U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là dạng u đặc nguyên phát của mô thần kinh giao cảm, có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh, thường gặp nhất trong các loại ung thư ở trẻ em, chiếm 15% các trường hợp tử vong do ung thư ở trẻ em. Tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại toàn bộ 20 exon và vùng tiếp giáp exon-intron của gen ARID1A.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 LÀM GIÀU TRÌNH TỰ TỒN BỘ EXON CỦA GEN ARID1A TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Lê Thị Kim Hòa*, Phạm Thị Hồng Đào*, Bùi Thị Thanh Huyền**, Nguyễn Thị Hà Giang***, Bùi Chí Bảo*** TĨM TẮT Giới thiệu: U nguyên bào thần kinh (UNBTK) dạng u đặc nguyên phát mơ thần kinh giao cảm, có nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh, thường gặp loại ung thư trẻ em, chiếm 15% trường hợp tử vong ung thư trẻ em Gần đây, nghiên cứu giải trình tự gen hệ (high-throughput next generation sequencing) phát đột biến liên quan đến điều hòa ngoại di truyền ung thư trẻ em, đặc biệt gen ARID1A UNBTK ARID1A tiểu phần phức hợp SWI/SNF tham gia điều hòa phiên mã gen thơng qua thay đổi cấu trúc chromatin Do đó, việc xây dựng quy trình giải trình tự gen thơng qua làm giàu sản phẩm exon ARID1A cần thiết Mục tiêu: Tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại tồn 20 exon vùng tiếp giáp exon-intron gen ARID1A Phương pháp: Khảo sát mồi in silico, khảo sát nhiệt độ bắt cặp, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, kiểm chuẩn phương pháp giải trình tự Áp dụng quy trình khảo sát DNA tách chiết từ máu nhóm đối chứng từ khối u bệnh nhân UNBTK Toàn sản phẩm khuếch đại xác định kỹ thuật giải trình tự Sanger Kết quả: Tối ưu phản ứng PCR cặp mồi 20 exon từ phần exon (1b) đến exon 20 Tuy nhiên, exon 1a chưa tối ưu hóa thành cơng sản phẩm gen chứa nhiều vùng giàu GC Kết luận: Quy trình tối ưu hóa PCR thành cơng bước đầu xây dựng quy trình giải trình tồn exon gen ARID1A thành cơng Từ khóa: U ngun bào thần kinh, làm giàu sản phẩm PCR, ARID1A ABSTRACT TARGETED GENE ENRICHMENT FOR SEQUENCING OF ARID1A IN NEUROBLASTOMA Le Thi Kim Hoa, Pham Thi Hong Dao, Bui Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Ha Giang, Bui Chi Bao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 136 - 143 Background: Neuroblastoma (NB) is a primitive solid tumor of sympathetic system which originates from neural crest NB is the most common tumor of children, accounting for 15% cases of death in pediatric cancer Recent studies using high-throughput next generation sequencing identified mutations that involved in epigenetic regulations, particularly ARID1A gene in neuroblastoma ARID1A is a subunit of SWI/SNF complex which participates in transcriptional regulation through chromatin remodeling Until now, there is no ARID1A sequencing data reported of NB cases in Vietnam Therefore, establishing the process of ARID1A sequencing through enriching ARID1A exon products is required Objective: To identify all 20 exons and exon-intron boundary regions of ARID1A gene Methods: Optimizing all PCR parameters for 20 exons of ARID1A gene DNA was extracted from blood of Đại học khoa học tự nhiên TP HCM Bệnh viện Nhi Đồng Đại học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: TS Bùi Chí Bảo, ĐT: 09097008225 Email: bcbao@ump.edu.vn 136 Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học healthy people and tumors of neuroblastoma patients All PCR products were confirmed by Sanger method Results: PCR products showed specific for all primer designs of ARID1A from exon to 20, and partial exon (1b) Exon 1a was unqualified due to high GC contents Conclusion: Successful optimization for 20 exons of ARID1A and ready to step in next sequencing of the whole exomes Key words: Neuroblastoma, enrichment, sequencing, ARID1A hóa phát triển tế bào BAF250a tương tác ĐẶT VẤN ĐỀ với vùng methyl hóa nhằm làm “im lặng” U nguyên bào thần kinh (UNBTK) gen phiên mã số ung thư người Đột dạng u đặc trẻ em, chứa tế bào ung thư biến gen ARID1A tìm thấy nhiều hình thành từ mơ thần kinh tuyến thượng loại ung thư khác với tần số đột biến cao thận, cổ, ngực, cột sống Hầu hết trường như: ung thư tế bào ác tính tử cung (49,1%), hợp UNBTK xảy trẻ em tuổi UNBTK ung thư nội mạc tử cung (39%), ung thư dày chiếm khoảng 8-10% trường hợp ung thư (18,7%), ung thư bàng quang (14,3%) , ung thư trẻ em nguyên nhân gây tử vong cho 15% ruột kết (9,7%) ung thư phổi (9,7%)(6) Như số ca tử vong ung thư trẻ em(1) Bệnh nhân việc khảo sát đột biến gen ARID1A thường phát bệnh giai đoạn trễ trường hợp mắc UNBTK - hoàn toàn cần u di Bệnh nhân UNBTK có tỷ lệ tái phát thiết, giúp xác định vai trò gen sau điều trị tử vong cao Nguyên nhân việc hình thành phát triển khối u Ở giai đoạn thiếu sở di truyền để tiên lượng bệnh, chẩn nghiên cứu, chúng tơi tiến hành tối đốn điều trị hiệu Do đó, việc nghiên ưu hóa quy trình PCR tồn exon gen cứu biến đổi gen nhằm xây dựng sở di ARID1A nhằm thu nhận sản phẩm PCR đủ truyền UNBTK qua cung cấp dấu ấn chất lượng tạo tiền đề cho trình giải trình tự sinh học hỗ trợ chẩn đoán, điều trị, phát dư ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU lượng bệnh theo dõi tình trạng bệnh cần thiết Ở Việt Nam, có hai cơng trình nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu UNBTK bệnh viện Nhi Trung Ương Đại Mẫu mô UNBTK thu nhận từ bệnh học Y Dược TP HCM nhằm sàng lọc nhóm nguy viện Nhi Đồng Tiêu chuẩn chọn mẫu: bệnh MYCN(11,12) Nhiều nghiên cứu nhân chưa phát khối u khác chưa UNBTK giải trình tự gen hệ qua điều trị, đồng thời không mắc hội chứng giúp phát nhóm gen thường xun đột Coffin-siris (vì liên quan đến di truyền đột biến biến bệnh nhân như: MYCN, ALK, gen ARID1A) ATRX,(1,2)… đồng thời ghi nhận tác Thu nhận mẫu động yếu tố điều hòa ngoại di truyền Máu thu nhận từ tình nguyện viên (epigenetic), bật ARID1A vai khỏe mạnh trò chúng thất bại điều trị giai đoạn sớm tiên lượng xấu bệnh nhân UNBTK vào năm 2013(8) ARID1A (AT-rich interactive domain – containing protein 1A) gen ức chế khối u, nằm cánh ngắn NST số (1p35.3) ARID1A mã hóa protein BAF250a, tiểu phần lớn phức hợp SWI/SNF có chức điều hòa biến đổi chromatin q trình tăng trưởng, biệt Thần kinh Mẫu mô thu nhận bệnh viện Nhi Đồng Mô sau phẫu thuật giữ môi trường DMEM (Invitrogen), 10% FBS, 5% PS (Kháng sinh) Tách chiết DNA DNA gen ly trích Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) 137 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Đo nồng độ độ tinh DNA, mẫu có giá trị tỷ lệ mật độ quang đo bước sóng 260/280 đạt từ 1,8 – 2,0 sử dụng để tiến hành phản ứng PCR Thiết kế mồi Mồi thiết kế phần mềm CLC Main Workbench 5.5 dựa trình tự tham khảo gen ARID1A NCBI (NG_029965.1) Độ đặc hiệu mồi kiểm tra phần mềm Primer-BLAST NCBI Chương trình trực tuyến SNPCheck (https://secure.ngrl.org.uk/SNPCheck/snpcheck.htm) sử dụng để kiểm tra vị trí đa hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) cần tránh đầu 3’ mồi Khuếch đại exon gen ARID1A kỹ thuật PCR Thiết lập điều kiện cho phản ứng PCR với phản ứng PCR có chứa thành phần phản ứng Kit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (TaKara, Nhật Bản) chu trình luân nhiệt thực máy Mastercycler@ProS (Eppendorf, Đức) bảng Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Bảng 1: Điều kiện phản ứng PCR ban đầu Thành phần phản ứng PCR buffer 10X dNTP (250µM loại ) Mồi xi (10 µM) Mồi ngược (10 µM) Taq Polymerase (5 U/µl) DNA (50 ng – 100 ng) H2O Tổng thể tích Thể tích (µl) 1,5 1,5 0,75 0,75 0,1 9,4 15 Chu trình luân nhiệt Nhiệt độ Thời gian o 98 C phút o 98 C 10 giây o 56 C 20 giây o 72 C 90 giây o 72 C 10 phút Giai đoạn Biến tính Bắt cặp Kéo dài o 72 C Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose Sử dụng gel agarose 2% có nhuộm ethidium bromide quan sát soi gel GelDoc-It TS 310 (UVP, USA), sản phẩm PCR cho băng kích thước Kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp Sanger Sản phẩm PCR tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, USA) Sản phẩm PCR sau tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA), theo chiều xi ngược Trình tự DNA đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ) Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench 5.5 so sánh kết giải trình tự với trình tự tham khảo NG_029965.1 NCBI KẾT QUẢ Kết thiết kế mồi thử nghiệm chạy mồi Gen ARID1A nằm cánh ngắn NST số (1p35.3) gồm 20 exon với chiều dài 86 kb thiết kế với 14 cặp mồi - Một số exon có kích thước ngắn nằm gần khuếch đại chung cặp mồi Bảng 2: Trình tự mồi để khuếch đại 20 exon gen ARID1A STT Mồi 138 Tên mồi 1Fa 1Ra 1Fb 1Rb 2F 2R 3F Trình tự (5’ -> 3’) GGTAAAATGGCAGTGCTGAG TTCCCGTTCGAGTTCTTCAG TCGGAGCTGAAGAAAGCCGA GAGAGAAGAGCCAGACAATG AGGTTACTAGGTTGGTCTCA ATTCCTGTCAAGAGGCTTGG CATCAGTGCATAGCTTCTCA Vị trí exon Kích thướcPCR (bp) 1008 1217 466 3-4 1872 o %GC Tm ( C) 55 50 45 50 45 55,4 55,4 53,4 55,4 53,4 Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 STT Mồi 10 11 12 13 14 15 16 Tên mồi 4R 5F 6R 7F 8R 9F 11R 12F 12R 13F 17R 18F 18R 19F 19R 20Fa 20Ra 20Fb 20Rb 20Fc 20Rc 20Fc2 20Rc2 1Fa2 1Ra2 Trình tự (5’ -> 3’) TTGCATTGGTTTCCTCTCTG ACGAGTGAAACACTGTCTCA CTGCATAGGGCACTCAAATG CAGGATAAGGATGGAGAGCA CTGGTTTAGGTCCAGAAGCA ACAGCACTATTTGGCTCCAG TACCACATGAAGCCAGTGAG GATGAATACCTTACAGCCTG ATCCTGAATAAGAGGCCAGG TTCGTGTGTTTGTGTGAGAG GCTTCTTAGACTTCAACACG TGGCATCTGTGGGCTTTATG TAAGGTGGAGGGAACAATGG CAGAGTAGCTTCACTGATGG CCAAGGTGGCTAAAGATGAG CCTCTCCCAACTGATACAGA CTCAAAGTCATTGCCTGGCA AACCCCACAGTAAGGATGAG AAGGAACAGAAAGGCGTGAG AGAATCCAGTTTACCCTGTG CTCACACTAAGGGAGGTTTG TGACTGCTGAACTGTGTGTGG TACAGCTTGCTGCTGACCCAG GCAGAAAGCGGAGAGTCACA CCCGTTCGAGTTCTTCAGGT Kết khảo sát bắt cặp mồi DNA tách chiết từ mẫu máu sử dụng để tối ưu hóa phản ứng PCR Tất 20 exon Nghiên cứu Y học Vị trí exon Kích thướcPCR (bp) 5-6 869 7-8 1296 - 11 1939 12 368 13 - 17 1560 18 1031 19 305 20a 982 20b 1192 20c 1355 216 1a 689 %GC 45 45 50 50 50 50 50 45 50 45 45 50 50 50 50 50 50 50 50 45 50 55 55 55 55 o Tm ( C) 53,4 53,4 55,4 55,4 55,4 55,4 55,4 53,4 55,4 53,4 53,4 55,4 55,4 55,4 55,4 55,4 55,4 55,4 55,4 53,4 55,4 57,2 57,8 57.8 57.4 khuếch đại thành phần phản ứng chu trình luân nhiệt theo bảng Kết điện di thể hình Hình 1: Kết điện di sản phẩm 14 phản ứng PCR M: Thang chuẩn GeneRuler kb Plus DNA Ladder A Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số đến (giếng đến 5) B Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số đến 14 (giếng đến 11) kích thước mờ Do đó, cặp mồi số Từ hình cho thấy 14 giếng trừ giếng số cần tối ưu điều kiện phản ứng PCR 4, tất giếng lại cho vạch điện di sáng rõ, kích thước vạch với kích mong muốn, khơng có sản phẩm ký sinh chứng tỏ với điều kiện bảng tối ưu để khuếch đại trình tự đích Trong đó, cặp mồi số cho kết âm tính cặp mồi số cho vạch điện di Thần kinh Đối với cặp mồi số (3F/4R), bổ sung Mg2+ 25 mM vào thành phần phản ứng Khảo sát nồng độ Mg2+ 1,5 mM (có sẵn Kit nên khơng bổ sung); mM (bổ sung 0,3 µl Mg2+ 25 mM); 2,5 mM (bổ sung 0,6 µl Mg2+ 25 139 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 mM) mM (bổ sung 0,9 µl Mg2+ 25 mM) Kết cho thấy, nồng độ Mg2+ mM (giếng 2) sản phẩm PCR cho vạch điện di kích thước, khơng có băng phụ như, sáng rõ so với sản phẩm phản ứng không bổ sung Mg2+ (giếng 1) (Hình 2) Như vậy, cặp mồi (3F/4R) cần bổ sung 0,3 µl Mg2+ 25 mM vào thành phần phản ứng PCR kết tối ưu Đối với cặp mồi số (1Fa/1Ra), tiến hành phản ứng PCR nhiệt độ bắt cặp khác nhau: 54oC, 56oC, 58oC, 60oC, 62oC, bổ sung 1M Betaine DMSO 5%, chí vùng exon 1a thiết kế thêm cặp mồi số 16 (1Fa2/1Ra2) tối ưu phản ứng PCR không cho sản phẩm mục tiêu Áp dụng điều kiện tương tự DNA từ mẫu NB06, NB25, NB46 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu trình bày hình Kết cho thấy hầu hết sản phẩm PCR cặp mồi cho vạch điện di kích thước, sáng rõ; trừ cặp mồi số (1Fb/1Rb), (3F/4R), (9F/11R), 10 (18F/18R) cho vạch phụ có kích thước thấp mờ so với vạch sản phẩm PCR mục tiêu (hình 3) Tuy nhiên, tăng nhiệt độ bắt cặp phản ứng lên 58oC cặp mồi 4, 7, 10 (hình 4A) 62oC cặp mồi số (hình 4B), kết sản phẩm PCR khơng sản phẩm ký sinh, vạch điện di sáng rõ, kích thước (hình 4) Hình 2: Hình kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi 3F/4R Giếng 1: Mg2+ 1,5Mm; Giếng 2: Mg2+ 2mM; Giếng 3: Mg2+ 2,5mM; Giếng 4: Mg2+ 3mM; M: thang chuẩn GeneRuler kb Plus DNA Ladder Hình 3: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số đến 14 mẫu NB06 M: thang chuẩn GeneRuler kb Plus DNA Ladder 140 Hình 4: Kết điện di cặp mồi 2, 4, 7,10 A Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số 4, 7, 10 B Kết điện di sản o phẩm PCR với cặp mồi số nhiệt độ bắt cặp 56 C (giếng o o o 1), 58 C (giếng 2), 60 C (giếng 3) , 62 C (giếng 4) Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Bảng 3: Điều kiện tối ưu phản ứng PCR exon Thành phần phản ứng (Tổng thể tích 15 µl) PCR buffer 10X : dNTP (250 µM loại ) Mồi xi (10 µM) Mồi ngược (10 µM) Taq Polymerase (5 U/µl) DNA (50 ng – 100 ng) Nước cất hai lần 1,5 µl 1,5 µl 0,75 µl 0,75 µl 0,1 µl µl 9,4 µl Giai đoạn o Biến tính : 98 C o 98 C o Bắt cặp: 62 C o Kéo dài: 72 C o 72 C phút 10 giây 20 giây 90 giây 10 phút 40 chu kỳ 2F/2R, 5F/6R, 7F/8R, 12F/12R, 13F/17R, , 19F/19R, 20Fa/20Ra, 20Fb/20Rb, 20Fc/20Rc PCR buffer 10X dNTP (250µM loại ) Mồi xi (10 µM) Mồi ngược (10 µM) Taq Polymerase (5 U/µl) DNA (50 ng – 100 ng) Nước cất hai lần 1,5 µl 1,5 µl 0,75 µl 0,75 µl 0,1 µl µl 9,4 µl Giai đoạn o Biến tính : 98 C o 98 C o Bắt cặp: 56 C o Kéo dài: 72 C o 72 C phút 10 giây 20 giây 90 giây 10 phút 40 chu kỳ 9F/11R, 18F/18R PCR buffer 10X dNTP (250µM loại ) Mồi xi (10 µM) Mồi ngược (10 µM) Taq Polymerase (5 U/µl) DNA (50 ng – 100 ng) Nước cất hai lần 1,5 µl 1,5 µl 0,75 µl 0,75 µl 0,1 µl µl 9,4 µl Giai đoạn o Biến tính : 98 C o 98 C o Bắt cặp: 58 C o Kéo dài: 72 C o 72 C phút 10 giây 20 giây 90 giây 10 phút 40 chu kỳ PCR buffer 10X dNTP (250 µM loại) Mồi xi (10 µM): Mồi ngược (10 µM) Taq Polymerase (5 U/µl) DNA (50 ng – 100 ng): 2+ Mg 25 mM Nước cất hai lần 1,5 µl 1,5 µl 0,75 µl 0,75 µl 0,1 µl µl 0,3µl 9,1 µl Giai đoạn o Biến tính : 98 C o 98 C o Bắt cặp: 58 C o Kéo dài: 72 C o 72 C phút 10 giây 20 giây 90 giây 10 phút 40 chu kỳ Exon 1Fb/1Rb 3F/4R Chu trình luân nhiệt Kết giải trình tự Hình 5: Vùng poly A exon 20c mẫu NB06 Các sản phẩm PCR mẫu NB06, NB25, NB46 13 cặp mồi (từ exon 1b đến 20) tối ưu hóa , khơng có cặp mồi số (1Fa/1Ra) sau tinh tiến hành giải trình tự chuỗi Thần kinh DNA Tồn kết giải trình tự chuỗi DNA cho kết trùng với vùng gen ARIDA từ GenBank Tuy nhiên, vùng trình tự khuếch đại với cặp mồi 14 (20Fc/20Rc) (nằm 141 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 exon 20) có hai vùng poly A dài 10 nucleotide nên không đọc kết sau vùng poly A (hình 5) BÀN LUẬN Thành phần phản ứng chu trình luân nhiệt thiết lập ban đầu (Bảng 1) thích hợp để khuếch đại đa số exon gen ARID1A Tuy nhiên, cặp mồi 3F/4R cho kết vạch điện di mờ nên tối ưu nồng độ Mg2+ Hầu hết DNA polymerase cần cation hóa trị II đồng yếu tố để thực chức Phần lớn trường hợp tối ưu hoá phản ứng PCR sử dụng Mg2+ để tăng hoạt động Taq polymerase Tuy nhiên, Mg2+ tạo thành phức hợp với dNTP, primer, DNA mạch khn mang điện tích âm Nếu lượng Mg2+ nhiều làm tăng khả bắt cặp sai primer (mismatched primer), đồng thời làm giảm độ nhạy enzyme việc gắn nucleotide vào mạch khuôn tạo sản phẩm khơng đặc hiệu(5) Chính nồng độ Mg2+ mM sản phẩm PCR cho vạch điện di sáng rõ, không băng phụ; lên 2,5 mM mM xuất sản phẩm khơng đặc hiệu So sánh kết PCR mẫu máu mẫu mơ nhận thấy có khác biệt exon 1b, - 4, - 11 18 sử dụng DNA mẫu mơ kết PCR cho sản phẩm ký sinh Sự khác biệt chất ức chế PCR xuất phát từ mẫu Kit tách DNA Các chất ức chế bất hoạt Taq polymerase, phá hủy bắt DNA, can thiệp vào bước ly giải tế bào Đối với mơ ung thư chứa collagen, heme, hemoglobin,… nguyên nhân làm giảm hiệu PCR Thông thường, để ức chế chất cần bổ sung albumin từ huyết bò (BSA – bovine serum albumin)(9) - gia tăng nhiệt độ bắt cặp nhằm tăng khả bắt đặc hiệu mồi vào DNA mạch khuôn Do đó, tăng nhiệt độ bắt cặp lên 58oC cặp mồi 3F/4R, 9F/1R, 18F/18R bắt đặc hiệu với DNA cho sản phẩm PCR tốt nhất; 142 cặp mồi 1Fb/1Rb hoạt động tốt 62oC Vùng exon có trình tự GC chiếm giàu GC tới 77% nên dễ tạo cấu trúc thứ cấp ảnh hưởng đến phản ứng PCR Đây nguyên nhân gây thất bại khuếch đại vùng exon Nghiên cứu tiến hành tách riêng vùng trình tự thành hai vùng nhỏ, đồng thời khảo sát nhằm tối ưu nhiệt độ bắt cặp, nồng độ Mg2+ chí tối ưu nồng độ Betaine DMSO, phối hợp 1M Betaine DMSO 5% betaine DMSO giúp ổn định mạch khn, hạn chế tạo cấu trúc thứ cấp(6,5,10), nhiên khơng cho kết khả quan Vấn đề giải cách sử dụng Kit PCR chuyên cho vùng giàu GC để khuếch đại exon 1a Kết giải trình tự exon tối ưu hóa PCR, cho thấy vùng khuếch đại 1kb (3F/4R, 7F/8R, 9F/11R, 13F/17R, 20Fc/20Rc) cần giải trình tự mồi xuôi mồi ngược nhằm thu nhận tồn trình tự với kết tối ưu Một số trình tự có chứa cấu trúc poly A/T (exon5, 6) nên tránh sử dụng mồi xuôi mà thay mồi ngược để thu nhận kết Ngoài ra, exon 20c, hai trình tự poly A dài 10 nucleotide nằm hai mồi cách 216 nucletotide gây nhiễu tín hiệu giải trình tự Do đó, vùng exon 20c thiết kế thêm mồi xuôi (20Fc2) mồi ngược (20Rc2) (bảng 2) vùng poly A để đọc tồn exon Kết giải trình vùng poly A cho thấy với cặp mồi 20Fc2 20Rc2 cho thấy đọc hết toàn vùng poly A Như vậy, 20 exon gen ARID1A trừ exon 1a cho kết giải trình tự sóng tốt Trong nghiên cứu này, DNA tách chiết từ mẫu máu người tình nguyện khỏe mạnh để tối ưu phản ứng PCR Quy trình tối ưu áp dụng lên đối tượng nghiên cứu ba mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô UNBTK Tuy nhiên, kết giải trình tự khơng cho thấy bất thường gen ARID1A Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 KẾT LUẬN Nghiên cứu tối ưu phản ứng PCR cho hầu hết 20 exon gen ARID1A (trừ 1a) Tạo tảng cho nghiên cứu nhằm phát đột biến gen ARID1A bệnh nhân UNBTK Việt Nam Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106YS.06-2014.48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cheung NK, et al (2013) Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy Nat Rev Cancer, 13(6): 397-411 Daniel A, et al (2014) Neuroblastoma In: Graham Dellaire Cancer Genomics, 1st edition, pp 357-376 Academic Press, San Diego Jennifer N, et al (2013 ) ARID1A mutations in cancer: another epigenetic tumor suppressor? Cancer Discov, 3(1): 35-43 Jensen MA (2010) DMSO and betaine greatly improve amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis PLoS One, 5(6): e11024 Kuslich CD, et al (2008) Overview of PCR In: Sean RG, Emily AW (eds) Current Protocols Essential Laboratory Thần kinh 10 11 12 Nghiên cứu Y học Techniques, 1st edition, pp 10.2.1-10.2.31 Jonh Wile & Sons, New Jersey Masliah-Planchon J, et al (2015) SWI/SNF chromatin remodeling and human malignancies Annu Rev Pathol, 10: 145-71 Radstrom P, et al (2004) Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples Mol Biotechnol, 26(2): 13346 Sausen M, et al (2013) Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma Nat Genet, 45(1): 12-7 Schleiermacher G, et al (2014) Recent insights into the biology of neuroblastoma Int J Cancer, 135(10): 2249-61 Susan Frackman, et al (1998) Betaine and DMSO: Enhancing Agents for PCR Promega Notes, 65: 27 Trương Đinh Kiều Diễm cs (2015) Xây dựng quy trình phân loại nhóm nguy cao U nguyên bào thần kinh khuếch đại MYCN Y học TP Hồ Chí Minh, tập 19: 1-7 Vũ Đình Quang cs (2013) Đánh giá khuếch đại gen MYCN bệnh nhân u nguyên bào thần kinh Y Khoa, (1): 68-73 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 143 ... c u, chúng tơi tiến hành tối đốn đi u trị hi u Do đó, việc nghiên u hóa quy trình PCR tồn exon gen c u biến đổi gen nhằm xây dựng sở di ARID1A nhằm thu nhận sản phẩm PCR đủ truyền UNBTK qua cung... mồi số (1Fa/1Ra) sau tinh tiến hành giải trình tự chuỗi Thần kinh DNA Tồn kết giải trình tự chuỗi DNA cho kết trùng với vùng gen ARIDA từ GenBank Tuy nhiên, vùng trình tự khuếch đại với cặp mồi... enrichment, sequencing, ARID1A hóa phát triển tế bào BAF250a tương tác ĐẶT VẤN ĐỀ với vùng methyl hóa nhằm làm “im lặng” U nguyên bào thần kinh (UNBTK) gen phiên mã số ung thư người Đột dạng u đặc trẻ