui bệnh:

 Khi không đáp ứng được những tiêu chuẩn trên

+ Tiêu chuẩn tái phát

Sau khi đạt lui bệnh hoàn toàn lại xuất hiện tế bào blast máu ngoại vi

hoặc trên 5% các tế bào có nhân trong tủy

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Thu thập, xử lý các số liệu trung bình, độ lệch, trung vị, giá trị lớn

nhất, nhỏ nhất, so sánh sự chênh lệch có ý nghĩa thống kê giữa 2 biến bằng

chương trình SPSS 16.0

2.6 ĐẠO ĐỨC Y HỌC

- Bệnh nhân và người nhà được giải thích rõ về tình trạng bệnh và

phương pháp điều trị hóa chất Bệnh nhân và người nhà đồng ý ký giấy cam

kết chấp nhân điều trị hóa chất

- Giải thích rõ cho bệnh nhân và người nhà về ý nghĩa và sự cần thiết

của việc làm xét nghiệm gen trong việc chẩn đoán và điều trị

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39"

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39"

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.39" Formatted: Indent: First line: 0.39"

MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU

Chẩn đoán lâm sàng theo dõi lơ xê mi cấp

Lập hồ sơ nghiên cứu: bệnh án nghiên cứu, XN huyết tủy đồ, phân loại miễn dịch, công thức nhiễm sắc thể (karyotypee), lưu mẫu tủy

Chẩn đoán lơ xê mi cấp dòng lympho (43 bệnh nhân)

CĐ XN các gen: ABL/BCR, TEL/PBX1, MLL/AF4, E2A/PBX1

BN có điều trị hóa chất

Thu thập các đặc điểm biến đổi

di truyền Theo dõi và đánh giá kết quả điều trị tấn công

BN không điều trị hóa

Formatted: Centered, Space Before: 6 pt Formatted: Centered