giải trình tự thế hệ mới trong tìm và đánh giá các đột biến của hệ gen ung thƣ u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƢ U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS BÙI CHÍ BẢO Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƢ U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Bùi Chí Bảo ĐH Y Dƣợc TPHCM Võ Văn Thành Niệm ĐH Y Dƣợc TPHCM Nguyễn Đức Thái ĐH Y Dƣợc TPHCM Trƣơng Đinh Kiều Diễm ĐH Y Dƣợc TPHCM Nguyễn Văn Linh ĐH Cần Thơ Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU 1.TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 KẾT LUẬN 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Thông tin hóa chất dùng cho giải trình tự hệ 17 Bảng Các số kiểm soát chất lƣợng kết giải trình hệ 18 Bảng Các thông số để định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA 20 Bảng Chất lƣợng DNA đầu vào 23 Bảng Thống kê sơ xuất thông tin tổng quan liệu 25 DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình Sự phát triển phân nhóm UNBTK Hình Mối tƣơng quan gen giai đoạn bệnh UNBTK Hình Rudolf Virchow - ngƣời mô tả khối u bụng đứa trẻ nhƣ "u thần kinh đệm" Hình U ngun bào thần kinh đƣợc tìm thấy tuyến thƣợng thận mơ thần kinh paraspinal từ cổ xuống xƣơng chậu Hình Phân giai đoạn bệnh u nguyên bào thần kinh Hình Hệ thống máy sử dụng cho phƣơng pháp giải trình tự hệ 14 Hình Tổng quan trình chuẩn bị mẫu tiến hành thực giải trình tự hệ 16 Hình Quy trình phân tích kết NGS 16 Hình Kiểm tra độ phân mảnh gDNA gel agarose 1%, 100V 30 phút 21 Hình 10 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh 21 Hình 11 Kết kiểm tra chất lƣợng DNA 22 Hình 12 Đánh giá thƣ viện mẫu NB chuẩn bị giải trình tự 23 Hình 13 Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA 24 Hình 14 Quy trình kiểm tra thƣ viện 24 Hình 15 Đánh giá chất lƣợng liệu giải trình tự 27 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa NB Neuroblastoma U nguyên bào thần kinh SNS Sympathetic nervous system Hệ thần kinh giao cảm INSS International Neuroblastoma Staging Hệ thống định giai đoạn u nguyên System bào thần kinh quốc tế Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ NGS THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI U nguyên bào thần kinh – Neuroblastoma (NB) khối u rắn phổ biến trẻ em Gần nửa số trƣờng hợp u nguyên bào thần kinh xảy trẻ em dƣới năm tuổi Nó khối u thần kinh nội tiết, phát sinh từ đỉnh thần kinh hệ thần kinh giao cảm (SNS) Nó thƣờng bắt nguồn từ tuyến thƣợng thận, phát triển mơ thần kinh cổ, ngực, bụng khung xƣơng chậu U nguyên bào thần kinh (UNBTK) loại ung thƣ có nguồn gốc từ tế bào thuộc mào thần kinh Đây loại u đặc, nằm ngoại vi não, thƣờng xuất phát từ tuyến thƣợng thận hay hạch thần kinh giao cảm vùng cổ, ngực, bụng cột sống Bệnh lý thƣờng xảy trẻ sơ sinh trẻ em dƣới 15 tuổi Đây loại u ác tính đặc ngoại vi não phổ biến hàng thứ hai dạng u đặc phổ biến trẻ nhỏ(2) Trong trƣờng hợp u nguyên bào thần kinh, tế bào phát triển từ tế bào thần kinh thời kỳ phôi thai bào thai Các tế bào non liên tục phân chia phát triển bất thƣờng, tạo khối u Một số khối u chuyển thành lành tính đƣợc coi u hạch thần kinh U nguyên bào thần kinh khối u ác tính, biểu khơng đồng đƣợc phân thành loại nguy cơ: thấp, trung bình cao Bệnh có nguy thấp thƣờng gặp trẻ sơ sinh có kết tốt cách phẫu thuật, bệnh có nguy cao khó để điều trị thành cơng với phƣơng pháp điều trị đa phƣơng thức chuyên sâu So với hệ gen ung thƣ ngƣời lớn, biến đổi di truyền đặc trƣng UNBTK khu trú cho gen có vai trị quan trọng định yếu tố tiên lƣợng điều trị nhƣ: khuếch đại gen MYCN, khuếch đại hay đột biến hoạt hoá chức sin ung ALK, đột biến gây kéo dài đoạn telomere gây ATRX(10) Bên cạnh đó, ghi nhận nhiều cơng trình cho thấy có thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể 1p, 3p, 11q 17q(7,14) Hình Sự phát triển phân nhóm UNBTK Hình Mối tƣơng quan gen giai đoạn bệnh UNBTK Mặt khác, đột biến làm thay đổi yếu tố thuộc ngoại di truyền đƣợc báo cáo nhƣ: methyl hóa DNA CASP8, RASSF1A, trình tự phiên mã không giải mã protein nhƣ miRNA (let7a, miR-9, miR-17-92a) đột biến phức hợp tái cấu trúc nhiễm sắc chất SWI/SNF tiểu đơn vị nhƣ BRG1, ARID1A BRN đóng vai trị quan trọng việc trƣởng thành tế bào mào thần kinh(3,11) Các thông tin hệ gen UNBTK kể chứng minh có vai trị quan trọng tiên lƣợng, điều trị hƣớng điều trị đích cho ung thƣ này(13) Hình Rudolf Virchow - ngƣời mơ tả khối u bụng đứa trẻ nhƣ "u thần kinh đệm" Vào năm 1864, bác sĩ ngƣời Đức - Rudolf Virchow ngƣời mô tả khối u bụng đứa trẻ nhƣ "u thần kinh đệm" Các đặc tính khối u hệ thần kinh giao cảm tủy thƣợng thận sau đƣợc ghi nhận vào năm 1891 nhà nghiên cứu bệnh ngƣời Đức - Felix Marchand Vào năm 1901, William Pepper mơ tả đặc tính giai đoạn 4S trẻ sơ sinh (ở gan, khơng có di xƣơng) Năm 1910, James Homer Wright hiểu rõ đƣợc khối u có nguồn gốc từ tế bào thần kinh nguyên thủy đặt tên u ngun bào thần kinh Ơng lƣu ý khối tròn tế bào mẫu tủy xƣơng mà đƣợc gọi "pseudorosettes Homer Wright"(1) Các triệu chứng u nguyên bào thần kinh thƣờng mơ hồ, gây khó khăn cho việc chuẩn đốn Ví dụ nhƣ mệt mỏi, chán ăn đau nhức khớp xƣơng Những triệu chứng khác phụ thuộc vào vị trí u nguyên bào thần kinh bắt đầu phát triển(4,5):  Nếu nhƣ khối u vùng bụng, bụng bị sƣng phồng lên bệnh nhân có biểu táo bón khó tiểu Đơi huyết áp cao  Nếu nhƣ khối u ảnh hƣởng đến vùng ngực, bị khó thở khó nuốt  Nếu khối u xuất cổ nhìn thấy đƣợc nhƣ cục u, ảnh hƣởng đến việc thở nuốt  Đôi thấy chân yếu khơng vững nhƣ khối u đè ép lên tủy sống  Nếu khối u xƣơng quanh mắt, gây bầm tím sƣng  Nếu khối u xâm nhập tủy xƣơng gây xanh xao thiếu máu U nguyên bào thần kinh thƣờng lan truyền đến phận khác thể trƣớc có triệu chứng rõ ràng khoảng 50 – 60% trƣờng hợp di Các vị trí phổ biến u nguyên bào thần kinh tuyến thƣợng thận Điều xảy 40% khối u khu trú 60% lan rộng U nguyên bào thần kinh phát triển đâu hệ thống thần kinh giao cảm từ cổ xuống xƣơng chậu Tần suất vị trí khác bao gồm: cổ (1%), ngực (19%), vùng bụng (30% phi tuyến thƣợng thận) xung quanh xƣơng chậu (1%)(6) 2.4 Hệ thống giải trình tự Sử dụng giao thức MiniSeq Illumina, bao gồm hóa chất giải trình tự: Bảng Thơng tin hóa chất dùng cho giải trình tự hệ Tên MiniSeq High Ouput Reagent Kit 300 cycles Dữ liệu đầu 7.5 Gb MiniSeq High Output Reagent Kit 150 cycles 3,8 Gb  MiniSeq High Output Reagent Kit 75 cycles 1.9 Gb MiniSeq Mid Output Reagent Kit 300 cycles 2.4 Gb 2.5 Phản ứng giải trình tự Trên hình cơng cụ MiniSeq: Mở 'Manage Instrument' chọn 'Reboot' để khởi động lại phần mềm Mở lại'Manage Instrument' chọn 'Sequence' Trên hình Tùy chọn BaseSpace - chọn 'Sử dụng BaseSpace để lƣu trữ phân tích' nhấp vào 'NEXT' Một dấu nhắc xuất để tải flowcell Lấy flowcell từ kho lạnh ° C Cẩn thận lấy flowcell từ container cách sử dụng nhíp Tránh chạm vào kính với nhíp Flowcell đƣợc rửa cẩn thận nƣớc cấp phịng thí nghiệm Flowcell sau đƣợc làm khơ mơ làm ống kính khơng có sƣơng Khoang chứa flowcell đƣợc mở  Các flowcell đƣợc đặt cẩn thận tránh chạm vào kính chốt đóng cửa để giữ tế bào cố định chỗ Khoá khoang 1,  Một flowcell đƣợc cố định chỗ, dấu nhắc hình cơng cụ MiniSeq hƣớng dẫn ngƣời sử dụng để nạp thuốc thử hộp mực tinh khiết  Chai thuốc thử PR2 đƣợc lấy khỏi kho lạnh đảo ngƣợc nhẹ nhàng để trộn Khoang thuốc thử đƣợc mở  Xô đựng đƣợc nâng lên khóa chặt vào vị trí R  Chai PR2 đƣợc đặt phía bên phải máy làm lạnh phản ứng thẳng đứng với nắp đƣợc gỡ bỏ Chai phế thải bên phải máy làm lạnh phản ứng thẳng đứng đƣợc làm thay (3 tháng/lần) Đòn bẩy đƣợc hạ xuống để xem mực nƣớc bỏ  Hộp chứa thuốc đƣợc đƣa vào không gian hộp đựng bên tay trái máy làm lạnh lƣu ý đóng kín nhanh để tránh khơng khí ẩm  Màn hình phải hiển thị hộp thông tin RFID đƣợc đọc 17  Mẫu đƣợc tải lên Trình quản lý thử nghiệm “Experiment manager” Bạn tạo bảng mẫu trƣớc với ngƣời quản lý thử nghiệm cho ngƣời dùng có kinh nghiệm dƣới dạng tệp csv Chạy thông số đƣợc liệt kê bảng mẫu đƣợc hiển thị bảng  Sau kiểm tra tất tham số chạy xác ngƣời sử dụng nói với cơng cụ để thực kiểm tra trƣớc chạy Một kiểm tra đƣợc hồn thành, chạy đƣợc bắt đầu.Nhiều dụng cụ MiniSeq đƣợc sử dụng tùy theo tính sẵn có chúng tính thực tế dụng cụ để thử nghiệm theo bƣớc Bộ hóa chất tƣơng ứng đƣợc sử dụng  Tất liệu trình tự đƣợc tạo từ MiniSeq đƣợc lƣu trữ BaseSpace, mơi trƣờng điện tốn đám mây Illumina cung cấp Có ba lần đọc đƣợc thực cụm mảnh: đoạn đọc xác định (đọc mã vạch lập mục), đoạn đọc phía trƣớc đoạn DNA (chiều dài phụ thuộc vào trình tự xếp) lần đọc ngƣợc mảnh  Có tệp trình tự đƣợc tạo cho mẫu định dạng FASTQ đọc xuôi FASTQ đọc ngƣợc lại Định dạng FASTQ sử dụng ký tự ASCII để biểu thị điểm số nucleotide chất lƣợng vị trí chuỗi đƣợc đọc  Máy Illumina sản xuất liệu định dạng FASTQ, bao gồm mã nhận dạng chuỗi, chẳng hạn nhƣ kênh dòng chảy tọa độ X-Y cụm nguồn gốc tế bào dòng chảy  Xoá bỏ chuyển đổi định dạng đọc đâu điểm chất lƣợng cho lần đọc không đáp ứng tiêu chí ngƣời dùng xác định Thơng tin chất lƣợng bị xóa khỏi chuỗi cịn lại, chuyển chúng thành định dạng FASTA gồm thông tin trình tự 2.5 Kiểm sốt q trình giải trình tự Bảng Các số kiểm soát chất lƣợng kết giải trình hệ Các giá trị đo lƣờng Định nghĩa Yield total Tổng số base pair đƣợc giải trỉnh tự Yield perfect Tổng số lần đọc không báo lỗi chạy với chứng PhiX 18 Yield >=3 errors Tổng số lần đọc có base pair bị báo lỗi có chứng PhiX Aligned Tỉ lệ số lần PhiX đƣợc đọc flowcell Perfectly Aligned (%) Tỉ lệ số base PhiX đƣợc đọc xác >=3 errors (%) Tỉ lệ số lần đọc có base pair bị báo lỗi PhiX Error rate Tỉ lệ thất bại chung phản ứng giải trình tự PhiX Q >=30 (%) Tỉ lệ base có chất lƣợng giải trình tự < 1/1000 base Tiles Các vùng nhỏ đƣợc phân định flowcell, có chức tƣơng tự Density Sự phân bố mảng DNA flowcell PF Phas./Prephas Reads Reads PF Q>=30 Yield Phần trăm phân mảng DNA đƣợc giải trình tự có kết 25 chu kỳ đầu đạt chất lƣợng Số lƣợng phân mảng DNA chạy trƣớc sau số lƣợng chu kỳ so với chu kỳ hiển thị máy Số lƣợng phân mảng DNA flowcell Số lƣợng phân mảng DNA flowcell có kết 25 chu kỳ đầu đạt chất lƣợng Số lƣợng base có kết giải trình tự sai sót ≤ 1/1000 Số lƣợng base vƣợt qua lọc (bộ lọc lƣợc bỏ kết có 25 chu kỳ đầu khơng ổn định) Cycles error rated Số lƣợng chu kỳ sai sót dựa vào PhiX Error rate Tỉ lệ sai sót đƣợc xác định với PhiX 19 Error rated determined by PhiX alignment during cycles 1-35, 1-75 and 1-100 Intensity cycle Cƣờng độ huỳnh quang base đƣợc phát MiniSeq Intensity cycle 20 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết a Định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA Một số bƣớc quan trọng nghiên cứu NGS phải kiểm tra bệnh học có số liệu xác nguồn mẫu Chúng tơi có 140 mẫu UNBTK thu thập từ 2012 đến 2016 Trong kết sinh thiết đƣợc đánh giá nhóm bệnh học Việc tách chiết DNA cho nhóm mẫu: 10 mẫu cố định Paraffin, mẫu mô sinh thiết tƣơi trữ lạnh -80oC mẫu DNA tách từ máu làm đối chứng Định lƣợng DNA phải đƣợc đánh giá dựa hình thức: quang phổ chạy điện di gel 1% agarose Quang phổ bƣớc sóng 260/230 khoảng 1,5 – 2,2 để đánh giá độ tạp nhiễm hoá chất lúc tách chiết (phần lớn ethanol) Quang phổ bƣớc sóng 1,6 – 2,2 để đánh giá độ tạp nhiễm protein mẫu (Bảng 3, Bảng 4) Hình ảnh DNA chạy điện di gel để đánh giá mức độ toàn vẹn cấu trúc DNA, mức độ đứt gãy sản phẩm hệ gen Mức tối ƣu 50% băng DNA > 1.000bp Trong Hình 1, mẫu từ số đến cố định paraffin phần lớn cho thấy đứt gãy nhiều Đặc biệt mẫu số có lƣợng bp nhỏ 1.000 bp theo thang chuẩn Ngƣợc lại, mẫu 8-11 cho bang DNA cố định gần đầu giếng bị đứt gãy Đây mẫu DNA từ nguồn sinh thiết tƣơi trữ lạnh -80oC Từ kết phân lập DNA, tiến hành loại trừ mẫu từ nguồn paraffin DNA không đủ chuẩn để thực bƣớc làm thƣ viện Thiết bị Bảng Các thông số để định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA Kết Dấu hiệu Phạm vi lý tƣởng DropSene96 A260/A230 Xác định mức độ nhiễm bẩn hóa chất (ví dụ: 1,5 – 2,2 ethanol) DropSene96 A260/A280 Xác định mức độ nhiễm bẩn protein 1,6 – 2,2 DropSene96 Nồng độ Định lƣợng DNA > ng/µL TapeStation DNA smear Xác định mức độ tồn vẹn DNA (ví dụ: giảm 50% > 1.000bp chất lƣợng/ đứt gãy DNA đƣợc tách chiết) Qubit2.0 Nồng độ Mức độ định lƣợng DNA xác > ng/µL 20 Hình Kiểm tra độ phân mảnh gDNA gel agarose 1%, 100V 30 phút Mẫu gDNA bị đứt gãy giếng 2, 3, 4,5 gDNA máu giếng gDNA mô tƣơi giếng 8, 9, 10, 11 đạt chất lƣợng để tiến hành chạy NGS Hình 10 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh Sản phẩm DNA sau phân cắt đƣợc lựa chọn lại SPRI Beads theo nồng độ thích hợp Nồng độ cao thu đƣợc nhiều phân mảng DNA kích thƣớc nhỏ ngƣợc lại 21 A B Hình 11 Kết kiểm tra chất lƣợng DNA A: DNA không đạt chất lƣợng; B: DNA đạt chất lƣợng b Thƣ viện Amplicon Các gDNA đƣợc cắt ngẫu nhiên để tạo phân mảnh nhỏ (~500 đến 1.000 bp) để chuẩn bị thƣ viện chạy PCR để kiểm tra chất lƣợng thƣ viện (Hình 10) 22 STT Tên mẫu Bảng Chất lƣợng DNA đầu vào Nồng độ Thể Tổng khối (ng/µL) tích Kết lƣợng (µg) (µL) NB25 295.475 43 12.705 Đạt NB72 255.331 45 11.490 Đạt NB76 51.756 45 2.329 Không đạt NB88 88.381 48 4.242 Đạt NB96 137.769 47 6.475 Đạt NB103 56.378 46 2.593 Đạt NB107 21.161 48 1.016 Đạt NB109 44.404 44 1.954 Không đạt Smear Smear Hình 12 Đánh giá thƣ viện mẫu NB chuẩn bị giải trình tự A: NB 72, B: NB 88, C: NB 96, D: NB 103 23 c Kiểm tra thƣ viện Bioanalyzer 2100 Sử dụng chip DNA 1000, kết thu đƣợc đồ thị có trục hồnh thể độ dài đoạn DNA trục tung thể nồng độ DNA đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng Hình 13 Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA Máy Bioanalyzer đƣợc dùng để đo kết phân cắt gDNA thành đoạn DNA nhỏ kiểm tra thƣ viện trƣớc chạy phản ứng giải trình tự Một thƣ viện điển hình bao gồm đoạn DNA khoảng 250-1000 bp, thƣ viện nằm khoảng làm giảm chất lƣợng trình giải trình tự Hình 14 Quy trình kiểm tra thƣ viện Thao tác: _ Chuẩn bị chip DNA 1000, hệ thống chip priming _ Cho hỗn hợp gel vào giếng “G” sau sử dụng hệ thống chip priming để phân bố gel khắp chip, giữ 30 giây _ Cho hỗn hợp chất nhuộm thang đo vào giếng định sẵn _ Cho hỗn hợp gel chất nhuộm vào 12 giếng tƣơng ứng sau cho mẫu DNA vào thực bƣớc chuẩn bị mẫu theo hƣớng dẫn nhà sản xuất cho vào máy Bioanalyzer 2100 24 Việc kiểm tra thƣ viện máy Bioanalyzer nên đƣợc sử dụng vào lần chuẩn bị thƣ viện đầu để chuẩn hóa quy trình, đảm bảo thƣ viện có độ dài thích hợp Sau quy trình đƣợc chuẩn hóa, phƣơng pháp Real-time PCR (qPCR) đƣợc sử dụng để đo nồng độ thƣ viện, kết nồng độ xác sử dụng Bioanalyzer 2100 quy trình đƣợc chuẩn hóa nên chuẩn bị thƣ viện không cần phải kiểm tra lại độ dài KAPA Library Quantification Bộ kit qPCR bao gồm mẫu chuẩn theo nồng độ pha loãng biết đƣợc chạy hệ thống LightCycler 480 II để xây dựng đƣờng chuẩn Các phản ứng định lƣợng thƣ viện đƣợc chạy sau với cặp mồi có trình tự giống nhƣ oligo gắn flowcell hệ thống MiniSeq, trình tự tƣơng tƣ oligo nên cặp mồi bắt cặp bổ sung với trình tự adapter gắn vào phân mảng DNA Kết Ct đƣợc kết hợp với đƣờng chuẩn tính nồng độ thƣ viện cách xác d Các tiêu đánh giá liệu giải trỉnh tự Chất lƣợng giải trình tự thƣờng đƣợc đánh giá dựa tiêu chí nhƣ tổng số đoạn trình tự, chất lƣợng theo vị trí base, chất lƣợng trung bình độ dài đoạn trình tƣ, tỷ lệ GC, số lƣợng đoạn liệu Kết đánh giá chất lƣợng giải trình tự đƣợc trình bày cụ thể nhƣ dƣới e Thống kê sơ (Basic Statistics) Xuất thông tin tổng quan liệu, bao gồm: tên tập tin liệu; định dạng liệu, máy giải trình tự, tổng số trình tự, số đoạn trình từ có chất lƣợng thấp, chiều dài đoạn trình tự %GC (Bảng 5) Bảng Thống kê sơ xuất thông tin tổng quan liệu 25 f Điểm chất lƣợng base (Per base sequence quality) Điểm chất lƣợng QC trình tự thể mức độ tin cậy trình tự Nếu QC=10: mức độ tin cậy 90%; QC=20: mức độ tin cậy 99%; QC=30; mức độ tin cậy 99,9%; QC=40: mức độ tin cậy 99,99% Trong hình, ta nhận thấy điểm QC đoạn mẫu hầu hết gần 40, có số đoạn điểm thấp 40 Điều cho thấy, liệu kết đủ điều kiện để tiến hành thao tác phân tích tiếp theo, khơng cần phải tinh (Hình 11A) g Điểm chất lƣợng chuỗi trình tự (Per sequence quality scores) Đánh giá điểm chất lƣợng trung bình đoạn trình tự Kết cho thấy đoạn trình tự có điểm trung bình 39 Khơng có đoạn trình tự có điểm trung bình dƣới 32 đoạn có điểm trung bình từ 32-39 (Hình 11B) h Tỷ lệ base (Per base sequence content) Cho biết tỷ lệ % loại trình tự A, T, G, C liệu (Hình 11C) i Tỷ lệ GC liệu (Per sequence GC content) Kết thống kê %GC đoạn trình tự Đƣờng màu xanh tỷ lệ %GC theo định luật phân phối chuẩn (lý thuyết) Đƣờng màu đỏ tỷ % GC có liệu (thực tế) Dữ liệu có %GC thực tế gần với lý thuyết tốt (Hình 11D) j Số lƣợng base N liệu (Per base N content) Kết thống kê số lƣợng trình tự N liệu mẫu, số lƣợng N nhiều phản ánh chất lƣợng giải trình tự khơng tốt (Hình 11E) k Chiều dài chuỗi trình tự (Sequence Length Distribution) Kết thống kê phân bố độ dài đoạn trình tự liệu kết cho thấy hầu hết trình tự có độ dài 101 bp (Hình 11F) l Mức độ lặp lại chuỗi trình tự (Sequence Duplication Levels) Đánh giá mức độ lặp lại các đoạn trình tự Đƣờng đỏ: mức độ lặp lại 200.000 trình tự đầu tiên, đƣờng màu xanh mức độ lặp lại tồn trình tự liệu (Hình 11G) 26 Hình 15 Đánh giá chất lƣợng liệu giải trình tự A: Điểm chất lƣợng base, B: Điểm chất lƣợng chuỗi trình tự, C: Tỷ lệ base, D: Tỷ lệ GC liệu, E: Số lƣợng base N liệu, F: Chiều dài chuỗi trình tự, G: Mức độ lặp lại chuỗi trình tự m Chú giải gen trình tự ca NB88 Sử dụng quy ƣớc chung hiệp hội di truyền hệ gen giới Human Genome Variation Society's (HGVS) nomenclature, đƣa báo cáo cuối với biến thể exon không đồng nghĩa (non-synonymous) đƣợc phân loại thành: gây bệnh (pathogenic), bệnh liên quan (probably disease associated), biến thể ý nghĩa không rõ (variant unknown significance - VUS), có khả lành tính (likely benign) lành tính (benign) Tất biến thể tiêu chí báo cáo 5% tần số alen, ngoại trừ biến lành tính đƣợc thay đổi đồng nghĩa (synonymous), đƣợc báo cáo Độ sâu trung bình tổng thể độ bao phủ 4933x (trên độ sâu trung bình tối thiểu 1000x) Trong số có mẫu dƣới bao phủ 100x, không bắt mồi, do lỗi trình tự primer trimers Tất liệu với 100 lần đọc đƣợc nhập vào sở liệu để xem xét Chúng lọc liệu đa hình đơn nucleotide (SNP) gần chồng chéo trình tự mồi mà ảnh hƣởng đến khuếch đại gen Xử lý liệu từ đƣờng ống dẫn sinh học phát ba, đột biến bệnh liên quan đến báo cáo hoạt đột biến missense 27 FLT3, đột biến missense IDH2 Đột biến lệch khung NPM1 Đột biến NPM1 IDH2 đƣợc mô tả văn học nhƣ thị tiên lƣợng thuận lợi, với sống tổng thể năm 89% Bàn luận Vì NGS đƣợc mơ tả nghiên cứu mang tính chất nhiều quy trình phức tạp, việc kiểm tra chất lƣợng khâu quan trọng Đặc biệt, cần ý đến chất lƣợng số lƣợng gDNA đƣợc tách từ nguồn u đặc nào: sinh thiết tƣơi giữ lạnh, mô FFPE, máu ngoại vi Đối với mẫu FFPE, dễ bị đứt gãy nên cần ý đến đánh giá bƣớc đo OD chạy gel 1% agarose Phƣơng pháp kết DNA isopropanol cải thiện cho lƣợng DNA cao từ mẫu FFPE so với phƣơng pháp dựa cột thƣờng dẫn tới đứt gãy DNA với thể tích tách rửa giới hạn Mặc dù sử dụng cách tủa, tinh ethanol, nhƣng mẫu FFPE không qua đƣợc khâu chất lƣợng cho NGS Do đó, thí nghiệm chúng tơi hƣớng tối ƣu hố cơng thức này(14) Trong giai đoạn đánh giá, cần có trao đổi bù trừ qua lại chất lƣợng sản lƣợng DNA để có đƣợc giá trị phù hợp Trong quy trình trên, lƣợng DNA khuyến khích 100 – 250 ng; nhƣng chất lƣợng DNA tốt, ta giảm lƣợng DNA ~ 10ng cho vào phản ứng ngƣợc lại Cần cân nhắc số chuẩn cho chất lƣợng sản lƣợng DNA chiết tách trƣớc chuyển sang bƣớc chuẩn bị thƣ viện gene Cách hiệu để đánh giá khả thành cơng bƣớc giải trình tự với mẫu dựa vào bƣớc đánh giá kĩ thuật qPCR để kiểm tra có mặt đoạn DNA với kích thƣớc khác cách khuếch đại đoạn DNA khác kích thƣớc so sánh kết khuếch đại(9) Hiện nay, việc chuẩn bị thƣ viện gene bao gồm nhiều bƣớc thủ công nên việc thực sai bƣớc dẫn đến thất bại chất lƣợng thƣ viện gene Phân tích gel microfluidic (điện di mao quản) bƣớc kiểm tra chất lƣợng thƣ viện gene trƣớc giải trình tự Do đó, có số bƣớc cần thận trọng cao để đạt đƣợc kết tốt Đầu tiên, cần đảm bảo ghi nhận lại vị trí mẫu đƣợc nạp vào giếng 96 well-plate để hạn chế nhầm lẫn kết giải trình tự Thứ hai, cần đảm bảo làm đĩa FPU bƣớc để đĩa bƣớc extension-ligation hoạt động nhiệt độ không tối ƣu dẫn đến sai số bƣớc giải trình tự Sau kiểm tra chất lƣợng thƣ viện, cần đảm bảo dung dịch chứa LNB1 Bead cần đƣợc trộn để đảm bảo đồng nồng độ DNA sau đƣợc tinh sạch; lƣợng DNA khơng đồng nhất, phản ứng giải trình tự xảy có thiếu đồng lƣợng DNA bám đĩa giải trình tự dẫn đến kết bao phủ trung bình khơng xác 28 Việc chuẩn bị thƣ viện gene, việc đảm bảo chất lƣợng quy trình tin sinh có vai trị định Với nhiều phần mềm để phân tích kết giải trình tự đƣợc thiết kế dƣới dạng mã nguồn mở nhƣ nay, ngƣời thực có nhiều lựa chọn, việc tự tạo thuật tốn để phân tích kết thơ hồn tồn Tuy nhiên, việc cần thiết tự thiết kế thuật toán xác định đƣợc giá trị cutoff thấp độ bao phủ (