Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Thu Hƣờng THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Thu Hƣờng THIẾT KẾ ĐẦU DÒ ADN CHO KỸ THUẬT LAI DOT BLOT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, người bảo tận tình suốt q trình tơi thực đề tài Cơ khơng truyền thụ cho nhiều kiến thức chuyên mơn mà cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho q trình thực luận văn, hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận Cơ động viên, dành cho nhiều lời khuyên quý báu lúc tơi gặp khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Ngô Thị Hà, NCS Vương Diệu Linh, ThS Lê Hồng Thu, CN Trần Tuấn Anh bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống Phòng Genomic thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym - Protein giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ anh trai, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ nhiều vật chất lẫn tinh thần để tơi hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thu Hường Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic bp Base pair (cặp bazơ) cs Cộng codon Cd Da Dalton dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate H2O Nƣớc kb Kilobase = 1000 bp M Mol/lit PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Saline Sodium Citrate TBE Đệm Tris - Borate - EDTA Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng Đặc điểm số loại màng dùng kỹ thuật lai axit nucleic 19 Bảng Thành phần dung dịch dùng quy trình lai điểm lai 27 điểm ngƣợc Bảng Trình tự mồi dùng nghiên cứu kích thƣớc sản 28 phẩm PCR tƣơng ứng Bảng Trình tự đầu dị oligo dùng kỹ thuật lai điểm ngƣợc 28 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C T 31 Bảng Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng phân tách ADN 38 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dò M 39 Bảng Thành phần điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M 40 với biotin DIG Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng 48 thời đột biến Cd 17, Cd 26 Cd 41-42 gen β-globin Bảng 10 Kết sàng lọc đột biến Cd 17, Cd 26 Cd 41-42 30 50 mẫu bệnh phẩm phản ứng PCR đa mồi Bảng 11 Thành phần điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R 50 khuếch đại đoạn gen β-globin kích thƣớc 700 bp Bảng 12 Thành phần điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ 53 thuật lai điểm ngƣợc Bảng 13 Tần số đột biến gây bệnh β-thalassemia số quốc gia giới Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 61 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình Trang Mơ hình chuỗi xoắn kép, liên kết hydro phosphodieste 03 phân tử ADN Hình Sự biến tính hồi tính phân tử ADN sợi kép 04 Hình Các phân tử sợi kép hình thành phản ứng lai axit nucleic 05 Hình Đánh dấu đầu dò phƣơng pháp dịch chuyển điểm đứt 07 Hình Đánh dấu đầu dị phƣơng pháp dùng mồi ngẫu nhiên 08 Hình Nguyên lý chung hệ thống đánh dấu khơng phóng xạ gián tiếp 12 Hình Cấu trúc phân tử digoxigenin-11-dUTP biotin-16-dUTP 13 Hình Tính tƣơng đồng đoạn C, T M 25 Hình Vị trí đầu dị oligo cặp mồi CD F/R gen β-globin 30 Hình 10 Kết đánh dấu đầu dị M với biotin DIG 41 Hình 11 Kết so sánh hiệu đánh dấu biotin DIG kiểm tra độ 42 nhạy kỹ thuật lai điểm Hình 12 Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C đoạn T 43 Hình 13 Kết lai điểm phân biệt đoạn C đoạn T 650C 44 Hình 14 Kết lai điểm với loại ADN khác chứa đoạn C 45 đoạn T Hình 15 Kết lai đầu dị M với plasmid khơng mang đoạn chèn C T 46 Hình 16 Kết lai điểm với plasmid pBluescript cặp mồi M13 F/R 47 Hình 17 Sơ đồ minh họa vị trí mồi sử dụng phản ứng PCR đa mồi 49 Hình 18 Kết điện di sản phẩm PCR đa mồi 49 Hình 19 Kết tinh sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R 51 Hình 20 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen khuếch đại 52 cặp mồi CD F/R với ngân hàng liệu NCBI Hình 21 Kết đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 54 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Hình 22 Chuẩn hóa lƣợng đầu dò chấm lên màng kỹ thuật lai điểm 55 ngƣợc Hình 23 Kết lai điểm ngƣợc phát đột biến gen β-globin 55 cặp đầu dị Hình 24 Kết lai điểm ngƣợc phát đồng thời ba đột biến gen β-globin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 57 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN 1.2 NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 1.3 ĐẦU DÒ 1.3.1 Đặc điểm đầu dò kỹ thuật lai axit nucleic 1.3.2 Các phƣơng pháp đánh dấu đầu dò 1.3.3 Các chất đánh dấu đầu dò 1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 13 1.4.1 Lai chỗ 13 1.4.2 Lai pha lỏng 15 1.4.3 Lai pha rắn 15 1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN 18 1.6 ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 20 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Các mồi 27 2.1.4 Các đầu dò oligo 28 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 2.1.5 Màng lai 29 2.1.6 Thiết bị 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Thiết kế đầu dò 29 2.2.2 Phƣơng pháp PCR 30 2.2.3 Quá trình lai điểm 31 2.2.3.1 Biến tính cố định ADN màng nylon (Roche) 31 2.2.3.2 Tiền lai lai 32 2.2.3.3 Phát đầu dò 33 2.2.4 Quá trình lai điểm ngƣợc 34 2.2.4.1 Hoạt hóa màng nylon (Pall) 34 2.2.4.2 Cố định đầu dò màng nylon (Pall) 34 2.2.4.3 Tiền lai lai 34 2.2.4.4 Phát đầu dò đánh dấu biotin 35 2.2.5 Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm 35 2.2.6 Tách plasmid 36 2.2.7 Tinh sản phẩm PCR kit High pure PCR cleanup micro 37 2.2.8 Phƣơng pháp điện di 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 A - KẾT QUẢ 39 3.1 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM 39 3.1.1 Kết khuếch đại đánh dấu đầu dò M 39 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 3.1.2 So sánh hiệu đánh dấu với biotin DIG 41 3.1.3 Chuẩn bị trình tự đích trình tự đối chứng 42 3.1.4 Kết lai điểm phân biệt trình tự đích trình tự đối chứng 43 3.2 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC 47 3.2.1 Sàng lọc số đột biến gen β-globin 47 3.2.2 Chuẩn bị đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngƣợc 52 3.2.3 Kết lai điểm ngƣợc phát đột biến gen β-globin 54 B - THẢO LUẬN 57 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 72 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học đột biến ngƣời Hy Lạp, có đột biến Cd [G→T] làm thay đổi ba GAG (Glu) thành mã kết thúc TAG [9] Kỹ thuật PCR đƣợc áp dụng phổ biến với ƣu điểm nhanh chóng, tiết kiệm, phát đƣợc đồng thời một vài sai khác Trong nghiên cứu Colah cs (2009), đột biến phổ biến gen β-globin ngƣời Ấn Độ đƣợc phát kỹ thuật PCR đa mồi [13] Trƣờng hợp trình tự thay đổi nucleotide, việc thiết kế mồi chuẩn hóa điều kiện cho phản ứng PCR gặp khơng khó khăn để tránh tƣợng âm tính giả, dƣơng tính giả Việc phát đồng thời nhiều đột biến phân biệt đột biến đồng hợp hay dị hợp PCR bị ảnh hƣởng việc cạnh tranh nhiều mồi phản ứng Hassan cs (2013) thiết lập phản ứng MARMS-PCR (Multiplex Amplification Refractory Mutation System-Polymerase chain reaction) cho 20 đột biến gen β-globin ngƣời Malaysia, phản ứng phát hoặc tối đa đột biến [27] Kỹ thuật lai điểm lai điểm ngƣợc khắc phục giới hạn nhƣng kit thƣơng mại có thị trƣờng có giá thành tƣơng đối cao Với mong muốn tiết kiệm thời gian chi phí, chúng tơi chủ động thiết lập quy trình lai điểm lai điểm ngƣợc Trƣớc tiên, lựa chọn phƣơng pháp đánh dấu nhờ phản ứng PCR để tạo đầu dị cách nhanh chóng cho tín hiệu tốt [40] Chúng sử dụng hai chất đánh dấu thông dụng biotin DIG [36, 39] Kết Hình 11 cho thấy đầu dị đánh dấu cho tín hiệu rõ ràng khơng có khác biệt đáng kể hai loại chất đánh dấu Do đó, để tiết kiệm chi phí, chúng tơi sử dụng biotin phản ứng đánh dấu Khi pha lỗng đoạn M khơng đánh dấu, nồng độ ng chúng tơi quan sát thấy tín hiệu màu rõ nét (Hình 11) So sánh với độ nhạy 200 pg ARN ̣ gen rotavirus nghiên cứu Fernandez và cs [18] kết chúng tơi cịn khiêm tốn Để dễ dàng quan sát kết lai phân biệt hai đoạn C T, định sử dụng nồng độ ng Tuy nhiên, chắn chúng tơi cịn tiếp tục pha lỗng sản phẩm PCR để xác định xác độ nhạy kỹ thuật lai điểm Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 58 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Tiếp theo, chuẩn hóa q trình lai điểm để phân biệt hai đoạn ADN sai khác nucleotide Sản phẩm khuếch đại đoạn đích C đoạn đối chứng T đƣợc cố định màng lai với đầu dò M đánh dấu biotin Kết cho thấy vị trí chấm đoạn T khơng xuất tín hiệu vị trí chấm đoạn C cho màu rõ nét (Hình 13) Điều chứng tỏ chúng tơi chuẩn hóa đƣợc điều kiện lai điểm để phân biệt đoạn C với đoạn T Chúng thu đƣợc kết ổn định trộn thêm đoạn ADN ngoại lai vào đoạn đích (Hình 14) Đầu dị M khơng lai với đoạn C mà cịn có khả lai với trình tự mồi M13 F M13 R plasmid chứa đoạn C (pGEM-C) plasmid chứa đoạn T (pTZ57-T), hai plasmid tƣơng ứng không mang đoạn chèn (pGEM pTZ57) plasmid pBluescript (Hình 15 Hình 16) Tuy nhiên, chúng tơi khơng quan sát thấy tín hiệu màu vị trí nhỏ trực tiếp hai mồi M13 F M13 R màng lai với đầu dò M Kết plasmid mang trình tự M13 F/R có kích thƣớc lớn nên cố định màng lai với đầu dò, mồi M13 F/R có kích thƣớc ngắn, dễ dàng bị rửa trơi q trình lai điểm Nếu nhƣ kỹ thuật lai điểm phát đột biến kỹ thuật lai điểm ngƣợc có khả sàng lọc đồng thời nhiều đột biến Đặc điểm mang lại nhiều thuận lợi áp dụng với bệnh gây nhiều đột biến Hơn nữa, với đột biến, việc thiết kế cặp đầu dò gồm đầu dị đột biến (bổ sung với trình tự gen gây bệnh ngƣời bệnh) đầu dị bình thƣờng (bổ sung với trình tự gen tƣơng ứng ngƣời bình thƣờng) cịn giúp phân biệt đột biến đồng hợp hay dị hợp Beta thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thƣờng phổ biến giới [72] Bệnh đột biến gen β-globin gây giảm tổng hợp chuỗi β-globin, hồng cầu trở nên dễ vỡ từ dẫn tới thiếu máu Cho đến nay, 200 đột biến đƣợc tìm thấy gen β-globin, chủ yếu đột biến điểm (thay thế, thêm nucleotide) [48, 62] Trẻ bị bệnh sẽ có biểu lâm sàng vịng - tháng sau sinh Bệnh nhân thalassemia thể nặng cần Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 59 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học truyền máu thải sắt suốt đời [56] Việc điều trị nhƣ có tác dụng tạm thời gây tốn Cho đến nay, phƣơng pháp chữa trị hiệu ghép tế bào gốc tạo máu từ tủy xƣơng [56] Đây kỹ thuật đòi hỏi nhiều điều kiện (tìm tế bào gốc phù hợp, chi phí phẫu thuật cao ) mà bệnh nhân tiếp cận đƣợc Vì vậy, biện pháp chẩn đốn trƣớc sinh có ý nghĩa kiểm sốt bệnh β-thalassemia [61] Dựa nguyên lý kỹ thuật lai điểm ngƣợc, hãng ViennaLab Diagnostics GmbH (Áo) phát triển kit để phát đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia Bộ kit gồm ba loại tƣơng ứng với ba khu vực: Địa Trung Hải (β-Globin StripAssay MED), Trung Đông Ấn Độ (βGlobin StripAssay IME) Đông Nam Á (β-Globin StripAssay SEA) [83] Mỗi loại chứa 22 đột biến phổ biến khu vực Tần số đột biến gen βglobin gây bệnh β-thalassemia khơng có khác biệt lớn phụ thuộc vào vùng địa lý mà thay đổi theo quốc gia tộc ngƣời (Bảng 13) Do việc thiết lập quy trình lai điểm ngƣợc nhằm phát đột biến gây bệnh β-thalassemia cho quốc gia cần thiết để giảm gánh nặng chi phí xét nghiệm Một số tác giả công bố kết khả quan áp dụng lai điểm ngƣợc phát đồng thời nhiều đột biến gen β-globin: 16 đô ̣t biế n ở ngƣời Mỹ gố c Phi [61]; 17 đột biến ngƣời Trung Quốc [37] Trong nghiên cứu này, thiết kế ba cặp đầu dị oligo (gắn nhóm amin đầu 5') cố định đƣợc màng nylon Mỗi cặp gồm đầu dị bình thƣờng đột đầu dị đột biến, tƣơng ứng với mã ba đột biến hay gặp gen βglobin Cd 17, Cd 26 Cd 41-42 Chúng tơi chuẩn hóa đƣợc lƣợng đầu dị chấm lên màng µl nồng độ 100 nM (Hình 22) Nồng độ thấp nhiều nồng độ đầu dị sử dụng quy trình lai điểm ngƣợc Chan cs (5 µM) [11] Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen chứa ba vị trí mẫu bệnh phẩm đƣợc đánh dấu biotin dùng để lai với màng Hệ thống phát biotin streptavidin đƣợc dùng để quan sát kết phản ứng lai Kết Hình 24 cho thấy trình lai điểm ngƣợc chúng tơi phát đột biến, phân biệt đột biến đồng hợp dị hợp gen β-globin Nhƣ vậy, ứng dụng Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 60 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học thành công kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phát đồng thời ba đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia ngƣời Việt Nam Với kết bƣớc đầu nhƣ trên, nghiên cứu tiếp theo, mong muốn bổ sung thêm đầu dò phát đột biến khác gây bệnh β-thalassemia có tần số cao Việt Nam nhƣ đột biến vị trí -28 [A→G], Cd 71-72 [+A], IVS I-1 [G→T], IVS II-654 [C→T] [61] Bảng 13: Tần số đột biến gây bệnh β-thalassemia số quốc gia giới Ngƣời Đột biến phổ biến gen β-globin gây bệnh β-thalassemia Tài liệu tham khảo Mỹ (gốc Phi) -88 [C→T], -29 [A→G], Cd [-A], Cd 24 [T→A], IVS I-5 [G→T], IVS II-849 [A→C], Cd 106-107 [+G] [63] Hy Lạp IVS I-110 [G→A], Cd 39 [C→T], IVS I-1 [G→A], IVS I-6 [T→C], IVS II-745 [C→G], IVS II-1 [G→A] [9] Ấn Độ IVS I-5 [G→C], Cd 15 [G→A], IVS I-1 [G→T], Cd 8-9 [+G], Cd 41-42 [-TCTT], Cd 30 [G→C], đoạn 619 bp [14] Malaysia IVS II-654 [C→T], Cd 41-42 [-TCTT], IVS I-5 [G→C], Cd 26 [G→A], IVS I-1 [G→T] [28] Trung Quốc -28 [A→G], Cd 17 [A→T], Cd 26 [G→A], Cd 41-42 [-TCTT], Cd 71-72 [+A], IVS II-654 [39] Thái Lan Cd 41-42 [-TCTT], Cd 17 [A→T], -28 [A→G], Cd 71-72 [+A], IVS I-1 [G→T], IVS II-654 [C→T], đoạn 3,4 kb [75] Việt Nam Cd 17 [A→T], Cd 41-42 [-TCTT], Cd 26 [G→A], -28 [A→G], Cd 71-72 [+A], IVS I-1 [G→T], IVS II-654 [C→T] [61] Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 61 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc đƣa kết luận sau đây: Đánh dấu thành cơng đầu dị M đoạn gen β-globin với biotin thơng qua phản ứng PCR có mặt biotin-11-dUTP Tối ƣu hóa đƣợc q trình lai điểm để phân biệt hai trình tự sai khác nucleotide Thiết kế thành cơng ba cặp đầu dị oligo dùng phát ba đột biến phổ biến (đột biến Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) Cd 41-42 [-TCTT]) gen β-globin gây bệnh β-thalassemia Tối ƣu hóa đƣợc q trình lai điểm ngƣợc để phát ba đột biến (đột biến Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) Cd 41-42 [-TCTT]) gen βglobin phân biệt đột biến đồng hợp, dị hợp KIẾN NGHỊ Hƣớng nghiên cứu là: Phát triển kỹ thuật lai điểm để phân biệt trình tự sai khác nucleotide Bổ sung cặp đầu dò oligo cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc nhằm phát thêm số đột biến phổ biến khác gây bệnh β-thalassemia nhƣ đột biến vị trí -28 [A→G], Cd 71-72 [+A], IVS I-1 [G→T], IVS II-654 [C→T] Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 62 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Chấn Hùng (2004), Ung thư học nội khoa, Nhà xuất Y học Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Tuyết Vân, Nguyễn Hoàng Quân, Cao Minh Nga (2010), "Nhiễm type Human Papillomavirus phụ nữ tuối sinh đẻ", Y học TP Hồ Chí Minh, Tập 14 (1), tr 504-508 Võ Thị Thƣơng Lan (2009), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, Nhà xuất Giáo dục Tiếng Anh Amann R., Ludwig W (2000), "Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology", FEMS Microbiology Reviews, 24, pp 555565 An S F., Franklin D., Fleming K A (1992), "Generation of digoxigeninlabelled double-stranded and single-stranded probes using the polymerase chain reaction", Moleculer and Cellular Probes, 6, pp 193-200 Barbu V (2007), "Molecular hybridization techniques of nucleic acids", Innovative Romanian Food Biotechnology, 1, pp 1-12 Bottari B., Santarelli M., Neviani E., Gatti M (2010), "Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: culture-independent approach", Journal of Applied Microbiology, 108, pp 1676-1684 Boussiou M., Karababa P., Sinopoulou K., Tsaftaridis P., Plata E., LoutradiAnagnostou A (2008), "The molecular heterogeneity of β-thalassemia in Greece", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 40, pp 317-319 10 Braissant O., Wahli W (1998), "A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labeled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections", Biochemia, 1, pp 10-16 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 63 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 11 Chan V., Yam I., Chen F E., Chan T K (1999), " A reverse dot blot method for rapid detection of non-deletion α thalassaemia", British Journal of Haematology, 104, pp 513-515 12 Clement G., Benhattar J (2005), "A methylation sensitive dot blot assay (MSDBA) for the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samplas", J Clin Pathol, 58, pp 155-158 13 Colah R., Gorakshakar A., Nadkarni A, Phanasgaonkar S., Surve R., Sawant P., Mohanty D., Ghosh K (2009), "Regional heterogeneity of β-thalassemia mutations in the multi ethnic Indian population", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 42, pp 241-246 14 Dawson D B (1990), "Use of nucleic acid probes in genetic tests", Clin Biochem, 23, pp 279-285 15 Dessauer H C., Reeder T W., Cole C J., Knight A (1996), "Rapid screening of DNA diversity using dot-blot technology and allele-specific oligonucleotides: Maternity of hybrids and unisexual cones of hybrid origin (Lizards, Cnemidophorus)", Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, pp 366-372 16 Dianandis E P., Christopoulos T K (1991), "The biotin-(strept)avidin system: Principles and applications in biotechnology", Clinical chemistry, 37, pp 625-636 17 Dooki M E., Akkhavan-Niaki H., Juibary A G (2011), "Detecting common CFTR mutations by reverse dot blot hybridization method in cystic fibrosis first report from Northern Iran", Iran I Pediatr, 21, pp 51-57 18 Fernandez J., Sandino A., Yudelevich A., Avendano L F., Venegas A., Hinrichsen V., Spencer E (2009), "Rotavirus detection by dot blot hybridization assay using a non-radioactive synthetic oligodeoxynucleotide probe", Epidemiol Infect., 108, pp 175-184 19 Forslund O., Hansson B G., Bjerre B (1994), "Typing of human papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and a nonradioactive reverse dot blot hybridization", Journal of Virological Methods, 49, pp 129-140 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 64 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 20 Fox J L., Hsu P H., Legator M S., Morrison L E., Seelig S A (1995), "Fluorescence in situ hybridization: Powerful molecular tool for cancer prognosis", Clin Chem, 41, pp 1554-1559 21 Gall J G., Pardue M L (1969), "Formation and detection of ARN-ADN hybrid molecular in cytological preparations", Proc Natl Acad Sci USA, 63, pp 378-383 22 Gong Y., Sweet W., Duh Y., Greenfield L., Fang Y., Zhao J., Tarco E., Symmans W F., Isola J., Sneige N (2009), "Chromogenic in situ hybridization is a reliable method for detecting HER2 gene status in breast cancer", Am J Clin Pathol, 131, pp 490-497 23 Gonzalez M P., Sanchez X., Ganga M A., Lopez-Lastra M., Jashes M., Sandino A M (1997), "Detection of the infectious hematopoietic necrosis virus directly from infected fish tissues by dot blot hybridization with a nonradioactive probe", Journal of Virological Methods, 65, pp 273-279 24 Gupta D., Middleton L P., Whitaker M J., Abrams J (2003), "Comparison of Fluorescence and Chromogenic in situ hybridization for detection of HER2/neu oncogen in breast cancer", Am J Clin Pathol, 119, pp 381-387 25 Hammermueller J D., Krell P J., Derbyshire J B., Nagy E (1991), "An improved dot-blot method for virus detection in chicken embryo fibroblast cultures", Journal of Virological Methods, 31, pp 47-56 26 Harris M R (1991), "Non-radioactive techniques for the labelling of nucleic acids", Biotech adv, 9, pp 185-196 27 Hassan S., Ahmad R., Zakaria Z., Zulkafli Z., Abdullah W Z (2013), "Detection of β-globin gene mutations among β-thalassaemia carriers and patients in Malaysia: Application of Multiplex Amplification Refractory Mutation System–Polymerase Chain Reaction", Malays J Med Sci., 20, pp 1320 28 Heitzler J., Marechal-Drouard L., Dirheimer G., Keith G (1992), "Use of a dot blot hybridization method for identification of pure tRNA species on different membranes", Biochimica et Biophysica Acta, 1129, pp 273-277 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 65 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 29 Hopp H E., Hain L., Almonacid F B., Tozzini A C., Orman B., Arese A I., Ceriani M F., Saladrigas M V., Celnik R., Vas M., Mentaberry A N (1991), "Development and application of a nonradioactive nucleic acid hybridization system for simultaneous detection of four potato pathogens", Journal of Virological Methods, 31, pp 11-30 30 Hsu Y C., Yeh T J., Chang Y C (2005), "A new combination of RT-PCR and reverse dot blot hybridization for rapid detection and identification of potyviruses", Journal of Virological Methods, 128, pp 54-60 31 Juan M., Qin-sheng G U., Shi-ming L., Peng B., Li-feng L., Yan-bing T., Li L (2007), "Dot-blot hybridization for detection of five cucurbit viruses by digoxigenin- labelled cDNA probes", Agricultural Sciences in China, 6, pp 1450-1455 32 Kafatos F C., Jones C W., Efstratiadis A (1979), "Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure", Nucleic Acids Research, 7, pp 1541-1552 33 Kessler C (1994), "Non-radioactive analysis of biomolecules", Journal of Biotechnology, 35, pp 165-189 34 Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S (2005), "Probiotic bacteria may become dormant during storage", Applied and Environmental Microbiology, 71, pp 1662-1663 35 Landry M L (1990), "Nucleic acid hybridization in viral diagnosis", Clin Biochem, 23, pp 267-277 36 Leary J., Brigati D J., Ward D C (1983), "Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots”, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp 4045-4049 37 Li D., Liao C., Xie X., Huang Y., Zhong H., Wei J (2006), "Prenatal diagnosis of β-thalassemia in Southern China", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 128, pp 81–85 38 Lin M., Zhu J J., Wang Q., Xie L X., Lu M., Wang J L., Wang C F., Zhong T Y., Zheng L., Pan M C., Wu J R., Wen Y F., Liu G R., Zhan X F., Lin Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 66 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học F., Yang L Y (2012), "Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in Chinese", Blood Cells, Molecular, and Diseases, 48, pp 86-90 39 Liu Y., SunB., Wang X., Zheng C., Zhou G (2007), "Three digoxigeninlabeled cDNA probes for specific detection of the natural population of Barley yellow dwarf viruses in China by dot-blot hybridization", Journal of Virological Methods, 145, pp 22-29 40 Lo Y M D., Mehal W Z., Fleming K A (1988), "Rapid production of vector-free biotinylated probes using the polymerase chain reaction", Nucleic Acids Research, 16, pp 8719 41 Lodish H., Berk A., Zipursky S L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J (2000), Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W H Freeman 42 Lu X., Hua L., Zhang T., Li S., Fan X., Peng Q., Li W., Ye J., Long J., He X (2013), "A reverse dot blot assay for the expanded screening of eleven Chinese G6PD mutations", Clinica Chimica Acta, 418, pp 45-49 43 Machado A., Almeida C., Carvalho A., Boyen F., Haesebrouck F., Rodrigues L., Cerca N., Azevedo N F (2013), "Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Lactobacillus spp in milk samples", International Journal of Food Microbiology, 162, pp 64-70 44 Madrid M A., Lo R W (2004), "Chromogenic in situ hybridization (CISH): a novel alternative in screening archival breast cancer tissue samples for HER2/neu status", Breast Cancer Research, 6, pp 593-600 45 Matsumoto K., Takada T., Shimizu K., Kado Y., Kawakami K., Makino I., Yamaoka Y., Hirano K., Nishimura A., Kajimoto O., Nomoto K (2006), "The effects of a probiotic milk product containing Lactobacillus casei strain Shirota on the defecation frequency and the intestinal microfola of sub-optimal health state volunteers: a randomized placebo-controlled cross-over study", Bioscience and Microfola, 25, pp 39-48 46 Metaferia B., Wei J S., Song Y K., Evangelista J., Aschenbach K., Johansson P., Wen X., Chen Q., Lee A., Hempel H., Gheeya J S., Getty S., Gomez R., Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 67 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Khan J (2013), "Development of peptide nucleic acid probes for detection of the HER2 oncogene", Plos One, 8, e58870 47 Mifflin T E (1989), "Use and applications of nucleic acid probes in the clinical laboratory", Clin, Chem., 35, pp 1819-1825 48 Mo Q H., Li X R., Li C F., He Y L., Xu X M (2005), "A novel frameshift mutation (+G) at codons 15/16 in a β0 thalassaemia gene results in a significant reduction of β-globin mRNA values", J Clin Pathol, 58, 923-926 49 Moliaka I., Ovchinnikov I.V., Shlenskii A.B., Korovaitseva G.I., Rogaev E.I (1997), "DNA genotyposcoy in determining paternity: use of hybridized probes", Genetika, 33, pp 831-835 50 Nakamura R M (1990), "Overview and principles of in situ hybridization", Clin Biochem, 23, pp 255-259 51 Osiowy C., Giles E (2003), "Evaluation of the INNO-LiPA HBV Genotyping Assay for determination of Hepatitis B Virus genotype", Journal of Clinical Microbiology, 41, pp 5473-5477 52 Pas S D., Tran N., Man R A., Burghoorn-Maas C., Vernet G., Niesters H G M (2008), "Comparison of reverse hybridization, microarray, and sequence analysis for genotyping Hepatitis B Virus", Journal of clinical microbiology, 46, pp 1268-1273 53 Richards J C (1991), "Gene probes", Current Opinion in Biotechnology, 2, pp 76-85 54 Saiki R K., Walsh P S., Levenson C H., Erlich H A (1989), "Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes", Genetics, 86, pp 6230-6234 55 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 56 Shawky R M., Kamal T M (2012), "Thalassemia intermedia: An overview", The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 13, pp 245-255 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 68 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 57 Stahl D A., Kane M D (1992), "Methods in microbial identification, tracking and monitoring of function", Curr Opin Biotechnol., 3, pp 244–252 58 Strachan T., Read A P (2004), Human Molecular Genetics, 3rd edition, Garland Science 59 Svasti M L S., Tran M H., Mukongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran V B., Fucharoen S (2002), "Molecular analysis of β-thalassemia in south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88 60 Sun Y., Perch-Nielsen I., Dufva M., Sabourin D., Bang D D., Hogberg J., Wolff A (2012), "Direct immobilization of DNA probes on non-modified plastics by UV irradiation and integration in microfluidic devices for rapid bioassay", Anal Bioanal Chem, 402, pp 741-748 61 Sutcharitchan P., Saiki R., Huisman T H J., A Kutlar, McKie V., Erlich H., Embury S H (1995), "Reverse dot-blot detection of the African-American βthalassemia mutations", Blood, 86, pp 1580-1585 62 Svasti M L S., Tran M H., Munkongdee T., Winichagoon P., Tran V B., Tran V B., Fucharoen S (2002), "Molecualr analysis of β-thalassemia in south Vietnam", American Journal of Hematology, 71, pp 85-88 63 Syrjanen S., Andersson B., Juntunen L., Syrjanen K (1991), "The use of polymerase chain reaction in generation of biotinylated human papillomavirus DNA probes for in situ hybridization", Journal of Virological methods, 31, pp 147-160 64 Takahashi T., Mitsuda T., Okuda K (1989), "An alternative nonradioactive method for labeling DNA using biotin", Analytical biochemistry, 179, pp 7785 65 Tenover F C (1988), "Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases", Clinical Microbiology Reviews, 1, pp 82-101 66 Twomey T A., Krawetz S A (1990), "Parameters affecting hybridization of nucleic acids blotted onto nylon or nitrocellulose membranes", Biotechniques, 8, pp 478-482 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 69 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 67 Uhlmann V., Prasad M., Silva I., Luettich K., Grande L., Alonso L., Thisted M., Pluzek K L., Gorst J., Ring M., Sweeney M., Kenny C., Martin C., Russell J., Bermingham N., O'Donovan M., Sheils O., O'Leary J J (2000), "Improved in situ detection method for telomeric tanddem repeats in metaphase spreads and interphase nuclei", Mol Pathol, 53, pp 48-50 68 Velazquez W A C., Hernandez H C., Marquez C A., Hernandez A F O., Rodriquez C M., Salamanca G F., Coral V R (2008), "Identification of duchence muscular dystrophy female carriers by fluorescence in situ hybridization and RT-PCR", Genet Test, 12, pp 221-223 69 Ward D M., Bateson M M., Weller R., Ruff-Roberts A L (1992), "Ribosomal RNA analysis of micro-organisms as they occur in nature", Adv Microb Ecol., 12, pp 219–286 70 Weeks I., Behesti I., McCapra F., Campbell A K., Woodhead J S (1983), "Acridinum ester as high-specific-activity labels in immunoassay", Clin Chem., 29, pp 1474-1479 71 Wetmur J G (1991), "DNA probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization", Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, pp 227-259 72 Wang W., Kham S K Y., Yeo G., Quah T., Chong S S (2003), "Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian β-thalassemia mutations", Clinical Chemistry, 49, pp 209-218 73 Yamsri S., Sanchaisuriya K., Fucharoen G., Sae-ung N., Fucharoen S (2011), "Genotype and phenotype characterizations in a large cohort of β-thalassemia heterozygote with different forms of α-thalassemia in northeast Thailand", Blood Cells, Molecules, and Diseases, 47, pp 120-124 74 Yang T., Yuan L., Huang S., Zhao S (1998), "Screening mutations in phenylketonuria by means of non-radioactive reverse dot blot hybridization", Zhonghua Yi Xue Chuan Xue Za Zhi, 15, pp 307-309 75 Zakrzewska K., Ciappi S., Azzi A (1993), "Polymerase chain reaction for synthesis of digoxigenin-labelled DNA probe: application to parvovirus B19 and to polyomavirus BK", Molecular and Cellular Probes, 7, pp 55-60 Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 70 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 76 Zhang Y., Coyne M Y., Wil S G., Levenson C H., Kawasaki E S (1991), "Single-base mutational analysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified oligonucleotides", Nucleic acids research, 19, pp 3929-3933 Trang web 77 http://www.cnx.org/content/m45473/latest/ 78 http://www.keywordpicture.com/keyword/hybridization%20protection%20ass ay/ 79 http://www.lifetechnologies.com/vn/en/home/life-science/cell-analysis/cellular -imaging/in-situ-hybridization-ish.html 80 http://www.millipore.com/techpublications/tech1/www1 81 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/455025 82 http://www.pall.com/main/laboratory/literature-library-details.page?id=28575 83 http://www.viennalab.com/products/genetic_disorders/thalassemia_stripassay 84 http://www.vietacorp.com/product_detail.php?module=product&menuitem=& category_ID=12&product_ID=801#anchor_body Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 71 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học PHỤ LỤC Kết giải trình tự đoạn gen β-globin mẫu T9 (khung màu đỏ vị trí đột biến) Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 72 ... tài: "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai điểm dot blot" với mục đích: (1) thiết lập đƣợc quy trình lai điểm để phân biệt hai trình tự tƣơng đồng sai khác số vị trí nucleotide; (2) thiết kế đầu. .. lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) giải trình tự gen Đáng ý số phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - phát triển phƣơng pháp lai ADN Đây kỹ thuật kinh điển nhƣng... ứng lai axit nucleic [58] 1.3 ĐẦU DÒ 1.3.1 Đặc điểm đầu dò kỹ thuật lai axit nucleic Đầu dò phân tử axit nucleic có độ tƣơng đồng cao với trình tự đích (ADN hoă ̣c ARN) [5, 8] Các ADN dùng làm đầu