sử dụng công cụ tin sinh học giải trình tự thế hệ mới trong tìm các đột biến trên gene abca12 của ca bệnh harlequi ichthyosis

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GENE ABCA12 CỦA CA BỆNH HARLEQUI ICHTHYOSIS Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN VÕ VĂN THÀNH NIỆM Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GENE ABCA12 CỦA CA BỆNH HARLEQUI ICHTHYOSIS Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Võ Văn Thành Niệm Đại Học Y Dƣợc TPHCM Vũ Nguyễn Thanh Tùng Đại học Quốc Tế Bùi Chí Bảo Đại Học Y Dƣợc TPHCM Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 Kết QC gDNA 26 Kết chạy NGS 26 Kết phân tích đột biến 28 Bàn luận 29 KẾT LUẬN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các thông số để định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA 17 Bảng Thông số kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng DNA phân mảnh 19 Bảng Chu trình nhiệt Gắn index khuếch đại thƣ viện 21 Bảng Thống kê sơ xuất thông tin tổng quan liệu 27 Bảng Chi tiết đột biến thêm đoạn ABCA12 29 Bảng Chi tiết đột biến điểm ABCA12 29 DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế gây đột biến gen ABCA12 Hình Cơ chế hoạt động ABCA12 - protein vận chuyển Hình Cấu trúc xếp lớp màng tế bào, lipid enzyme ngƣời bị HI Hình Qúa trình tác động gây bệnh HI protein ABCA12 Hình Vị trí gen ABCA12 chromosome 10 Hình Sơ đồ quy trình tiến hành bƣớc đề tài 14 Hình Quy trình xử lý tách chiết gDNA 15 Hình Kiểm tra độ phân mảnh gDNA gel agarose 1%, 100V 30 phút Mẫu gDNA bị đứt gãy giếng 2, 3, 4,5 gDNA giếng 6, 8, 9, 10, 11 đạt chất lƣợng để tiến hành chạy NGS 18 Hình Sơ đồ tổng quát bƣớc giải trình tự ADN b ng NGS 18 Hình 10 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh 20 Hình 11 Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA 22 Hình 12 Quy trình kiểm tra thƣ viện 22 Hình 13 Chuẩn bị thƣ viện DNA 23 Hình 14 Dùng mồi đặc hiệu với adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone 24 Hình 15 Giải trình tự hệ 25 Hình 16 Kiểm tra QC DNA đầu vào 26 Hình 17 Đánh giá chất lƣợng liệu giải trình tự A: Điểm chất lƣợng base, B: Điểm chất lƣợng chuỗi trình tự, C: Tỷ lệ base, D: Tỷ lệ GC liệu, E: Số lƣợng base N liệu, F: Chiều dài chuỗi trình tự, G: Mức độ lặp lại chuỗi trình tự 28 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa HI Harlequin Ichthyosis AR-CI Autosomal Recessive Congentital Chứng vảy cá bẩm sinh di truyền Ichthyoses thể lặn nhiễm sắc thể thƣờng CIE Ichthyosiform Erythroderma Đỏ da dạng vảy cá bẩm sinh LI Lamellar Ichthyosis Vảy cá vảy NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Harlequin ichthyosis (HI) nhóm bệnh da di truyền mắc phải có biểu đặc trƣng nhiều vảy da lan tỏa Ichthyosis thuật ngữ xuất phát từ “ichthy” tiếng Hy Lạp nghĩa “cá” Harlequin ichthyosis (HI) bệnh rối loạn di truyền bẩm sinh trầm trọng bệnh da vảy cá Bệnh vảy cá di truyền thƣờng xuất từ lúc sinh tháng đầu năm đầu sau sinh tồn suốt đời Di truyền sừng hóa bất thƣờng đặc trƣng b ng nhiều vảy da kèm theo khơng kèm theo q sản thƣợng bì thâm nhiễm viêm Nhiều vảy da phản ánh thay đổi biệt hóa thƣợng bì Căn bệnh thƣờng gây tử vong sau sinh di truyền theo dạng lặn nhiễm sắc thể thƣờng (1,2) Trẻ sơ sinh với HI thƣờng đƣợc bao phủ lớp sừng dày vết rạn nứt sâu da Một số đặc điểm khác bao gồm: chứng lộn mí lộn mơi trầm trọng, co rút ngón tay, rụng tóc chậm phát triển mặt trí tuệ Trong vài tháng đầu tiên, lớp sừng tách rời để lại lớp da đỏ vảy, kiểu hình kiểu hình trì tiếp tục đời bệnh nhân HI họ đƣợc chăm sóc điều trị tích cực (3) Hình Cơ chế gây đột biến gen ABCA12 Harlequin ichthyosis, dạng nghiêm trọng chứng ngứa bẩm sinh bẩm sinh (ARCI), dạng lặn ichthyosis có đoạn lớn gen ABCA12 bị thiếu sai tả ABC protein vận chuyển kết hợp với ATP Có số lƣợng lớn gen ABC, “A12” xác định gen mà nói đến “Protein vận chuyển kết hợp với ATP” tên lạ mắt cho cổng màng tế bào hoạt động giống nhƣ cửa trƣợt tự động Cánh cửa cần sức mạnh để làm cho cửa mở đứng thảm bảo mở đồng thời Khơng có điện, khơng mở Khơng có ngƣời thảm, khơng mở Vì vậy, cổng ABCA12 cần lƣợng dƣới dạng ATP thứ cần phải phía bên màng Phiên ngắn - liên kết với thứ đó, trở thành ADP P lƣợng, lƣợng đƣợc sử dụng để cấp lƣợng cho cửa trƣợt Nếu bạn đọc nơi khác ABCA12, bạn thấy ngƣời gọi “gen đƣợc bảo tồn cao” Điều có nghĩa bạn nhìn vào gen chuột, cá, ruồi đục quả, nhím hay ngƣời, động vật có gen này, trƣờng hợp, gen có trình tự giống Điều cho biết r ng gen thực quan trọng bị rối tung lên, chủ nhân đột biến thƣờng khơng sống đủ lâu để truyền cho Theo nghiên cứu cho thấy có 87% tổn thƣơng da bẩm sinh ichthyoses Đây bệnh mà đột biến xảy gen biểu mơ, cấu trúc bình thƣờng bị gián đoạn Chúng biểu b ng triệu chứng khác nhau, nhƣng có dấu hiệu liên kết tất hình thức - làm gia tăng keratin hóa lột da mặt Việc điều trị nhiễm ichthyosis thách thức y học đại Tuy nhiên, nay, có kỹ thuật cho phép cải thiện chất lƣợng sống bệnh nhân (kể trẻ sơ sinh) Trong số trƣờng hợp, nhiễm trùng da cá xảy ngƣời lớn Thông thƣờng, điều diện bệnh nghiêm trọng khác phá vỡ thể Chẩn đoán điều trị bệnh nhân lớn tuổi khơng có khác biệt Tần suất HI rơi vào khoảng 1:300,000 ca sinh Chỉ 100 ca đƣợc báo cáo công bố nghiên cứu quốc tế; đó, dƣờng nhƣ khơng có liên hệ chủng tộc nhƣ địa lý với bệnh(1) Trẻ sơ sinh mắc bệnh Harlequin đƣợc bao phủ lớp da dày bị rạn nứt thành mảng Lớp da dày làm co kéo biến dạng khuôn mặt bé Sự kéo căng da vùng quanh mắt, miệng gây mí mắt mơi bị đảo ngƣợc ngồi, lộ rõ niêm mạc màu đỏ mà bình thƣờng n m bên Vùng ngực bụng co kéo da, làm việc ăn uống thở khó khăn Tay chân nhỏ sƣng phồng, co rút phần Tai biến dạng khiếm khuyết dính tồn vào đầu lớp da dày Trƣớc đây, bé Harlequin sống sót ngày đầu sau sinh Tuy nhiên, với tiến chăm sóc sơ sinh, bé mắc bệnh đƣợc cứu sống Những bé sống sót phát triển thể chất bị chậm lƣợng cần thiết khổng lồ cho chức đòi hỏi lớp da bé, nhƣng phát triển tâm thần trí thơng minh đa số bình thƣờng Bệnh rối loạn di truyền gen lặn, nghĩa nhận hai gen lặn, từ cha từ ngƣời mẹ, nhƣng ngƣời cha khơng có biểu triệu chứng bên Biểu bệnh lớp biểu ngƣời có cấu trúc phức tạp - bao gồm lớp Phần sâu đƣợc thể tế bào gốc phân chia làm phát sinh tất tế bào lại lớp biểu bì Các lớp horny bề ngồi n m bề mặt Nó đƣợc đại diện quy mô - tế bào cũ trải qua phân hủy phần làm đầy keratin (một protein mang lại sức mạnh) Thông thƣờng, tế bào gốc biến thành vảy sừng 21 ngày Với ôxy hố, chu kỳ bình thƣờng tế bào bị gián đoạn B ng cách tăng lƣợng keratin làm giảm tuổi thọ tế bào tất lớp, hình thành q mức vảy lơng Lớp bề mặt (horny) làm tăng đáng kể độ dày tích cực sluschivaetsya Trong tất lớp biểu bì, trình dystrophic xảy ra, da khơng có khả cung cấp chức bảo vệ Nguyên nhân gây bẩm sinh đột biến - thay đổi cấu trúc bình thƣờng gen Điều dẫn đến việc vi phạm việc tạo protein, enzyme chất khác gây lớp vỏ hạt Nguyên nhân đáng tin cậy xuất họ không rõ ràng, nhiên, yếu tố không thuận lợi sau bật: điều trị da cá Cân nhắc di truyền học cha mẹ - có mặt phả hệ trẻ em có bệnh di truyền (các hội chứng Patau, Down, Shereshevsky-Turner, dị tật bẩm sinh, cá nƣớc bọt, vv); ngồi cịn số ngun nhân bên ngồi nhƣ thói quen xấu cha mẹ: uống rƣợu (đặc biệt nguy hiểm - thai kỳ tháng trƣớc thụ thai), hút thuốc lạm dụng chất gây nghiện (cùng kỳ), nghiện ma túy (khơng tính thời gian liều lƣợng); Sự có mặt bệnh nhiễm trùng mạn tính thể cha lẫn mẹ (khơng có phận sinh dục, mà chứng bệnh somatic: viêm thận, viêm dày, viêm gan bệnh khác); Bất kỳ tiếp xúc với sản phẩm có sản phẩm có hại (tăng cƣờng phóng xạ, sản xuất, khí thải kim loại nặng vào khí quyển, vv)(6) Bất kỳ ảnh hƣởng bất lợi ảnh hƣởng đến bố mẹ đƣợc phản ánh họ Sự quan trọng b ng trƣờng hợp có trạng thái sinh vật, cha lẫn mẹ Do đó, cần tìm kiếm ngun nhân gây chứng ichthyosis gia đình trẻ Các hình thức khác đáng kể triệu chứng tiến trình bệnh Theo nguyên tắc, đƣợc xác định dấu hiệu bên ngoài, kể từ ngày cá ichthyosis Điều cho phép bạn lựa chọn chiến thuật chăm sóc cho đứa trẻ cách kịp thời bắt đầu điều trị Một số chứng vảy cá bẩm sinh di truyền thể lặn nhiễm sắc thể thƣờng – autosomal recessive congentital ichthyoses (AR-CIs) khác bao gồm Ichthyosiform erythroderma (CIE) lamellar ichthyosis (LI) bệnh lý có kiểu hình chồng lấp; nhiên, đặc điểm đặc biệt HI khó nhầm lẫn với bệnh trên, bệnh nhân sống sót HI sau sinh thƣờng có kiểu hình giống CIE (3) Một số gen có liên quan đến ARCI đƣợc cơng bố bao gồm: gen phổ biến bệnh ARCI - TGM1; hai gen ALOX12B, ALOXE3, thƣờng liên quan tới CIE kiểu hình đan xen LI/CIE; gen liên quan đến chuyển hóa lipid kết dính tế bào – NIPAL4; gen gia đình cytochrome P450 – CYP4F22; gen liên quan tới việc hình thành vách ngăn biểu bì – PNPLA1 gen ABCA12 Gần năm 2005, nhà khoa học phát nguyên nhân bệnh đột biến gen ABCA12 Gen đƣợc tin tƣởng có vai trị mã hóa protein vận chuyển chất béo qua màng tế bào Việc xác định gen giúp chẩn đoán tiền sản bệnh qua phƣơng pháp chọc màng ối để xét nghiệm Hiện tại, ABCA12 đƣợc công nhận rộng rãi gen gây nên bệnh HI biến gen gây chức trầm trọng lớp vách ngăn da(4) Gen ABCA12 hoạt động số loại tế bào da số mơ khác, chẳng hạn nhƣ tinh hồn, thai, phổi, dày não gan thai nhi Protein cần thiết cho phát triển bình thƣờng da, cung cấp rào cản thể môi trƣờng xung quanh Nó vận chuyển epidermoside, glucosylceramide, khỏi keratinocytes tầng lớp sừng lớp biểu bì(10) Gen ABCA12 n m cánh tay dài (q) nhiễm sắc thể vị trí 34 35, từ 215,621,772 bp đến 215,828,656 bp Một số đột biến gen ABCA12 đƣợc biết gây bệnh ichthyosis loại harlequin(7) Hầu hết đột biến đƣợc dự đoán dẫn đến vắng mặt protein ABCA12 sản xuất phiên nhỏ protein vận chuyển lipid cách Mất protein chức ABCA12 gây nhiều vấn đề với phát triển lớp biểu bì trƣớc sau sinh Bất thƣờng vận chuyển lipid ngăn không cho da hình thành hàng rào hiệu dẫn đến vảy cứng, dày đặc trƣng cho bệnh héo rũ harlequin Những c Qubit 3.0 Đo nồng độ DNA xác nhờ vào Ion Sphere bắt vào dsDNA Cần đo trƣớc mẫu chuẩn có nồng độ 10 ng/µL nh m tạo đƣờng chuẩn trƣớc cần đo mẫu DNA đầu vào Tuy nhiên, ngƣỡng phát Qubit 600 ng/µL cần phải sử dụng máy đo quang phổ trƣớc thực bƣớc pha loãng nồng độ phù hợp Qubit Bảng Các thông số để định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA Thiết bị Kết DropSene96 A260/A230 Dấu hiệu Phạm vi lý tƣởng Xác định mức độ nhiễm bẩn hóa chất (ví dụ: 1,5 – 2,2 ethanol) DropSene96 A260/A280 Xác định mức độ nhiễm bẩn protein 1,6 – 2,2 DropSene96 Nồng độ Định lƣợng DNA > ng/µL TapeStation DNA smear Xác định mức độ tồn vẹn DNA (ví dụ: giảm 50% > 1.000bp chất lƣợng/ đứt gãy DNA đƣợc tách chiết) Qubit2.0 Nồng độ Mức độ định lƣợng DNA xác > ng/µL 17 Hình Kiểm tra độ phân mảnh gDNA gel agarose 1%, 100V 30 phút Mẫu gDNA bị đứt gãy giếng 2, 3, 4,5 gDNA giếng 6, 8, 9, 10, 11 đạt chất lƣợng để tiến hành chạy NGS Hình Sơ đồ tổng quát bƣớc giải trình tự ADN b ng NGS Chuẩn bị mẫu: ADN đƣợc cắt thành đoạn nhỏ có kích thƣớc từ 200 đến 500 bp, gắn adapter phù hợp; Các đoạn ADN sau gắn adapter đƣợc tiến hành làm giàu b ng PCR (Polymerase chain reaction) môi trƣờng dung dịch (emulsion PCR) cơng nghệ giải 18 trình tự máy đọc trình tự 454 Roche máy đọc trình tự SOLiD Life Technologies PCR bắc cầu (bridge PCR) theo công nghệ Solexa Illumina; Đọc trình tự đoạn ADN đƣợc làm giàu b ng công nghệ tƣơng ứng 2.4 Chuẩn bị mẫu DNA a Phân mảnh DNA đầu vào Covaris E220 (Covaris, Mỹ) đƣợc sử dụng để cắt DNA hệ gen thành mảnh kích thƣớc khác b ng sóng siêu âm Bảng Thơng số kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng DNA phân mảnh Khung kĩ thuật phân mảnh DNA theo kích cỡ: 200 400 500 bp bp bp 175 140 105 10% 5% 5% Số lƣợng dao động âm có burst 200 200 200 Đo thời gian giây 180 55 80 Nhiệt độ Nhiệt độ mẫu nƣớc 7°C 7°C 7°C Mức nƣớc Mức nƣớc đƣợc làm đầy 6 Thuật ngữ Định nghĩa Peak Incident Đây thƣớc đo công suất siêu âm tức thời áp dụng Power (PiP) cho mẫu Dải từ 2,5 đến 500 Watts Period Phần trăm thời gian mà đầu dò đƣợc "bật" tạo sóng frequency âm (PF) Cycles Per Burst Thời gian ảnh hƣởng 19 Hình 10 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh Sản phẩm DNA sau phân cắt đƣợc lựa chọn lại b ng SPRI Beads theo nồng độ thích hợp Nồng độ cao thu đƣợc nhiều phân mảng DNA kích thƣớc nhỏ ngƣợc lại b Adenyl hóa (tạo poly A) Mục đích nh m tạo nơi bắt cặp cho adapter vào phân mảng DNA Hỗn hợp phản ứng adenyl hóa đƣợc tạo thành đá lạnh cho mẫu DNA Đối với nhiều mẫu, master mix đƣợc thực với 0,5 phản ứng dƣ thừa 20 μl hỗn hợp phản ứng đƣợc thêm vào 30 μL mẫu DNA trộn b ng pipet Hỗn hợp đƣợc ủ nhiệt độ 30 phút nhiệt độ 37oC khơng có nắp đun nóng Bƣớc đƣợc theo sau b ng cách làm hạt AMPure XP b ng cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 lần thể tích phản ứng, tẩy rửa b ng nƣớc khơng chứa nuclease 15 μL Điều đảm bảo phục hồi, làm tập trung tất đoạn DNA từ phản ứng mà khơng chọn kích cỡ c Gắn Adapter Phản ứng nối đƣợc tạo thành đá lạnh cho mẫu DNA Đối với nhiều mẫu, master mix đƣợc thực với 0,5 phản ứng dƣ thừa 37 μl hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn với 13 μL mẫu DNA trộn b ng pipet Hỗn hợp đƣợc ủ 15 phút 20 ° C máy gia nhiệt mà khơng cần nung nóng 20 Bƣớc đƣợc theo sau b ng cách làm hạt AMPuper XP b ng cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 lần thể tích phản ứng, tẩy rửa b ng nƣớc không chứa nuclease 32 μL Điều đảm bảo phục hồi, làm tập trung tất đoạn DNA từ phản ứng mà không chọn kích thƣớc d Gắn index khuếch đại thƣ viện Các cặp index đƣợc lựa chọn trƣớc để đánh dấu phân biệt mẫu DNA từ nguồn khác Những index gắn vào adapter đƣợc gắn trƣớc phân mảng DNA Hỗn hợp phản ứng đƣợc cho vào chu trình nhiệt: Bảng Chu trình nhiệt Gắn index khuếch đại thƣ viện Bƣớc (x12 chu kỳ) Nhiệt độ 98°C 98°C 57°C 72°C 72°C 4°C Thời gian phút 30 giây 30 giây phút 10 phút giữ Bƣớc đƣợc theo sau b ng cách làm hạt AMPuper XP b ng cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 x thể tích phản ứng, tẩy rửa b ng nƣớc có nuclease miễn phí 32 μL Việc làm đƣợc thực khu vực sau PCR Phục hồi, làm tập trung lấy đƣợc tất đoạn DNA mà khơng cần lựa chọn kích cỡ e Kiểm tra thƣ viện Bioanalyzer 2100 Sử dụng chip DNA 1000, kết thu đƣợc đồ thị có trục hoành thể độ dài đoạn DNA trục tung thể nồng độ DNA đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng 21 Hình 11 Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA Máy Bioanalyzer đƣợc dùng để đo kết phân cắt gDNA thành đoạn DNA nhỏ kiểm tra thƣ viện trƣớc chạy phản ứng giải trình tự Một thƣ viện điển hình bao gồm đoạn DNA khoảng 250-1000 bp, thƣ viện n m khoảng làm giảm chất lƣợng trình giải trình tự Hình 12 Quy trình kiểm tra thƣ viện Thao tác: _ Chuẩn bị chip DNA 1000, hệ thống chip priming _ Cho hỗn hợp gel vào giếng “G” sau sử dụng hệ thống chip priming để phân bố gel khắp chip, giữ 30 giây _ Cho hỗn hợp chất nhuộm thang đo vào giếng định sẵn _ Cho hỗn hợp gel chất nhuộm vào 12 giếng tƣơng ứng sau cho mẫu DNA vào thực bƣớc chuẩn bị mẫu theo hƣớng dẫn nhà sản xuất cho vào máy Bioanalyzer 2100 Việc kiểm tra thƣ viện b ng máy Bioanalyzer nên đƣợc sử dụng vào lần chuẩn bị thƣ viện đầu để chuẩn hóa quy trình, đảm bảo thƣ viện có độ dài thích hợp Sau quy trình đƣợc chuẩn hóa, phƣơng pháp Real-time PCR (qPCR) đƣợc sử dụng để đo nồng độ thƣ 22 viện, kết nồng độ xác sử dụng Bioanalyzer 2100 quy trình đƣợc chuẩn hóa nên chuẩn bị thƣ viện khơng cần phải kiểm tra lại độ dài KAPA Library Quantification Bộ kit qPCR bao gồm mẫu chuẩn theo nồng độ pha loãng biết đƣợc chạy hệ thống LightCycler 480 II để xây dựng đƣờng chuẩn Các phản ứng định lƣợng thƣ viện đƣợc chạy sau với cặp mồi có trình tự giống nhƣ oligo gắn flowcell hệ thống MiniSeq, trình tự tƣơng tƣ oligo nên cặp mồi bắt cặp bổ sung với trình tự adapter gắn vào phân mảng DNA Kết Ct đƣợc kết hợp với đƣờng chuẩn tính nồng độ thƣ viện cách xác 2.5 Chuẩn bị thư viện Amplicon (TruSeq Custom Amplicon Index Kit, Illumina) Hình 13 Chuẩn bị thƣ viện DNA Các gDNA đƣợc cắt ngẫu nhiên để tạo phân mảnh nhỏ (~500 đến 1.000 bp) Đây trình chuẩn bị lai hỗn hợp mảnh nhỏ mẫu với adapter barcode Sau trình lai diễn ra, mẫu tiến hành PCR với mastermix thƣơng mại TDP1 PMM2 index amplication plate (96 giếng) Sau phản ứng, thêm 25 µl 50 mM NaOH trƣớc cho vào chu trình PCR Chạy chƣơng trình PCR bao gồm bƣớc biến tính nhiệt 95 ° C phút; 25 chu kỳ 95 ° C 30 giây, 62 ° C 30 giây, 72 ° C 60 giây; 23 theo sau phần mở rộng cuối 72 ° C phút; kết thúc ổn định mẫu 10 ° C Nếu không tiến tới giai đoạn sau hoàn thành PCR, mẫu đƣợc bảo quản 2-8 ° C đến hai ngày 2.6 Tinh sản phẩm PCR nội cân hạt từ Bead-based Hình 14 Dùng mồi đặc hiệu với adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone Khi PCR hoàn tất, ly tâm mẫu 1000 x g trong1 phút 20 ° C Chuyển µl phản ứng PCR qua giếng có chứa µl nƣớc để pha lỗng mẫu tỷ lệ 1/5 Pipette lên xuống để trộn thêm ml mẫu PCRed pha loãng ml đệm vi lỏng-gel Con dấu dải / Lắc 1.800 rpm 30 giây máy ly tâm 1000 x g 30 giây Theo giao thức nhà sản xuất quy trình lần lƣợt là: Library Normalization Plate (LNP),Library Normalization Additives (LNA1), Library Normalization Wash 1,2.3, Library Normalization Storage Buffer chạy hỗn hợp gel thể lỏng để đánh giá xem việc chuẩn bị thƣ viện tốt không Sau kiểm tra sản phẩm PCR Hỗn hợp mẫu library ban đầu đƣợc trộn với nhau, đánh dấu Pooled Amplicon Library để chuẩn bị cho load chip tải 3-8Gb mẫu chạy giải trình tự b ng cách theo 24 hƣớng dẫn màng hình máy theo chƣơng trình MiSeq v2, Illumina HiSeq 4000 au tách gDNA nạp µl chạy gel 1% agarose để đánh giá đứt gãy suy thoái DNA Khi PCR hoàn tất, ly tâm mẫu 1000 x g trong1 phút 20°C Chuyển µl phản ứng PCR qua giếng có chứa µl nƣớc để pha loãng mẫu tỷ lệ 1/5 Pipette lên xuống để trộn thêm ml mẫu PCRed pha loãng ml đệm vi lỏng-gel Con dấu dải / Lắc 1.800 rpm 30 giây máy ly tâm 1000 x g 30 giây Theo giao thức nhà sản xuất quy trình lần lƣợt là: Library Normalization Plate (LNP),Library Normalization Additives (LNA1), Library Normalization Wash 1,2.3, Library Normalization Storage Buffer chạy hỗn hợp gel thể lỏng để đánh giá xem việc chuẩn bị thƣ viện tốt không Sau kiểm tra sản phẩm PCR Hỗn hợp mẫu library ban đầu đƣợc trộn với nhau, đánh dấu Pooled Amplicon Library để chuẩn bị cho load chip tải 3-8Gb mẫu chạy giải trình tự b ng cách theo hƣớng dẫn màng hình máy theo chƣơng trình MiSeq v2, Illumina HiSeq 4000 2.7 Giải trình tự NGS Hình 15 Giải trình tự hệ 2.8 Quy trình phân tích liệu NGS 1) Sử dụng cơng cụ BWA(6) để bắt cặp trình tự đọc với thuật toán BWA-MEM khung mẫu UCSC hg19 2) Sử dụng Picard(7) để lọc đoạn đọc exome theo cặp 25 3) Sử dụng Picard để đánh dấu đoạn trùng lặp trình PCR 4) Sử dụng GATK(8) để đánh dấu xếp lại vùng xung quanh đoạn có đột biến thêm bớt Hai nguồn liệu vị trí đột biến thêm bớt đoạn đƣợc sử dụng Mills Indels 1000 Genomes 5) Sử dụng Picard để kiểm tra sửa lại thơng tin cặp đọc có sai sót 6) Sử dụng GATK để chuẩn hóa điểm cho base sử dụng nguồn liệu từ dbSNP, Mills 1000 Genomes 7) Gọi đột biến b ng HaplotypeCaller GATK 8) Tách đột biến theo SNP đột biến thêm bớt đoạn b ng GATK: SelectVariants 9) Dùng GATK: VariantFiltration để đánh dấu số tiêu chuẩn cho đột biến nhƣ: chất lƣợng đột biến – QUAL (lớn 50 mức chấp nhận điểm QUAL), cửa sổ mật độ đột biến cho phép – clusterWindowSize 10 (đánh dấu vị trí của đoạn 10 base vƣợt đột biến điểm) số tiêu chuẩn khác 10) Gán nhãn cho đột biến b ng ANNOVAR(9) từ database nhƣ Mills, dsSNP, 1000 Genomes, HapMap, v.v B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết QC gDNA Hình 16 Kiểm tra QC DNA đầu vào Kết chạy NGS Các tiêu đánh giá liệu giải trỉnh tự: Chất lƣợng giải trình tự thƣờng đƣợc đánh giá dựa tiêu chí nhƣ tổng số đoạn trình tự, chất lƣợng theo vị trí base, chất lƣợng 26 trung bình độ dài đoạn trình tƣ, tỷ lệ GC, số lƣợng đoạn liệu Kết đánh giá chất lƣợng giải trình tự đƣợc trình bày cụ thể nhƣ dƣới Thống kê sơ (Basic Statistics): Xuất thông tin tổng quan liệu, bao gồm: tên tập tin liệu; định dạng liệu, máy giải trình tự, tổng số trình tự, số đoạn trình từ có chất lƣợng thấp, chiều dài đoạn trình tự %GC (Bảng 4) Bảng Thống kê sơ xuất thông tin tổng quan liệu Điểm chất lƣợng base (Per base sequence quality): Điểm chất lƣợng QC trình tự thể mức độ tin cậy trình tự Nếu QC=10: mức độ tin cậy 90%; QC=20: mức độ tin cậy 99%; QC=30; mức độ tin cậy 99,9%; QC=40: mức độ tin cậy 99,99% Trong hình, ta nhận thấy điểm QC đoạn mẫu hầu hết gần b ng 40, có số đoạn điểm thấp 40 Điều cho thấy, liệu kết đủ điều kiện để tiến hành thao tác phân tích tiếp theo, khơng cần phải tinh (Hình 17A) Điểm chất lƣợng chuỗi trình tự (Per sequence quality scores): Đánh giá điểm chất lƣợng trung bình đoạn trình tự Kết cho thấy đoạn trình tự có điểm trung bình 39 Khơng có đoạn trình tự có điểm trung bình dƣới 32 đoạn có điểm trung bình từ 32-39 (Hình 17B) Tỷ lệ base (Per base sequence content): Cho biết tỷ lệ % loại trình tự A, T, G, C liệu (Hình 17C) Tỷ lệ GC liệu (Per sequence GC content): Kết thống kê %GC đoạn trình tự Đƣờng màu xanh tỷ lệ %GC theo định luật phân phối chuẩn (lý thuyết) Đƣờng 27 màu đỏ tỷ % GC có liệu (thực tế) Dữ liệu có %GC thực tế gần với lý thuyết tốt (Hình 17D) Số lƣợng base N liệu (Per base N content): Kết thống kê số lƣợng trình tự N liệu mẫu, số lƣợng N nhiều phản ánh chất lƣợng giải trình tự khơng tốt (Hình 17E) Chiều dài chuỗi trình tự (Sequence Length Distribution): Kết thống kê phân bố độ dài đoạn trình tự liệu kết cho thấy hầu hết trình tự có độ dài 101 bp (Hình 17F) Mức độ lặp lại chuỗi trình tự (Sequence Duplication Levels): Đánh giá mức độ lặp lại các đoạn trình tự Đƣờng đỏ: mức độ lặp lại 200.000 trình tự đầu tiên, đƣờng màu xanh mức độ lặp lại tồn trình tự liệu (Hình 17G) Hình 17 Đánh giá chất lƣợng liệu giải trình tự A: Điểm chất lƣợng base, B: Điểm chất lƣợng chuỗi trình tự, C: Tỷ lệ base, D: Tỷ lệ GC liệu, E: Số lƣợng base N liệu, F: Chiều dài chuỗi trình tự, G: Mức độ lặp lại chuỗi trình tự Kết phân tích đột biến Với gen ABCA12 đƣợc cho r ng nguyên dân gây bệnh Harlequin, lọc đƣợc hai đột biến gen này; bao gồm: đột biến thêm đoạn (insertion) exon đột biến điểm tạo ba mã dừng (stopgain) Thông tin đột biến nhƣ sau: 28 Đột biến thêm đoạn exon34 (dựa theo đoạn khuôn mẫu NM_015657) exon42 (dựa theo đoạn khuôn mẫu NM_173076 Bảng Chi tiết đột biến thêm đoạn ABCA12 Đột biến thêm đoạn ABCA12:NM_015657:exon34:c.5213dupT:p.F1738fs,ABCA12:NM_173076:exon42:c.6167dup T:p.F2056fs GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:49,66:115:99:1653,0,1084 Đột biến điểm exon 19 (dựa theo đoạn khuôn mẫu NM_015657) exon 27 (dựa theo đoạn khuôn mẫu NM_173076) Bảng Chi tiết đột biến điểm ABCA12 Đột biến điểm ABCA12:NM_015657:exon19:c.C2935T:p.R979X,ABCA12:NM_173076:exon27:c.C3889T:p.R1 297X GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:26,37:63:99:776,0,445 Bàn luận Bệnh Harlequin ichthyosis bệnh bẩm sinh gặp thƣờng gây tử vong sau sinh, ca bệnh thu đƣợc hội tốt để nghiên cứu hệ gen ngƣời bệnh; thêm vào đó, chúng tơi áp dụng giải trình tự hệ mới, hay cụ thể giải trình từ tồn exon mẫu bệnh Giải trình tự hệ tìm đƣợc hai đột biến có độ tin cậy cao, có đột biến làm thay đổi axit amin protein (missense mutation) đột biến làm đứt ngang (truncate) cấu trúc protein (stop-gain mutation) Theo thống kê, % bệnh AR-CIs có đột biến gen ABCA12 đa phần đột biến đột biến làm thay đổi axit amin(2); nhiên, ca bệnh này, chúng tơi tìm đƣợc đột biến làm đứt ngang protein gây làm chức protein, điều nguyên nhân dẫn đến trầm trọng HI so với bệnh nhóm Đối với kiểu gen đột biến(11), với: 29  Đột biến điểm (Bảng 5), với kiểu gen GT: 0/1 độ sâu DP:115X vị trí đột biến với điểm chất lƣợng kiểu gen GQ:99 giúp ta kết luận chắn r ng đột biến có kiểu gen dị hợp  Đột biến điểm (Bảng 6) với kiểu gen GT: 0/1 độ sâu DP:63X vị trí đột biến với điểm chất lƣợng kiểu gen GQ:99 giúp ta kết luận chắn r ng đột biến có kiểu gen dị hợp Nhƣ vậy, hai đột biến chúng tơi tìm đƣợc di truyền theo kiểu gen dị hợp, điểm khác với nghiên cứu David P Kelsell cs (2005)2 cần đƣợc kiểm chứng KẾT LUẬN Với phƣơng pháp giải trình tự cũ đƣợc sử dụng nhƣ phƣơng pháp chuẩn để tìm đột biến thập kỉ trở lại đây, việc tìm đột biến gene exon ngừng việc giải trình tự Sự xuất NGS với tính hiệu cao việc giải trình tự nhiều gene có liên hệ với nhiều loại ung thƣ lúc máy cho kết khách quan so với giải trình tự cũ Sanger hứa hẹn mang lại nhiều kết lâm sàng hữu ích Những phịng thí nghiệm có hội đƣợc tạo phƣơng pháp giải trình tự đội ngũ sinh tin cho riêng gặp nhiều khó khăn việc đánh giá nhƣ diễn giải kết Tóm lại, với việc áp dụng giải trình tự hệ mới, chúng tơi tìm đƣợc đột biến phần lý giải đƣợc nguyên nhân đ ng sau trầm trọng bệnh HI Thêm vào đó, phƣơng pháp mới, liệu mà chúng tơi có đƣợc cịn áp dụng để xem xét gen liên quan có thể, nghiên cứu di truyền bệnh thơng qua việc giải trình tự exon cho bố mẹ bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmed H, O’Toole EA (2014) Recent advances in the genetics and management of harlequin ichthyosis Pediatr Dermatol, 31(5): 539-546 Annilo T, Shulenin S, Chen ZQ, Arnould I, Prades C, Lemoine C, Maintoux-Larois C, Devaud C, Dean M, Denefle P, Rosier M (2002) Identification and characterization of a novel ABCA subfamily member, ABCA12, located in the lamellar ichthyosis region on 2q34 Cytogenet Genome Res, 98 (2–3): 169–76 30 Boycott KM, Vanstone MR, Bulman DE, MacKenzie AE (2013) Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation Nat Rev Genet, 14(10):681691 Broad Institute Picard tools https://broadinstitute.github.io/picard/ https://broadinstitute.github.io/picard/%0Ahttp://broadinstitute.github.io/picard/ Published 2016 Daber R, Sukhadia S, Morrissette JJ, (2013) Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets Cancer Genetics, 206(12): 441-448 Harvey HB, Shaw MG, Morrell DS (2010) Perinatal management of harlequin ichthyosis: a case report and literature review J Perinatol, 30(1):66-72 Ishibashi Y, Kohyama-Koganeya A, Hirabayashi Y, (2013) New insights on glucosylated lipids: Metabolism and functions Biochim Biophys Acta, 1831 (9): 1475–1485 Kelsell DP, Norgett EE, Unsworth H, et al (2005) Mutations in ABCA12 underlie the severe congenital skin disease harlequin ichthyosis Am J Hum Genet, 76(5):794-803 Layton J (2004) A review of harlequin ichthyosis Neonatal Netw, 24(3):17-23 10 Lefevre C, Audebert S, Jobard F, Bouadjar B, Lakhdar H, Boughdene-Stambouli O, Blanchet Bardon C, Heilig R, Foglio M, Weissenbach J, Lathrop M, Prud'homme JF, Fischer J (2003) Mutations in the transporter ABCA12 are associated with lamellar ichthyosis type Hum Mol Genet, 12 (18): 2369–78 11 Li H, Durbin R (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform Bioinformatics, 26(5):589-595 12 Taylor J, et al (2007) Using galaxy to perform large-scale interactive data analyses Curr Protoc Bioinformatics, Chapter 10, Unit 10.5 13 Van der GA, Carneiro MO, Hartl C, et al (2002) GATK Best Practices Curr Protoc Bioinformatics, 11(1110):11.10.1-11.10.33 14 Wang K, Li M, Hakonarson H (2010) ANNOVAR: Functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data Nucleic Acids Res, 38(16) 31 ... ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN- SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GENE ABCA12 CỦA... (13,14) Giải trình tự hệ hay next generation sequencing (NGS) công cụ tiên tiến sinh học phân tử đại có tiềm việc tìm hiểu bệnh Việc sử dụng giải trình tự hệ để tìm hiểu thay đổi nhiều gen so với giải. .. với giải trình tự Sanger hiệu tiết kiệm (5) Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi áp dụng giải trình tự hệ ca bệnh HI Việt Nam để tìm hiểu nhƣ đánh giá đột biến gen bệnh nhân mà cụ thể gen ABCA12 ĐỐI