sử dụng công cụ tin sinh học giải trình tự thế hệ mới trong tìm các đột biến của ca bệnh seckel

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA BỆNH SECKEL Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS HUỲNH KIM HIỆU Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CƠNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA BỆNH SECKEL Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Chuyên ngành Cơ quan công tác STT Họ tên Huỳnh Kim Hiệu ĐH Y Dƣợc TPHCM Bùi Chí Bảo ĐH Y Dƣợc TPHCM Nguyễn Thị Huỳnh Nga ĐH Đà Lạt Nguyễn Minh Hiệp ĐH Đà Lạt Đào Trọng Thức ĐH Quốc Tế Võ Văn Thành Niệm ĐH Y Dƣợc TPHCM Đơn vị phối hợp chính: -Nơi thực đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM -Nơi cung cấp bệnh phẩm: MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ĐỐI TƢƠNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 Bảng thống kê sơ đoạn đọc thô 26 Kết đột biến 26 Bàn luận 29 KẾT LUẬN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tổng quan gen liên quan đến nhóm bệnh thuộc hội chứng lùn tương đối.1,2 (Theo Geister KA cs (2015) Khetarpal P cs (2016)) 10 Bảng Các thông số để định lƣợng đánh giá chất lƣợng DNA 15 Bảng Thông số kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng DNA phân mảnh 17 Bảng Chu trình nhiệt Gắn index khuếch đại thƣ viện 18 Bảng Thống kê cho hai đoạn đọc thô, forward (trái) reverse (phải) 26 Bảng Tổng hợp đột biến hai gen liên quan tới SCKS 27 Bảng Tổng hợp đột biến gen liên quan tới MOPD I-III 28 Bảng Tổng hợp đột biến gen liên quan tới MGS 29 DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình Sơ đồ thể di truyền bệnh Hình Sơ đồ quy trình tiến hành bƣớc đề tài 11 Hình Quy trình xử lý tách chiết gDNA 12 Hình Kết kiểm tra chất lƣợng DNA 14 Hình Kiểm tra độ phân mảnh gDNA gel agarose 1%, 100V 30 phút Mẫu gDNA bị đứt gãy giếng 2, 3, 4,5 gDNA giếng 6, 8, 9, 10, 11 đạt chất lƣợng để tiến hành chạy NGS 15 Hình Sơ đ tổng quát c gi i t n t ng NGS 16 Hình Điện di kiểm tra DNA phân mảnh 17 Hình Minh họa trình gắn adapter, index khuếch đại thƣ viện 19 Hình Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA 19 Hình 10 Quy trình kiểm tra thƣ viện 20 Hình 11 Chuẩn bị thƣ viện DNA 21 Hình 12 Dùng mồi đặc hiệu với adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone 22 Figure 13 Bắt cặp trình tự đọc thô (Alignment) 24 Hình 14 Tổng quan đột biến non-synonymous không tác động tới intron gen liên quan 27 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa SCKS Seckel Syndrome Hội chứng Seckel MOPD Microcephalic Osteodysplactic Hội chứng lùn tƣơng đối Primordial Dwarfsims Microcephalic Osteodysplactic MGS Meier-Gorlin Syndrome Hội chứng Meier-Gorlin NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU A MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Hội chứng Seckel – Seckel Syndrome (SCKS) bệnh rối loạn di truyền thuộc nhóm bệnh lùn tƣơng đối – Primordial Dwarfism Hội chứng seckel đƣợc gọi "bệnh lùn đầu chim" (một thuật ngữ mô tả đƣợc coi bắt chƣớc) Trong đầu nhỏ, thật khơng may, có não nhỏ Điều thƣờng có nghĩa chậm phát triển và, sau đó, chậm phát triển tâm thần Khoảng nửa số trẻ em Seckel có số IQ dƣới 50 Hầu hết trẻ em mắc hội chứng Seckel “thân thiện dễ chịu” nhƣng “thƣờng siêu cƣờng (hiếu động) dễ bị phân tâm”(1) Đây hội chứng khuyết tật bẩm sinh có tầm vóc ngắn nghiêm trọng, trọng lƣợng sơ sinh thấp, đầu nhỏ (microcephaly), trán trán, mắt to, tai thấp, nhô bật mũi cằm nhỏ Khuyết tật xƣơng cánh tay chân, trật khớp khuỷu tay hơng, khơng có khả làm thẳng đầu gối tất phổ biến nhƣ (ở trẻ em trai) thất bại tinh hồn để vào bìu (cryptorchidism) Tình trạng thiếu sản xuất tất loại tế bào máu (pancytopenia) xảy số bệnh nhân, nhƣ bất ổn định nhiễm sắc thể Bệnh di truyền Nó đƣợc thừa hƣởng cách lặn tự động(2,3) Hội chứng seckel đƣợc đặc trƣng tăng trƣởng chậm bất thƣờng trình phát triển thai nhi (chậm phát triển tử cung), dẫn đến trọng lƣợng sơ sinh thấp Tăng trƣởng chậm bất thƣờng (chậm phát triển chậm trễ xƣơng) tiếp tục sau sinh (sau sinh) thƣờng dẫn đến tầm vóc ngắn (lùn) với phát triển tỷ lệ thuận tay chân (trái ngƣợc với tầm vóc ngắn với cánh tay chân nhỏ bất thƣờng, tức ngắn -ngƣời lùn đƣợc trả tiền) Trung bình đến chậm phát triển tâm thần nghiêm trọng có mặt lúc sinh (bẩm sinh) nhƣng không trở nên rõ ràng đứa trẻ bị ảnh hƣởng lớn hơn(8,9) Ngoài ra, trẻ sơ sinh có hội chứng Seckel có bất thƣờng đặc biệt vùng đầu mặt (craniofacial) Trong hầu hết trƣờng hợp, trẻ sơ sinh bị ảnh hƣởng có triệu chứng nhỏ, điều kiện chu vi vòng đầu nhỏ so với dự kiến cho tuổi giới tính trẻ sơ sinh; trán sâu; hàm nhỏ bất thƣờng (micrognathia) đƣợc lõm xa bình thƣờng (retrognathia); / mũi cong "hình tam giác" Do bất thƣờng nhƣ phần khn mặt xuất bất thƣờng bật Ngoài ra, số trƣờng hợp, số khớp xơ định xƣơng sọ (sọ sọ) đóng sớm (craniosynostosis) Kết là, đầu xuất kéo dài rút ngắn bất thƣờng, tùy thuộc vào phần hộp sọ bị ảnh hƣởng(4,5) Ở số trẻ sơ sinh có hội chứng Seckel, bất thƣờng khác sọ xuất bao gồm mắt lớn bất thƣờng với nếp gấp mí mắt xiên xuống (các vết nứt da); đôi mắt chéo (lác); tai thấp, dị dạng (loạn sản) với thùy tai vắng mặt; / mái vịm cong miệng (vịm miệng) khơng đƣợc hình thành hồn tồn (hở hàm ếch) Ngồi ra, số trƣờng hợp, bên khuôn mặt xuất lớn mặt (mặt không đối xứng) Một số trẻ sơ sinh trẻ em bị ảnh hƣởng có bất thƣờng miệng bao gồm phát triển (hypoplasia) men / đông đúc / định vị khơng răng(11,12) Ngồi ra, số trẻ bị hội chứng Seckel có bất thƣờng xƣơng khác bao gồm trật khớp đầu xƣơng cẳng tay bên ngón tay (chuyển vị trí xun tâm), trật khớp khuỷu tay, trật khớp / dị tật (loạn sản) hông / khả mở rộng đầu gối hồn tồn Trong số trƣờng hợp, trẻ bị ảnh hƣởng phát triển bất thƣờng mặt trƣớc / bên cạnh cột sống (kyphoscoliosis) Bất thƣờng xƣơng bổ sung bao gồm cố định vĩnh viễn ngón tay thứ năm vị trí cong (lâm sàng), dị dạng bàn chân tƣ xoắn (chân), / vắng mặt cặp sƣờn (ví dụ, triển lãm 11 12 cặp xƣơng sƣờn) Trong số trƣờng hợp, nam giới với hội chứng Seckel biểu thất bại tinh hồn để xuống bình thƣờng vào bìu (cryptorchidism) / phụ nữ bị ảnh hƣởng có âm vật mở rộng bất thƣờng (clitoromegaly) Ngoài ra, trẻ em bị ảnh hƣởng có tóc nhiều thể (rậm lông), / nếp nhăn sâu lòng bàn tay (nhăn nhăn)(6) Trong số trƣờng hợp, ngƣời mắc hội chứng Seckel có rối loạn máu (huyết học) liên quan bao gồm thiếu tất yếu tố tủy xƣơng bao gồm hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu (pancytopenia) Một mức thấp tế bào máu đỏ lƣu hành đƣợc gọi thiếu máu Hội chứng Seckel chứng rối loạn có đƣợc thừa hƣởng nhƣ đặc điểm lặn tự phát Ba biến thể hội chứng Seckel liên quan đến gián đoạn thay đổi (đột biến) gen ba nhiễm sắc thể khác nhau(9,17) Các vị trí đồ gen là: Hội chứng Seckel 1, nhiễm sắc thể số (3q22-q24); Hội chứng Seckel 2, nhiễm sắc thể 18 (18p11.31-q11) hội chứng Seckel 3, nhiễm sắc thể 14 (14q21-q22) Nhiễm sắc thể, có mặt nhân tế bào ngƣời, mang thông tin di truyền cho cá thể Các tế bào thể ngƣời thƣờng có 46 nhiễm sắc thể Cặp nhiễm sắc thể ngƣời đƣợc đánh số từ đến 22 nhiễm sắc thể giới tính đƣợc định X Y Nam giới có nhiễm sắc thể X Y nữ giới có hai nhiễm sắc thể X Mỗi nhiễm sắc thể có cánh tay ngắn đƣợc định “p” cánh tay dài đƣợc định “q” Nhiễm sắc thể đƣợc chia nhỏ thành nhiều dải đƣợc đánh số Ví dụ, “nhiễm sắc thể 3q22-q24” đề cập đến vùng dải 22 dải 24 cánh tay dài nhiễm sắc thể Theo cách tƣơng tự, “nhiễm sắc thể 18p11.31-q11.2” đề cập đến vùng rộng dải 11p31 cánh tay ngắn nhiễm sắc thể 18 dải 11.2 cánh tay nhiễm sắc thể 18 Một lần nữa, nhiễm sắc thể 14q21-q22 đề cập đến vùng hẹp cánh tay dài nhiễm sắc thể 14 dải 21 22 Các dải số xác định vị trí hàng ngàn gen diện nhiễm sắc thể Gen cụ thể liên quan đến hội chứng Seckel đƣợc gọi gen ataxia-telangiectasia protein liên quan đến Rad3 (ATR) Các gen liên quan đến hội chứng Seckel loại chƣa đƣợc biết rõ(17) Các bệnh di truyền đƣợc xác định kết hợp gen cho đặc điểm riêng biệt nhiễm sắc thể nhận đƣợc từ ngƣời cha ngƣời mẹ Rối loạn di truyền lặn xảy cá nhân thừa hƣởng gen bất thƣờng cho đặc điểm từ bố mẹ Nếu cá nhân nhận đƣợc gen bình thƣờng gen cho bệnh này, ngƣời ngƣời mang mầm bệnh, nhƣng thƣờng khơng có triệu chứng Nguy cho hai ngƣời mẹ mang mầm bệnh qua gen khiếm khuyết đó, có đứa trẻ bị ảnh hƣởng 25% với lần mang thai Nguy có ngƣời mang mầm bệnh nhƣ cha mẹ 50% với lần mang thai Cơ hội cho trẻ nhận gen bình thƣờng từ cha lẫn mẹ có tính di truyền bình thƣờng đặc điểm 25% Nguy nhƣ nam nữ (16) Tất cá nhân mang vài gen bất thƣờng Cha mẹ họ hàng thân thiết (đồng tính) có hội cao cha mẹ không liên quan để mang hai gen bất thƣờng, làm tăng nguy mắc chứng rối loạn di truyền lặn Hội chứng Seckel chứng rối loạn di truyền gặp có ảnh hƣởng đến nam nữ với số lƣợng Tỷ lệ xác rối loạn khơng đƣợc biết đến Hơn 100 trƣờng hợp đƣợc báo cáo tài liệu y khoa kể từ mô tả ban đầu vào năm 1960 Các triệu chứng rối loạn sau tƣơng tự nhƣ triệu chứng hội chứng Seckel So sánh hữu ích cho chẩn đốn phân biệt: Hội chứng seckel sáu chứng rối loạn lớp học ngƣời lùn đƣợc gọi “chủ nghĩa lùn nguyên thủy” Những rối loạn có đặc điểm tƣơng tự bao gồm dị tật xƣơng (loạn sản), thiếu hụt tăng trƣởng trƣớc sinh (chậm phát triển tử cung) giai đoạn trứng nƣớc thời thơ ấu, cuối dẫn đến mức độ khác tầm vóc ngắn Nhóm rối loạn bao gồm năm rối loạn: Hội chứng Seckel, hội chứng tai-patella-ngắn (Meier-Gorlin); Hội chứng Russell-Silver; Majewski osteodysplastic chim đầu lùn loại I / III; loại cá lùn dạng nhũ tƣơng đầu dòng Majewski loại II Loại bệnh lùn đen loại II, hay gọi MOPD II hay rối loạn di truyền nguyên thủy loại II, rối loạn di truyền gặp, có trọng lƣợng ngắn, trọng lƣợng sơ sinh thấp, đầu nhỏ bất thƣờng (cực nhỏ) / bất thƣờng xƣơng Các phát vật lý khác bao gồm mắt to, mũi nhô mũi, hàm sau, / mặt hẹp Thiếu hụt tăng trƣởng nặng trƣớc sinh (thiếu hụt tử cung) thƣờng xảy Sự chậm phát triển tâm thần xuất số trƣờng hợp Một loạt triệu chứng khác xảy Các triệu chứng cụ thể mức độ nghiêm trọng khác tùy trƣờng hợp Majewski osteodysplastic dwarfism chim đầu đen loại II đƣợc cho đƣợc thừa kế nhƣ đặc điểm lặn tự phát(15,18) Với đời siêu âm siêu âm kỹ thuật, hội chứng Seckel đƣợc chẩn đốn trƣớc sinh (trƣớc sinh) Trong siêu âm bào thai, sóng âm phản xạ đƣợc sử dụng để tạo hình ảnh thai nhi phát triển Sau sinh, hội chứng Seckel bị nghi ngờ dựa đánh giá lâm sàng toàn diện, lịch sử bệnh nhân chi tiết loạt xét nghiệm chuyên biệt Mặc dù có triệu chứng bất thƣờng xƣơng sọ, xƣơng, / bất thƣờng khác liên quan đến hội chứng Seckel sinh (bẩm sinh), chẩn đốn hội chứng Seckel khơng đƣợc xác nhận ví dụ, tầm vóc ngắn / chậm phát triển tâm thần trở nên rõ ràng) Tầm vóc ngắn liên quan đến hội chứng Seckel liên quan đến tăng trƣởng tỷ lệ cánh tay chân, cho phép chẩn đoán phân biệt từ hội chứng có tầm vóc ngắn cánh tay chân nhỏ bất thƣờng (lùn ngắn hạn) Bệnh lùn tƣơng đối, ngồi SCKS, cịn bao gồm Microcephalic Osteodysplactic Primordial Dwarfsims loại I-III (MOPD I-III) hội chứng Meier-Gorlin (MGS)(1,2) Những đặc điểm lâm sàng điển hình SCKS dị tật đầu nhỏ (thƣờng thể tích não giảm cịn 1/3 thể tích thơng thƣờng) dị tật nội tạng (biến đổi cấu trúc răng, hàm thụt mũi nhô), mức độ nghiêm trọng bệnh bệnh nhân thay đổi nhiều với bệnh nhân(2) Một số gen đƣợc phân loại Bảng Thông số kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng DNA phân mảnh Khung kĩ thuật phân mảnh DNA theo kích cỡ: 200 400 500 Thuật ngữ Định nghĩa bp bp bp Peak Incident Đây thƣớc đo công suất siêu âm tức thời áp dụng 175 140 105 Power (PiP) cho mẫu Dải từ 2,5 đến 500 Watts Period frequency Phần trăm thời gian mà đầu dị đƣợc "bật" tạo sóng âm 10% 5% 5% Cycles Per Burst Số lƣợng dao động âm có burst 200 200 200 Thời gian ảnh Đo thời gian giây 180 55 80 Nhiệt độ Nhiệt độ mẫu nƣớc 7°C 7°C 7°C Mức nƣớc Mức nƣớc đƣợc làm đầy 6 (PF) hƣởng Hình Điện di kiểm tra DNA phân mảnh Sản phẩm DNA sau phân cắt đƣợc lựa chọn lại SPRI Beads theo nồng độ thích hợp Nồng độ cao thu đƣợc nhiều phân mảng DNA kích thƣớc nhỏ ngƣợc lại 17 b Adenyl hóa (tạo poly A) Mục đích nhằm tạo nơi bắt cặp cho adapter vào phân mảng DNA Hỗn hợp phản ứng adenyl hóa đƣợc tạo thành đá lạnh cho mẫu DNA Đối với nhiều mẫu, master mix đƣợc thực với 0,5 phản ứng dƣ thừa 20 μl hỗn hợp phản ứng đƣợc thêm vào 30 μL mẫu DNA trộn pipet Hỗn hợp đƣợc ủ nhiệt độ 30 phút nhiệt độ 37oC khơng có nắp đun nóng Bƣớc đƣợc theo sau cách làm hạt AMPure XP cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 lần thể tích phản ứng, tẩy rửa nƣớc không chứa nuclease 15 μL Điều đảm bảo phục hồi, làm tập trung tất đoạn DNA từ phản ứng mà khơng chọn kích cỡ c Gắn Adapter Phản ứng nối đƣợc tạo thành đá lạnh cho mẫu DNA Đối với nhiều mẫu, master mix đƣợc thực với 0,5 phản ứng dƣ thừa 37 μl hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn với 13 μL mẫu DNA trộn pipet Hỗn hợp đƣợc ủ 15 phút 20 ° C máy gia nhiệt mà khơng cần nung nóng Bƣớc đƣợc theo sau cách làm hạt AMPuper XP cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 lần thể tích phản ứng, tẩy rửa nƣớc không chứa nuclease 32 μL Điều đảm bảo phục hồi, làm tập trung tất đoạn DNA từ phản ứng mà khơng chọn kích thƣớc d Gắn index khuếch đại thƣ viện Các cặp index đƣợc lựa chọn trƣớc để đánh dấu phân biệt mẫu DNA từ nguồn khác Những index gắn vào adapter đƣợc gắn trƣớc phân mảng DNA Hỗn hợp phản ứng đƣợc cho vào chu trình nhiệt: Bảng Chu trình nhiệt Gắn index khuếch đại thƣ viện Bƣớc (x12 chu kỳ) Nhiệt độ 98°C 98°C 57°C Thời gian phút 30 giây 30 giây 72°C 72°C 4°C phút 10 phút giữ 18 Bƣớc đƣợc theo sau cách làm hạt AMPuper XP cách sử dụng khối lƣợng hạt tƣơng đƣơng với 1,8 x thể tích phản ứng, tẩy rửa nƣớc có nuclease miễn phí 32 μL Việc làm đƣợc thực khu vực sau PCR Phục hồi, làm tập trung lấy đƣợc tất đoạn DNA mà không cần lựa chọn kích cỡ Hình Minh họa q trình gắn adapter, index khuếch đại thƣ viện e Kiểm tra thƣ viện Bioanalyzer 2100 Sử dụng chip DNA 1000, kết thu đƣợc đồ thị có trục hoành thể độ dài đoạn DNA trục tung thể nồng độ DNA đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng Hình Biểu đồ đo kết phân cắt gDNA Máy Bioanalyzer đƣợc dùng để đo kết phân cắt gDNA thành đoạn DNA nhỏ kiểm tra thƣ viện trƣớc chạy phản ứng giải trình tự Một thƣ viện điển hình bao gồm 19 đoạn DNA khoảng 250-1000 bp, thƣ viện nằm khoảng làm giảm chất lƣợng trình giải trình tự Hình 10 Quy trình kiểm tra thƣ viện Thao tác: _ Chuẩn bị chip DNA 1000, hệ thống chip priming _ Cho hỗn hợp gel vào giếng “G” sau sử dụng hệ thống chip priming để phân bố gel khắp chip, giữ 30 giây _ Cho hỗn hợp chất nhuộm thang đo vào giếng định sẵn _ Cho hỗn hợp gel chất nhuộm vào 12 giếng tƣơng ứng sau cho mẫu DNA vào thực bƣớc chuẩn bị mẫu theo hƣớng dẫn nhà sản xuất cho vào máy Bioanalyzer 2100 Việc kiểm tra thƣ viện máy Bioanalyzer nên đƣợc sử dụng vào lần chuẩn bị thƣ viện đầu để chuẩn hóa quy trình, đảm bảo thƣ viện có độ dài thích hợp Sau quy trình đƣợc chuẩn hóa, phƣơng pháp Real-time PCR (qPCR) đƣợc sử dụng để đo nồng độ thƣ viện, kết nồng độ xác sử dụng Bioanalyzer 2100 quy trình đƣợc chuẩn hóa nên chuẩn bị thƣ viện không cần phải kiểm tra lại độ dài KAPA Library Quantification Bộ kit qPCR bao gồm mẫu chuẩn theo nồng độ pha loãng biết đƣợc chạy hệ thống LightCycler 480 II để xây dựng đƣờng chuẩn 20 Các phản ứng định lƣợng thƣ viện đƣợc chạy sau với cặp mồi có trình tự giống nhƣ oligo gắn flowcell hệ thống MiniSeq, trình tự tƣơng tƣ oligo nên cặp mồi bắt cặp bổ sung với trình tự adapter gắn vào phân mảng DNA Kết Ct đƣợc kết hợp với đƣờng chuẩn tính nồng độ thƣ viện cách xác 2.5 Chuẩn bị thư viện Amplicon (TruSeq Custom Amplicon Index Kit, Illumina) Các gDNA đƣợc cắt ngẫu nhiên để tạo phân mảnh nhỏ (~500 đến 1.000 bp) Đây trình chuẩn bị lai hỗn hợp mảnh nhỏ mẫu với adapter barcode Sau trình lai diễn ra, mẫu tiến hành PCR với mastermix thƣơng mại TDP1 PMM2 index amplication plate (96 giếng) Sau phản ứng, thêm 25 µl 50 mM NaOH trƣớc cho vào chu trình PCR Chạy chƣơng trình PCR bao gồm bƣớc biến tính nhiệt 95 ° C phút; 25 chu kỳ 95 ° C 30 giây, 62 ° C 30 giây, 72 ° C 60 giây; theo sau phần mở rộng cuối 72 ° C phút; kết thúc ổn định mẫu 10 ° C Nếu không tiến tới giai đoạn sau hoàn thành PCR, mẫu đƣợc bảo quản 2-8 ° C đến hai ngày Hình 11 Chuẩn bị thƣ viện DNA 21 2.6 Tinh sản phẩm PCR nội cân hạt từ Bead-based Hình 12 Dùng mồi đặc hiệu với adapter để khuếch đại mảnh DNA giá bám thành clone Khi PCR hoàn tất, ly tâm mẫu 1000 x g trong1 phút 20 ° C Chuyển µl phản ứng PCR qua giếng có chứa µl nƣớc để pha lỗng mẫu tỷ lệ 1/5 Pipette lên xuống để trộn thêm ml mẫu PCRed pha loãng ml đệm vi lỏng-gel Con dấu dải / Lắc 1.800 rpm 30 giây máy ly tâm 1000 x g 30 giây Theo giao thức nhà sản xuất quy trình lần lƣợt là: Library Normalization Plate (LNP),Library Normalization Additives (LNA1), Library Normalization Wash 1,2.3, Library Normalization Storage Buffer chạy hỗn hợp gel thể lỏng để đánh giá xem việc chuẩn bị thƣ viện tốt không Sau kiểm tra sản phẩm PCR Hỗn hợp mẫu library ban đầu đƣợc trộn với nhau, đánh dấu Pooled Amplicon Library để chuẩn bị cho load chip tải 3-8Gb mẫu chạy giải trình tự cách theo hƣớng dẫn màng hình máy theo chƣơng trình MiSeq v2, Illumina HiSeq 4000 au tách gDNA nạp µl chạy gel 1% agarose để đánh giá đứt gãy suy thối DNA Khi PCR hồn tất, ly tâm mẫu 1000 x g trong1 phút 20°C Chuyển µl phản ứng PCR qua giếng có chứa µl nƣớc để pha lỗng mẫu tỷ lệ 1/5 Pipette lên xuống để trộn thêm ml mẫu PCRed pha loãng ml đệm vi lỏng-gel Con dấu dải / Lắc 1.800 rpm 30 giây máy ly tâm 1000 x g 30 giây Theo giao thức nhà sản 22 xuất quy trình lần lƣợt là: Library Normalization Plate (LNP),Library Normalization Additives (LNA1), Library Normalization Wash 1,2.3, Library Normalization Storage Buffer chạy hỗn hợp gel thể lỏng để đánh giá xem việc chuẩn bị thƣ viện tốt không Sau kiểm tra sản phẩm PCR Hỗn hợp mẫu library ban đầu đƣợc trộn với nhau, đánh dấu Pooled Amplicon Library để chuẩn bị cho load chip tải 3-8Gb mẫu chạy giải trình tự cách theo hƣớng dẫn màng hình máy theo chƣơng trình MiSeq v2, Illumina HiSeq 4000 2.6 Quy trình phân tích liệu NGS a Kiểm tra chất lƣợng (Quality Control) Kết đọc thơ hệ thống giải trình tự (định dạng file FASTQ) đƣợc kiểm tra bằng phần mềm FASTQC(5) FASTQC đánh giá tiêu chí chất lƣợng cung cấp bảng thống kê đánh giá dƣới định dạng file HTML Một số tiêu FASTQC đánh giá là: thống kê sơ (Basic Statistics), Điểm chất lƣợng base (Per base sequence quality), Tỷ lệ %GC chuỗi đọc (Per sequence GC content), v.v Những mức chuẩn nhƣ cách phân tích bảng thơng kê đƣợc trình bày trực quan dễ hiểu trang chủ FASTQC Bảng Thông tin chất lƣợng DNA 23 b Chuẩn bị trƣớc phân tích (Preprocessing) Sau thực kiểm tra chất lƣợng FASTQC, kết đƣợc khuyến nghị đƣa qua số phần mềm nhằm sàng lọc lại đoạn đọc thô Chúng sử dụng cơng cụ Trimmomatic6, quy trình sàng lọc cắt đoạn bắt (adapter) đầu 3’ có cắt base chất lƣợng thấp cuối chuỗi đọc thơ c Bắt cặp trình tự đọc thô (Alignment) Sau đƣợc xử lý, chuỗi trình tự đọc thơ đƣợc bắt cặp lại với đoạn DNA khung mẫu (reference genome) Chúng sử dụng BWA(7), phần mềm mã nguồn mở áp dụng thuật toán Burrows-Wheeler Transformation Thuật toán cho phép bắt cặp có đoạn khơng tƣơng tự mức độ định giúp tìm đột biến điểm nhƣ đột biến thêm bớt đoạn Figure 13 Bắt cặp trình tự đọc thơ (Alignment) d Xử lý liệu sau bắt cặp (Post-alignment processing) Việc xử lý liệu sau bắt cặp sử dụng bao gồm hai bƣớc: loại bỏ đoạn trùng lặp (Remove read duplicates) đƣợc cung cấp công cụ Picard(8) chuẩn hóa điểm chất lƣợng base (Base quality score recalibration) đƣợc cung cấp công cụ GATK(9) Về việc loại bỏ đoạn trùng lặp, bắt cặp với đoạn DNA khn mẫu, có đoạn đọc thơ kết nhiễu q trình PCR mang tới, vậy, sử dụng thuật tốn Picard đánh dấu loại bỏ tín hiệu nhiễu Đối với chuẩn hóa điểm chất lƣợng base, hệ thống giải 24 trình tự có cách tính điểm riêng, vậy, điểm số lệ thuộc nhiều vào hệ thống, GATK cung cấp cơng cụ dùng để chuẩn hóa điểm số để tăng độ tin cậy bƣớc e Gọi đột biến (Variant calling) Sau có kết việc bắt cặp, sử dụng công cụ HaplotypeCaller GATK để gọi đột biến điểm hay đột biến thêm bớt đoạn Công cụ hoạt động dựa nguyên tắc đánh dấu vùng có khác biệt (active region), loại bỏ thơng tin bắt cặp vùng hồn tồn thực lại việc bắt cặp vùng nhằm tăng độ xác việc gọi đột biến Hình 14 Phát đột biến đánh dấu đột biến, loại đột biến f Xử lý liệu đột biến (Variant recalibration) Sau đột biến đƣợc gọi ra, thông thƣờng, tiêu chuẩn phân loại mặt chất lƣợng bắt cặp đƣợc đặt áp dụng để lọc liệu đột biến Tuy nhiên, việc sử dụng tiêu chuẩn phân loại cứng ngắc (hard filters) nhƣ không tối ƣu GATK(9) cung cấp công cụ Variant Quality Score Recalibration (VQSR) áp dụng máy học (machine learning) để lọc lại đột biến; VQSR bao gồm hai bƣớc: (1) tạo liệu chuẩn cho đột biến từ nguồn liệu có sẵn (dbSNP, 1000 Genome Project, HapMap v.v) (2) lọc liệu mẫu liệu chuẩn vừa tạo gán nhãn đạt (PASS) cho mẫu vƣợt qua đƣợc tiêu chuẩn 25 g Gán nhãn đột biến với đặc tính sinh học lâm sàng (Variant annotation) Chúng áp dụng ANNOVAR(10) để gán nhãn đột biến tìm đƣợc mẫu bệnh Một số nguồn liệu sử dụng RefSeq, dbSNP, v.v số thuật toán tiên đoán ảnh hƣởng đột biến (SIFT, PolyPhen) Tùy vào lựa chọn ngƣời dùng, ANNOVAR gán nhãn đột biến tên gen, chức vùng đột biến (intron exon), ảnh hƣởng đột biến exon (synonymous, non-synonymous, stop-gain, v.v), biến đổi cấu trúc chuỗi amino acid, ID đột biến database nhƣ dbSNP tiên đoán thuật toán nhƣ SIFT(11), PolyPhen(12), v.v mức độ ảnh hƣởng đột biến lên chức protein ANNOVAR cho tập tin dƣới định dạng tab-delimited text, tập tin mở EXCEL để phân loại đột biến đƣợc quan tâm B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng thống kê sơ đoạn đọc thô Kết thống kê cho mẫu bệnh, sử dụng giải trình tự hai đầu (paired-end), nên với mẫu bệnh, có hai tập tin thơ Bảng Thống kê cho hai đoạn đọc thô, forward (trái) reverse (phải) Thông tin hai đoạn đọc thơ cho thấy, tổng số trình tự 34036527 đoạn, với đoạn đƣợc đánh giá chất lƣợng thấp, độ dài đoạn 101 %GC rơi vào khoảng 49% Kết đột biến Chúng sử dụng EXCEL để lọc thủ công đột biến theo quy trình: (1) lọc đột biến theo gen quan tâm (Bảng 1); (2) loại đột biến tác động tới intron; (3) loại đột biến synonymous (không làm thay đổi axit amin) 26 Chúng tơi tìm đƣợc số đột biến không tác động tới intron Kết đƣợc thể qua CDC6 CDT1 CENPJ CEP152 NIN ORC1 1 1 SỐ ĐỘT BIẾN bảng dƣới đây: ORC4 PCNT XRCC4 TÊN GEN Hình 15 Tổng quan đột biến non-synonymous khơng tác động tới intron gen liên quan Tổng hợp thông tin tất đột biến tìm đƣợc phân loại theo nhóm bệnh đƣợc trình bảng 7, 8, 9: Bảng Tổng hợp đột biến hai gen liên quan tới SCKS CENPJ CENPJ:NM_018451:exon2:c.A61T:p.M21L CEP152 CEP152:NM_001194998:exon20:c.C2740G:p.L914V,CEP152:NM_014985:exon20:c.C2740G:p L914V CEP152:NM_001194998:exon3:c.C161T:p.S54L,CEP152:NM_014985:exon3:c.C161T:p.S54L 27 Bảng Tổng hợp đột biến gen liên quan tới MOPD I-III NIN NIN:NM_016350:exon27:c.C3661G:p.Q1221E,NIN:NM_020921:exon28:c.C5800G:p.Q1934E, NIN:NM_182944:exon28:c.C5800G:p.Q1934E,NIN:NM_182946:exon28:c.C5800G:p.Q1934E NIN:NM_020921:exon18:c.G3959A:p.G1320E,NIN:NM_182944:exon18:c.G3959A:p.G1320E, NIN:NM_182946:exon18:c.G3959A:p.G1320E NIN:NM_020921:exon18:c.A3374C:p.Q1125P,NIN:NM_182944:exon18:c.A3374C:p.Q1125P, NIN:NM_182946:exon18:c.A3374C:p.Q1125P PCNT NM_006031:c.-105delPCNT:NM_001315529:exon10:c.C1262T:p.T421I,PCNT:NM_006031:exon10:c.C1616T:p.T53 9I PCNT:NM_001315529:exon13:c.G1757A:p.G586E,PCNT:NM_006031:exon13:c.G2111A:p.G 704E PCNT:NM_001315529:exon15:c.A2281G:p.T761A,PCNT:NM_006031:exon15:c.A2635G:p.T8 79A PCNT:NM_001315529:exon15:c.T2759C:p.V920A,PCNT:NM_006031:exon15:c.T3113C:p.V1 038A PCNT:NM_001315529:exon26:c.A4561G:p.I1521V,PCNT:NM_006031:exon26:c.A4915G:p.I1 639V PCNT:NM_001315529:exon34:c.C7138T:p.Q2380X,PCNT:NM_006031:exon34:c.C7492T:p.Q 2498X PCNT:NM_001315529:exon37:c.G7623C:p.Q2541H,PCNT:NM_006031:exon37:c.G7977C:p Q2659H PCNT:NM_001315529:exon38:c.A8021G:p.Q2674R,PCNT:NM_006031:exon38:c.A8375G:p Q2792R XRCC4 NM_001318012:exon8:c.894-1G>A;NM_022406:exon8:c.894-1G>A 28 Bảng Tổng hợp đột biến gen liên quan tới MGS ORC1 ORC1:NM_001190818:exon9:c.C1397T:p.T466M,ORC1:NM_001190819:exon9:c.C1382T:p.T 461M,ORC1:NM_004153:exon9:c.C1397T:p.T466M ORC4 ORC4:NM_001190882:exon4:c.A11G:p.N4S,ORC4:NM_002552:exon5:c.A233G:p.N78S,ORC 4:NM_181741:exon5:c.A233G:p.N78S,ORC4:NM_181742:exon5:c.A233G:p.N78S,ORC4:NM _001190879:exon6:c.A233G:p.N78S NM_002552:c.-44745T>C;NM_001190882:c.-47962T>C;NM_001190881:c.61864T>C;NM_001190879:c.-44745T>C;NM_181741:c.-44745T>C CDT1 CDT1:NM_030928:exon5:c.T700C:p.C234R CDT1:NM_030928:exon5:c.A784G:p.T262A NM_030928:c.*92C>T CDC6 CDC6:NM_001254:exon10:c.G1321A:p.V441I Bàn luận Việc chẩn đoán bệnh phức tạp đòi hỏi kết hợp nhiều phƣơng phƣớng tiếp cận NGS cơng cụ đƣợc sử dụng, nghiên cứu này, chứng minh đƣợc hiểu NGS việc quan sát đánh giá nhiều gen, bao gồm gen liên quan tới bệnh nhƣ gen liên quan tới nhóm bệnh tƣơng tự Tuy nhiên, liệu đột biến lớn mà NGS tìm ra, cần phải có phƣơng án hiệu để lọc đột biến quan tâm; cụ thể, nghiên cứu chúng tôi, đột biến 15 gen liên quan đƣợc lọc từ liệu NGS EXCEL theo phƣơng án đƣợc nêu Trong 23 đột biến tìm đƣợc, 22 đột biến có sở liệu, chúng tơi tìm đƣợc đột biến tạo ba mã dừng (stopgain) đột biến chƣa đƣợc công bố cần kiểm chứng lại giải trình tự Sanger (16,18) Về độ tin cậy đột biến (có hay khơng đột biến tồn tại vị trí sau phân tích), việc sử dụng cơng cụ VQSR công cụ GATK loại bỏ đột biến chất lƣợng thấp đƣợc chứng minh tính hiệu quả(11,12) Về độ tin cậy kiểu gen (đồng hợp hay dị hợp), tiêu chí cần đƣợc đánh giá kiểu gen GT (Genotype), độ sâu vị trí đọc AD (Allele 29 Depth) DP (Depth of Coverage), điểm tin cậy kiểu tất kiểu gen PL (“normalized” Phred-scale likelihood of possible genotypes) điểm tin cậy kiểu gen GQ đƣợc chọn (Quality of the assigned genotype) Để đánh giá đƣợc tiêu chí này, ngƣời phân tích cần có hiểu biết thống kê đƣợc sử dụng cách đánh giá chúng KẾT LUẬN Tóm lại, ca bệnh trên, kết luận rằng, kết luận mặt lâm sàng hội chứng SCKS chƣa đủ thông tin cần đƣợc kiểm chứng Kết đột biến từ NGS gợi ý số hƣớng nghiên cứu tiếp tục cho ca bệnh trên; theo giả thiết đƣa ra, khả ca bệnh MOPD loại II Để khẳng định tìm hiểu sâu hơn, chúng tơi dự kiến giải trình tự Sanger cho đột biến tiềm năng, đồng thời phân tích gen bố/mẹ bệnh nhân để khảo sát đặc điểm di truyền bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Adzhubei I, Jordan DM, Sunyaev SR (2013) Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2 Curr Protoc Hum Genet, SUPPL.76 Alderton GK, Joenje H, Varon R, Borglum AD, Jeggo PA, O’Driscoll M (2004) Seckel syndrome exhibits cellular features demonstrating defects in the ATR-signalling pathway Hum Mol Genet, 13:3127-34 Andrews S (2010) FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data babraham Bioinforma, Bobabilla-Morales L, Corona-Rivera A, Corona-Rivera JR, et al (2003) Chromosomal instability induced in vitro with Mitomycin C in five Seckel syndrome patients Am J Med Genet A, 123:148-52 Bolger AM, Lohse M, Usadel B (2014) Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data Bioinformatics, 30(15):2114-2120 Boycott KM, Vanstone MR, Bulman DE, MacKenzie AE (2013) Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation Nat Rev Genet, 14(10):681-691 Broad Institute Picard tools https://broadinstitute.github.io/picard/ https://broadinstitute.github.io/picard/%0Ahttp://broadinstitute.github.io/picard/ Published 2016 30 Denz K, Kontas O, Akcakus M (2006) Neonatal hepatitis in siblings with Seckel syndrome Pediatr Dev Pathol, 9:81-85 Fox AJ, Hiemenz MC, Lieberman DB, et al (2016) Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors J Vis Exp, (115):1-11 10 Geister KA, Camper SA (2015) Advances in Skeletal Dysplasia Genetics Annu Rev Genomics Hum Genet, 16(1):199-227 11 Gorlin RJ, Cohen MMJr, Hennekam RCM (2001) Syndromes of the Head and Neck 4th ed Oxford University Press, New York, NY, 387-90 12 Henikoff S (2003) SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function Nucleic Acids Res, 31(13):3812-3814 13 Jones KL (1997) Smith’s Recognizable Patterns of Human Malformation 5th ed W B Saunders Co., Philadelphia, PA, 108-09 14 Khetarpal P, Das S, Panigrahi I, Munshi A (2016) Primordial dwarfism: overview of clinical and genetic aspects Mol Genet Genomics, 291(1):1-15 15 Li H, Durbin R (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform Bioinformatics, 26(5):589-595 16 Murthy J, Seshadri KG, Ramanan PV, Rajamani A, Hussain A (2004) A case of cleft lip and palate associated with Seckel syndrome Cleft Palate Craniofac J, 41:202-05 17 Vander AGA, Carneiro MO, Hartl C, et al (2002) GATK Best Practices Curr Protoc Bioinformatics, 11(1110):11.10.1-11.10.33 18 Wang K, Li M, Hakonarson H (2010) ANNOVAR: Functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data Nucleic Acids Res, 38(16) 31 ... ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN- SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA BỆNH SECKEL. .. (NGS) công nghệ áp dụng việc giải trình tự song song nhiều đoạn DNA lúc; công nghệ ƣu việt so với giải trình tự Sanger mặt cơng suất nhƣ hiệu kinh tế(3,4) Cụ thể, việc sử dụng giải trình tự Sanger... nêu Trong 23 đột biến tìm đƣợc, 22 đột biến có sở liệu, chúng tơi tìm đƣợc đột biến tạo ba mã dừng (stopgain) đột biến chƣa đƣợc công bố cần kiểm chứng lại giải trình tự Sanger (16,18) Về độ tin