Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot

Các bước cơ bản của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai.. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài Cô không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp tôi

tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này

Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận Cô đã luôn động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Ngô Thị Hà, NCS Vương Diệu Linh, ThS

Lê Hồng Thu, CN Trần Tuấn Anh và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein đã giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ và anh trai, người thân và bạn bè

đã ủng hộ, giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hường

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic

ARN Axit ribonucleic

bp Base pair (cặp bazơ)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SSC Saline Sodium Citrate

TBE Đệm Tris - Borate - EDTA

với biotin và DIG

40

Bảng 9 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng

thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin

48

Bảng 10 Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30

mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng PCR đa mồi

50

Bảng 11 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R

khuếch đại đoạn gen β-globin kích thước 700 bp

50

Bảng 12 Thành phần và điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ

thuật lai điểm ngược

53

Bảng 13 Tần số đột biến gây bệnh β-thalassemia ở một số quốc gia trên

thế giới

61

Hình 9 Vị trí các đầu dò oligo và cặp mồi CD F/R trên gen β-globin 30 Hình 10 Kết quả đánh dấu đầu dò M với biotin và DIG 41 Hình 11 Kết quả so sánh hiệu quả đánh dấu biotin và DIG và kiểm tra độ

nhạy của kỹ thuật lai điểm

42

Hình 12 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C và đoạn T 43 Hình 13 Kết quả lai điểm phân biệt đoạn C và đoạn T ở 650C 44 Hình 14 Kết quả lai điểm với các loại ADN khác nhau chứa đoạn C và

đoạn T

45

Hình 15 Kết quả lai đầu dò M với plasmid không mang đoạn chèn C và T 46 Hình 16 Kết quả lai điểm với plasmid pBluescript và cặp mồi M13 F/R 47 Hình 17 Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR đa mồi 49

Hình 19 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R 51 Hình 20 Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen khuếch đại bằng

cặp mồi CD F/R với ngân hàng dữ liệu NCBI

52

Hình 21 Kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin 54

Hình 22 Chuẩn hóa lƣợng đầu dò chấm lên màng trong kỹ thuật lai điểm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN 2

1.2 NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 3

1.3 ĐẦU DÒ 5

1.3.1 Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic 5

1.3.2 Các phương pháp đánh dấu đầu dò 6

1.3.3 Các chất đánh dấu đầu dò 9

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 13

1.4.1 Lai tại chỗ 13

1.4.2 Lai pha lỏng 15

1.4.3 Lai pha rắn 15

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN 18

1.6 ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC 20

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Các mồi 27

2.1.4 Các đầu dò oligo 28

2.1.5 Màng lai 29

2.1.6 Thiết bị 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Thiết kế đầu dò 29

2.2.2 Phương pháp PCR 30

2.2.3 Quá trình lai điểm 31

2.2.3.1 Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche) 31

2.2.3.2 Tiền lai và lai 32

2.2.3.3 Phát hiện đầu dò 33

2.2.4 Quá trình lai điểm ngược 34

2.2.4.1 Hoạt hóa màng nylon (Pall) 34

2.2.4.2 Cố định đầu dò trên màng nylon (Pall) 34

2.2.4.3 Tiền lai và lai 34

2.2.4.4 Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin 35

2.2.5 Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm 35

2.2.6 Tách plasmid 36

2.2.7 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro 37

2.2.8 Phương pháp điện di 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

A - KẾT QUẢ 39

3.1 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM 39

3.1.1 Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M 39

3.1.2 So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG 41

3.1.3 Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng 42

3.1.4 Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng 43

3.2 QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƯỢC 47

3.2.1 Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin 47

3.2.2 Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược 52

3.2.3 Kết quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin 54

B - THẢO LUẬN 57

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 72

MỞ ĐẦU

Ngày nay, chúng ta được sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh chóng Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri thức y học và sự phát triển vượt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng Điều này giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về

cơ sở phân tử của bệnh Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích Nền tảng về cơ sở học phân tử của bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngược lại Xu hướng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lượng mẫu phân tích lớn như: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen Đáng

chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát

triển của phương pháp lai ADN Đây là một kỹ thuật kinh điển nhưng vẫn được sử dụng khá phổ biến nhờ vào những ưu điểm vượt trội như thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lượng mẫu lớn

và đặc biệt phù hợp với các nước đang phát triển Ở nước ta hiện nay kỹ thuật lai

điểm đã được ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên

quan đến bệnh ung thư cổ tử cung Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chưa được công bố Do đó,

chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với

mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN

Dựa vào hình ảnh nhiễu xạ tia X (Franklin R., Gosling R., 1952) và thông tin bắt cặp các bazơ (Chargaff E., 1950), hai nhà khoa học Watson J và Crick F đã đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN (1953) Trước công bố này đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của ADN Đầu tiên phải kể đến công trình tách chiết ADN từ nhân tinh trùng cá hồi của Miescher F vào năm 1869 [1] Cùng thời điểm đó, Mendel G phát hiện ra quy luật phân ly và tổ hợp của các "nhân tố di truyền" thông qua thí nghiệm lai ở cây đậu Hà Lan Năm 1944, Avery O., MacLeod C và McCartey M cung cấp bằng chứng cho thấy ADN mang thông tin di truyền trong thí nghiệm biến nạp ở vi khuẩn [1] Đến nay, chúng ta đã biết rõ ADN là những phân tử axit nucleic được tìm thấy trong tế bào của phần lớn các loài sinh vật Thông tin có mặt trong ADN "chỉ dẫn" tế bào tổng hợp các loại protein quyết định các đặc điểm sinh học và có khả năng di truyền cho thế hệ sau "Chìa khóa" của tất cả các chức năng đó thể hiện trong cấu trúc của đại phân tử này

ADN là những phân tử trùng phân (polymer) được cấu tạo từ các đơn phân (monomer) deoxyribonucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần cơ bản: bazơ nitơ, đường pentose và nhóm phosphate Trong đó, bazơ nitơ là dẫn xuất của purine gồm adenine (A) và guanine (G), hoặc dẫn xuất của pirimidine gồm thymine (T), cytosine (C) Sự có mặt của nhóm phosphate làm cho các phân tử ADN thường tích điện âm và có tính axit [41] Bốn loại deoxyribonucleotide trong thành phần ADN khác nhau về loại bazơ nitơ (A, G, T, C), giống nhau về cấu trúc đường pentose và nhóm phosphate Vị trí các nguyên tử cacbon trên mạch vòng của đường pentose được đánh số từ 1' đến 5' Các nucleotide liên kết với nhau bởi cầu nối phosphodieste giữa nhóm hydroxyl ở vị trí 3' với nhóm phosphate ở vị trí 5' của hai phân tử đường [41]

Hình 1: (A) Mô hình chuỗi xoắn kép, (B) liên kết hydro và phosphodieste trong

phân tử ADN [77]

Trong phân tử ADN sợi đôi, hai mạch polynucleotide liên kết với nhau bởi liên kết hydro hình thành giữa các nucleotide đối diện trên hai mạch theo nguyên tắc bổ sung: giữa A và T có hai liên kết, giữa G và C có ba liên kết (Hình 1) [1] Liên kết hydro là liên kết hóa học yếu xảy ra giữa nguyên tử hydro và nguyên tử tích điện âm nhiều hơn như oxy, nitơ và flo Các nguyên tử tham gia có thể nằm trên cùng một phân tử hoặc trên các phân tử khác Liên kết hydro có tính định hướng, trở nên mạnh nhất khi hai nguyên tử tham gia ở vị trí đối diện trực tiếp với nhau Nếu góc liên kết vượt quá 300 thì lực liên kết yếu đi nhiều [1] Vì vậy, để có cấu trúc ADN sợi kép thì một mạch phải chạy theo chiều 5' → 3', còn mạch kia chạy theo chiều ngược lại là 3' → 5'

1.2 NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC

Phân tử ADN sợi kép có thể tách thành hai mạch đơn dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính như kiềm, urê hoặc nhiệt độ cao [68] Khi đó các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhưng không ảnh hưởng tới các liên kết phosphodieste của khung ADN Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện môi trường thích hợp, hai mạch đơn có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính ADN) (Hình

2) [4] Trong trường hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tương đồng, chúng có thể bắt cặp tạo nên phân tử lai Hiện tượng tái bắt cặp như trên được gọi là quá trình lai phân tử [7] Đến nay, nhiều kỹ thuật lai đã được phát triển nhằm phát hiện trình tự quan tâm nhờ tạo ra các phân tử axit nucleic có trình tự tương đồng với nó Mức độ tương đồng giữa hai trình tự thể hiện ở nhiệt độ cần thiết để gây biến tính 50% phân tử dạng sợi kép (nhiệt độ nóng chảy Tm - temperature melting) [71] Giá trị Tm của mỗi phân tử ADN phụ thuộc vào thành phần, tỷ lệ, vị trí sắp xếp của các cặp nucleotide Nếu có cùng số cặp bazơ, phân tử ADN có tỷ lệ

GC càng cao thì Tm càng lớn và ngược lại Ngoài ra, phân tử ADN có số đoạn trình

tự lặp lại càng nhiều thì nhiệt độ biến tính Tm càng giảm Nồng độ muối và sự có mặt của các chất gây biến tính như formamide cũng ảnh hưởng đến giá trị Tm Đối với hệ gen của động vật có vú (chứa khoảng 40% GC), ADN bị biến tính ở giá trị

Tm xấp xỉ 870C trong điều kiện sinh lý [58] Thông thường, phản ứng tạo nên phân

tử lai được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm 250C

Hình 2: Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép [41]

Hiê ̣n nay, kỹ thuật lai được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng

để phát hiện sự có mặt , xác định vị trí hoặc định lượng đoạn axit nucleic quan tâm [13, 43] Trình tự axit nucleic quan tâm được gọi là phân tử đích Đoạn ADN hoặc ARN có độ tương đồng cao với phân tử đích gọi là đầu dò Đầu dò được đánh dấu

để phát hiện kết quả lai giữa đầu dò và phân tử đích Trong trường hợp phân tử đích hoặc đầu dò ở dạng sợi kép, chúng phải được tách mạch tạo dạng sợi đơn trước khi tiến hành phản ứng lai Khi đó, ngoài sự bắt cặp giữa phân tử đích và đầu dò còn có

sự tái bắt cặp của các phân tử sợi đôi cùng nguồn gốc (Hình 3) Các bước cơ bản của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai Như vậy, một trong các bước đầu tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dò

Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58]

1.3 ĐẦU DÒ

1.3.1 Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic

Đầu dò là một phân tử axit nucleic có độ tương đồng cao với trình tự đích (ADN hoặc ARN) [5, 8] Các ADN dùng làm đầu dò phổ biến có nguồn gốc từ ADNc (complementary DNA), ADN tương đồng khác loài hoặc trình tự nucleotide suy diễn dựa vào trình tự axit amin đã biết [58, 65] Thông thường, trình tự ADN được nhân dòng trong tế bào chủ, từ đó sản xuất lượng lớn đầu dò [53, 65] Đầu dò

được chuẩn bị theo phương pháp như vậy gọi là đầu dò nhân dòng Sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã hỗ trợ đắc lực cho viê ̣c sản xuất đầu dò bởi

có thể đồng thời khuếch đa ̣i và đánh dấu nhờ sử du ̣ng nucleotide đánh dấu [31, 75]

Một phương pháp khác để sản xuất đầu dò ADN là tổng hợp hóa học (đầu

dò oligo) [7, 32] Mặc dù phương pháp này yêu cầu sự hiểu biết chi tiết về trình tự đích nhưng đầu dò thu được ở dạng sợi đơn, không tự bắt cặp bổ sung nên chúng được sử dụng nhiều hơn đầu dò nhân dòng [11, 37] Đầu dò oligo được thiết kế dựa vào các trình tự nằm trong gen hoặc những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của từng thí nghiệm và các thông tin đã có [51, 58] Mô ̣t đầu dò oligo có thể bắt că ̣p hoàn toàn với trình tự đích và đủ dài để ngăn chặn việc lai không đặc hiệu với những trình tự liên quan khác Đầu dò oligo có một số đặc điểm chung như sau:

 Chiều dài đầu dò trong khoảng 18 – 100 bp

 Tỷ lệ G C chiếm 40 - 60% Hiện tượng lai không đă ̣c hiê ̣u có thể tăng nếu tỷ

lê ̣ GC nhỏ hơn khoảng giá trị này

 Đảm bảo không có trình tự bổ sung trong đầu dò , vì nếu có chúng sẽ hình thành cấu trúc "kẹp tóc" ức chế phản ứng lai với trình tự đích

 Tránh trình tự lặp lại nhiều hơn 4 nucleotide

 Không sử du ̣ng đầu dò có đô ̣ tương đồng hơn 70% với vùng không phải trình

tự đích (để tránh hiện tượng lai không đặc hiệu)

1.3.2 Các phương pháp đánh dấu đầu dò

Các phương pháp đánh dấu bao gồm đánh dấu ADN sợi đơn, ADN sợi kép và ARN sợi đơn [7] Trong quá trình đánh dấu, các nucleotide đã gắn với các chất đánh dấu như biotin, digoxigenin hay fluorescein được sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các nucleotide bình thường khác Đối với đoạn ADN hoặc oligonucleotide, nucleotide đánh dấu thường dùng là dUTP, dCTP hoặc dATP; đầu dò ARN thường dùng UTP đánh dấu [34] Có hai phương pháp chính được sử dụng để đánh dấu đầu dò ADN:

(a) Đánh dấu đầu dò thông qua phản ứng tổng hợp ADN in vitro [58]: ADN

polymerase được dùng để tạo ra các bản sao ADN đánh dấu Trong phản ứng tổng

hợp ADN in vitro, ít nhất một trong bốn loại nucleotide phải mang nhóm chất đánh dấu Đánh dấu ADN bằng tổng hợp ADN in vitro thường thực hiện theo một trong

ba phương pháp: dịch chuyển điểm đứt (nick-translation), đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên và đánh dấu nhờ PCR

 Phương pháp dịch chuyển điểm đứt [7]: DNase I sẽ cắt phân tử ADN ở nhiều

vị trí tạo những điểm đứt phân bố một cách ngẫu nhiễu trên hai mạch Từ những điểm đứt này, ADN polymerase I một mặt cắt dần mạch bị đứt theo chiều 5'-3' (nhờ hoạt tính exonuclease 5'-3'), mặt khác tổng hợp bù đoạn bị thiếu (nhờ hoạt tính polymerase) Do trong phản ứng có sự hiện diện của một loại nucleotide đánh dấu nên đoạn tổng hợp mới sẽ có nucleotide đánh dấu Kết quả cuối cùng ADN được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử (Hình 4)

Hình 4: Đánh dấu đầu dò bằng phương pháp dịch chuyển điểm đứt [58]

 Phương pháp đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên [7]: Đầu dò được biến tính bằng nhiệt, sau đó thêm vào phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp (thường là hexa hoặc octanucleotide) Lúc đó, chúng trở thành mồi cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung Vì một trong bốn loại nucleotide thêm vào phản ứng được đánh dấu nên mạch mới tổng hợp sẽ có mặt nucleotide đánh dấu ADN polymerase thường được sử dụng là tiểu phần Klenow của ADN polymerase I hoặc T7 ADN polymerase (Hình 5)

Hình 5: Đánh dấu đầu dò bằng phương pháp dùng mồi ngẫu nhiên [58]

 Phương pháp đánh dấu nhờ PCR [58]: Phản ứng PCR được thay đổi theo một trong hai cách để thu được sản phẩm đánh dấu: (1) bổ sung một loại nucleotide đánh dấu trong quá trình tổng hợp đầu dò; (2) sử dụng mồi có gắn nhóm đánh dấu ở đầu 5' Trong đó cách thứ nhất cho tín hiệu tốt hơn vì chất đánh dấu có mặt dọc theo đầu dò Phương pháp đánh dấu PCR có lợi thế đặc biệt so với các phương pháp khác [40] Đầu dò được tạo ra một cách nhanh chóng với kích thước nằm trong phạm vi rộng; có thể thiết kế đầu dò từ bất

cứ vùng gen nào quan tâm; có thể tổng hợp chỉ với lượng rất nhỏ ADN đầu vào và chiều dài của đầu dò không ảnh hưởng tới độ nhạy và tính đặc hiệu của kỹ thuật lai [6, 31] Phương pháp này có thể áp dụng cho cả đầu dò sợi đơn (sử dụng một mồi) và sợi kép (sử dụng một cặp mồi) [6]

(b) Đánh dấu ở đầu tận cùng [58]: Trong hệ thống đánh dấu phóng xạ, enzyme polynucleotide kinase được sử dụng để chuyển nhóm phosphate từ ATP sang đầu 5' của các phân tử axit nucleic Nếu như ATP được đánh dấu phóng xạ thì

nó sẽ tạo ra axit nucleic được đánh dấu với hoạt tính đặc hiệu tương đối thấp, bởi vì chỉ có đầu tận cùng của mỗi phân tử được đánh dấu Oligonucleotide có thể được đánh dấu ở đầu 3' bằng phản ứng sử dụng enzyme terminal transferase [33] Enzyme này có hoạt tính thêm một loại deoxyribonucleotide vào đầu 3'-OH của ADN, kết quả tạo ra phân tử ADN có phần đuôi trùng hợp không lai với trình tự ADN đích Trong phản ứng đánh dấu ở đầu tận cùng, oligonucleotide đánh dấu chỉ được thêm vào phần đuôi; không có sự đánh dấu đầu dò ở vùng trình tự bên trong Việc gắn thêm các nucleotide đánh dấu làm tăng độ nhạy của phản ứng lai, nhưng làm giảm độ đặc hiệu vì trình tự được thêm vào không tương đồng với trình tự ADN đích

1.3.3 Các chất đánh dấu đầu dò

Một chất đánh dấu đầu dò lý tưởng phải thỏa mãn các yêu cầu sau [33]:

 Dễ gắn với axit nucleic bằng phương pháp đơn giản và có độ lặp lại cao;

 Bền trong điều kiện lai và bảo quản;

 Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai;

 Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong pha lỏng hoặc pha rắn;

 Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản;

 Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai;

 Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện;

 Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá

Chất đánh dấu đầu dò được chia thành hai nhóm lớn [33]:

(a) Chất đánh dấu phóng xa ̣: đồng vi ̣ phóng xa ̣ là những nguyên tố có hạt nhân không bền, dễ phân rã kèm theo bức xạ ra hạt alpha, hạt beta hoặc tia gamma Sự

bức xạ này có thể đo được bằng các thiết bị đo phóng xạ như máy đo nhấp nháy lỏng hay máy đếm Geiger-Muller Các nguyên tố đồng vị phóng xạ hay được dùng

để đánh dấu đầu dò là 32P, 33P, 35S, 3H, 14C, 125I [19] Ưu điểm nổi bật của đầu dò đánh dấu phóng xạ là có độ nhạy cao nhất, có thể phát hiện các gen đơn bản trong 0,5 µg ADN tổng số [55] Hiện nay chúng ít được s ử dụng bởi một số hạn chế như chu kỳ bán rã ngắn (chu kỳ bán rã của 32P là 14,3 ngày) do đó phải lặp lại bước đánh dấu đầu dò khi tiến hành thí nghiệm lai trong thời gian dài; nguy hiểm cho người sử dụng; yêu cầu nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc

xử lý chất thải [55, 58] Vì vậy sự phát triển của các chất đánh dấu không phóng xạ

là cần thiết để khắc phục các vấn đề trên, đồng thời cung cấp một kỹ thuật lai có thể

áp dụng cho xét nghiệm thường quy các bệnh ở người, động vật và thực vật [22, 66] Xuất phát từ thực tế trên mà các chất đánh dấu không phóng xạ ngày càng được quan tâm [23, 26]

(b) Chất đánh dấu không phóng xa ̣ : có một số ưu điểm so với chất đánh dấu phóng xạ như an toàn , đô ̣ bền cao , đánh dấu tốt , có thể phát hiê ̣n tại chỗ và phát hiện nhanh chóng [29, 55, 71] Cho đến nay, các chất đánh dấu không phóng xạ đã trở nên phổ biến và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Các chất đánh dấu không phóng xạ bao gồm hai loại:

Hệ thống đánh dấu không phóng xạ trực tiếp

Trong hệ thống này, chất đánh dấu đầu dò được phát hiện trực tiếp [58] Các chất đánh dấu trực tiếp phổ biến nhất là các enzyme như alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase, các chất huỳnh quang như fluorescein hay rhodamin Trong khi đầu dò gắn enzyme thường được sử dụng trong lai pha rắn hoặc pha lỏng thì đầu

dò gắn huỳnh quang được dùng chủ yếu trong lai tại chỗ và lập bản đồ nhiễm sắc thể [33] Enzym gắn vào đầu dò cho phép phân hủy cơ chất thành sản phẩm có màu

dễ dàng quan sát [26] Chất huỳnh quang gắn vào đầu dò có khả năng phát ra ánh sáng ở bước sóng nhất định khi bị kích thích bởi ánh sáng có bước sóng ngắn hơn Ánh sáng phát ra được phát hiện bằng máy quét laser hoặc kính hiển vi huỳnh

quang [58] Ba nhóm huỳnh quang phổ biến sử dụng trong đánh dấu axit nucleic là: huỳnh quang màu xanh lam (AMCA, DAPI), huỳnh quang màu xanh lục (FITC, fluorescein), huỳnh quang màu đỏ (CY3, TRITC, rhodamine, Texas red, CY5) [33] Các dẫn xuất este acridinium (Acridinium ester - AE) được sử dụng rộng rãi làm chất đánh dấu phát quang hóa học Phản ứng tạo ánh sáng có thể dễ dàng kích hoạt bằng cách bổ sung H2O2 [33] Thu nhận tín hiệu ánh sáng "flash" đòi hỏi thiết

bị phức tạp như các hệ thống miễn dịch thương mại Trong kỹ thuật lai HPA (hybridization protection assay), este acridinium liên kết với đầu dò thông qua một cầu nối không bền với kiềm Sự thủy phân liên kết này diễn ra ở đầu dò sợi đơn không bắt cặp với phân tử đích nhưng xảy ra rất yếu ở các phân tử lai [70, 78] Sự khác biệt này là do arcidinium chỉ xen vào bên trong các phân tử chuỗi kép làm bền các liên kết chống lại sự thủy phân bởi kiềm [33]

Hệ thống đánh dấu không phóng xạ gián tiếp

Trong hệ thống này, chất đánh dấu đầu dò (gọi là nhóm báo cáo) không được phát hiện trực tiếp mà phải thông qua liên kết với một nhóm phát tín hiệu (gọi là nhóm chỉ thị) Nhóm chỉ thị có ái lực liên kết cao với nhóm báo cáo (nhờ phần ái lực) [58] Sự phát hiện axit nucleic trong hệ thống gián tiếp bao gồm ba phản ứng: (i) đầu dò lai với phân tử đích; (ii) nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị; (iii) nhóm chỉ thị phát tín hiệu (nhờ liên kết với nhóm báo cáo) Nguyên lý chung của hệ thống đánh dấu không phóng xạ gián tiếp được miêu tả trên Hình 6

Hình 6: Nguyên lý chung của hệ thống đánh dấu không phóng xạ gián tiếp [58]

Trong số các hệ thống gián tiếp, phổ biến nhất là hệ thống biotin (vitamin H) [36, 55, 64] Trong đó, biotin đóng vai trò là nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị streptavidin alkaline phosphatase (phần ái lực là streptavidin - một protein có nguồn

gốc từ vi khuẩn Streptomyces avidinii) Tương tác giữa biotin và streptavidin là

tương tác sinh học không cộng hóa trị mạnh nhất được biết đến trong tự nhiên (hằng

số phân ly K d = 10-15) [16, 64] Đầu dò gắn biotin có thể được chuẩn bị dễ dàng với nucleotide đánh dấu biotin như biotin-11-dUTP hoặc biotin-16-dUTP (Hình 7) [19] Bên cạnh biotin, digoxigenin (DIG) cũng là hê ̣ thống tiê ̣n lợi và hiê ̣u quả trong viê ̣c đánh dấu và phát hiê ̣n ADN và ARN [39] Kháng thể anti-digoxigenin (phần ái lực) liên kết với alkaline phosphatase (nhóm chỉ thị) được gắn với đầu dò DIG Tín hiệu màu được phát hiện nhờ cơ chất của alkaline phosphatase là BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) và NBT (nitro-blue tetrazolium) [75] Hỗn hợp cơ chất này tạo ra sản phẩm cuối cùng không tan là NBT diformazan có màu xanh tím, quan sát được bằng mắt thường

Hình 7: (A) Cấu trúc phân tử digoxigenin-11-dUTP và (B) biotin-16-dUTP [58]

Nhƣ vậy, tuy phụ thuộc vào nhiều cặp liên kết hơn so với hệ thống trực tiếp, nhƣng thành phần phát hiện trong hệ thống gián tiếp lại phổ biến, tức là chúng có thể đƣợc sử dụng để phát hiện axit nucleic, protein cũng nhƣ kháng nguyên và glycan [55] Do đó, hệ thống gián tiếp linh hoạt hơn trong phát hiện phân tử sinh học nói chung Vì lý do này, các hệ thống gián tiếp không chỉ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu cơ bản mà còn đƣợc dùng trong nhiều lĩnh vực ứng dụng để phát hiện các phân tử đích khác nhau, phổ biến là axit nucleic và protein [60, 61, 64]

1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC

1.4.1 Lai tại chỗ

Lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH) là kỹ thuật nhằm định vị trình tự axit

nucleic quan tâm mà không cần tách chiết ra khỏi mô hay tế bào , cung cấp thông tin

về không gian và thời gian gen biểu hiện và locus gen [10, 50] Quá trình tiến hành lai tại chỗ trải qua các bước tương tự như các kỹ thuật lai khác: tổng hợp, đánh dấu đầu dò và lai với trình tự đích

Khi mới được đề xuất vào năm 1969, kỹ thuật lai tại chỗ sử dụng đầu dò phóng xạ [21] Do tính không an toàn và phức tạp, cùng với sự phát triển của các chất đánh dấu không phóng xạ, hiện nay có hai phương pháp chủ yếu để quan sát

ARN và ADN tại chỗ là sử dụng đầu dò phát hiện huỳnh quang (Fluorescence in

situ hybridization - FISH) và đầu dò phát hiện màu (Chromogenic in situ

hybridization - CISH) [76] Mỗi phương pháp có những đặc điểm phù hợp với từng mục đích sử dụng khác nhau Lai FISH có khả năng phân tích nhiều mục tiêu đồng thời, quan sát và định vị trong cùng một mẫu vật [20, 79] Sử dụng huỳnh quang đánh dấu riêng biệt với mỗi đầu dò lai, phương pháp này cho phép phân tích nhiều yếu tố di truyền hoặc mô hình biểu hiện đa gen trong một mẫu duy nhất với nhiều màu hiển thị [63] Lai FISH có thể tiến hành với lượng mẫu nhỏ, mẫu cố định bằng formalin hoặc parafin Kỹ thuật lai này cung cấp thông tin nhanh chóng và tin cậy

để đánh giá các bất ổn di truyền phát sinh trong ung thư hoặc phát hiện vi sinh vật trong nhiều loại mẫu khác nhau [20] Tuy nhiên, việc quan sát kết quả lai đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh quang Hơn nữa, tín hiệu huỳnh quang bị mất đi nhanh chóng gây khó khăn cho việc lưu trữ kết quả Kỹ thuật lai CISH được đánh giá là giải pháp hiệu quả với chi phí hợp lý thay thế cho lai FISH trong xét nghiệm biến đổi gen, đặc biệt là tại các trung tâm chủ yếu làm việc với hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) Phương pháp này có thể dùng để đánh giá sự khuếch đại gen, mất gen, chuyển đoạn nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể [79] CISH sử dụng phản ứng peroxidase hoặc alkaline phosphatase được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng thường và có thể áp dụng với mẫu cố định bằng fomalin, mẫu mô đúc parafin, máu hoặc mẫu phết tủy xương, tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa và các tế bào cố định [44] Kỹ thuật CISH dùng trong đánh giá trạng thái gen đồng thời với hình thái mô, sử dụng kính hiển vi ánh sáng thường và kỹ thuật tương

tự IHC, kết quả có thể lưu trữ và định lượng

1.4.2 Lai pha lỏng

Trong kỹ thuật lai pha lỏng, cả phân tử đích và đầu dò đặc hiệu đều tồn tại

"tự do" trong dung dịch, tăng tối đa cơ hội cho chúng bắt gặp và liên kết với nhau Thông thường, mẫu được ủ ở nhiệt độ cao (720C) trong bể ổn nhiệt và bổ sung hạt thủy tinh để phá vỡ tế bào, từ đó giải phóng axit nucleic Một cách khác để tách axit nucleic ra khỏi tế bào hoặc nhân là sử dụng guanidine thiocyanate Hợp chất này có tác dụng biến tính protein hiệu quả hơn urê, guanidine chloride, phenol:chloroform, ethanol hay dioxane [65] Nếu axit nucleic quan tâm là ADN thì chúng sẽ bị biến tính thành dạng sợi đơn Sau đó bổ sung đầu dò đặc hiệu, duy trì điều kiện đệm và nhiệt độ thích hợp để hình thành phản ứng lai Phân tử lai tạo thành được tách khỏi dung dịch nhờ hydroxyapatite, hợp chất chỉ liên kết với axit nucleic sợi kép mà không liên kết với axit nucleic sợi đơn Phân tử sợi kép được loại bỏ khỏi hydroxyapatite bằng cách gia nhiệt hoặc tăng nồng độ muối Trong một số quy trình, sợi kép gắn hydroxyapatite được thu bằng ly tâm, rửa cặn và định lượng bằng máy đo nhấp nhảy lỏng hoặc máy đo quang phổ Trước đây, kỹ thuật lai pha lỏng thường sử dụng đầu dò ADN gắn với hạt vi từ, thực hiện phản ứng lai trong dung dịch và tách riêng phân tử lai khỏi dung dịch bằng nam châm Nếu đầu dò được đánh dấu biotin, phân tử lai được phân tách nhờ bổ sung hạt từ gắn streptavidin [65]

1.4.3 Lai pha rắn

Trong kỹ thuật lai axit nucleic, phân tử đích (ADN hoặc ARN) có thể được

cố định trên pha rắn còn đầu dò tồn tại tự do trong dung dịch [60] Thông thường pha rắn là màng nitrocellulose hoặc màng nylon [55] Một số kỹ thuật lai trên pha rắn thường dùng bao gồm: Southern blot, northern blot, dot blot và reverse dot blot

Kỹ thuật lai Southern blot phát minh bởi Edward Southern (1975) nhằm phân biệt một đoạn ADN cụ thể có mặt trong hỗn hợp ADN Trong kỹ thuật này, trình tự ADN đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn được phân tách trên gel agarose Sau đó, gel điện di được xử lý với dung dịch kiềm (phá vỡ

liên kết hydro) để biến tính phân tử ADN sợi kép thành dạng sợi đơn Đối với những đoạn ADN lớn hơn 15 kb, gel có thể được ủ với dung dịch HCl để phân cắt

liên kết β-N-glycosidic giữa các bazơ purin (adenine hoặc guanine) và đường trong

cùng nucleotide (hiện tượng depurine hóa), tạo ra các đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn [55] Sau bước xử lý gel, ADN sợi đơn được chuyển lên màng bằng cách thẩm thấu mao dẫn hoặc máy hút chân không [4] Tiếp theo, ADN được cố định trên màng bằng cách ủ ở 800C trong 2 giờ hoặc chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bước tiền lai sẽ "khóa" các vị trí không có ADN ở trên màng để ngăn chặn đầu dò bám không đặc hiệu lên bề mặt màng Sau đó, màng được ủ trong dung dịch chứa đầu dò đặc hiệu Việc phát hiện vị trí của đoạn ADN tham gia vào phản ứng lai phụ thuộc vào chất đánh dấu đầu dò Lai Southern blot được áp dụng để đánh giá số lượng bản sao của một gen trong hệ gen, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn ADN, sự có mặt của đoạn ADN lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong

họ gen, xác định các intron, exon của một gen, xác định tính đa hình độ dài các đoạn cắt bởi enzyme giới hạn [4]

Kỹ thuật northern blot là một cải biến của Southern blot trong đó phân tử axit nucleic đích là ARN thay vì ADN Ứng dụng chủ yếu của kỹ thuật này là nghiên cứu biểu hiện của gen ARN hoặc ADNc đã được nhân dòng có thể sử dụng làm đầu dò trong lai northern blot ARN tách chiết từ nhiều loại mô khác nhau được chuyển lên màng và lai với đầu dò đặc hiệu Kích thước cũng như số lượng ARN lai với đầu dò được phát hiện dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của băng lai Kết quả thu được cung cấp dữ liệu về các loại tế bào có gen biểu hiện và sự phong phú của những bản sao phiên mã [55, 58]

Kỹ thuật lai điểm dot blot được Kafatos và cs mô tả năm 1979 [32] Trong

kỹ thuật này, mẫu ADN đích được chấm trên màng cellulose hoặc màng nylon và

để khô Trình tự ADN đích bị biến tính bằng nhiệt độ hoặc kiềm và được tiếp xúc với đầu dò đã đánh dấu Sau một khoảng thời gian lai nhất định đủ để hình thành sợi kép dị hợp giữa đầu dò và trình tự đích, rửa màng để loại bỏ đầu dò dư thừa, để khô

màng và thu tín hiệu Một ứng dụng hữu ích của lai điểm là khả năng phân biệt các alen thậm chí chỉ khác nhau một nucleotide Các đầu dò oligonucleotide đặc hiệu alen ASO (allele-specific oligonucleotide) được thiết kế dựa vào vị trí nucleotide biến đổi [12, 23] Kỹ thuật này cho phép sàng lọc một cách tiết kiệm và nhanh chóng các biến đổi nucleotide ở mức độ alen trên số lượng mẫu lớn [15, 25, 76]

Trong trường hợp đầu dò được cố định trên màng thay vì các mẫu ADN, kỹ thuật lai điểm được gọi là lai điểm ngược (reverse dot blot) [11] Nếu như kỹ thuật lai điểm dùng để xác định một trình tự nhất định trong nhiều mẫu thì kỹ thuật lai điểm ngược được sử dụng để phát hiện đồng thời nhiều trình tự quan tâm trong một mẫu Đối với lai điểm, trình tự ADN quan tâm được cố định trên màng, sau đó lai với đầu dò đánh dấu Trong lai điểm ngược, đầu dò không đánh dấu được cố định lên màng và lai với ADN được đánh dấu, thường là sản phẩm PCR đánh dấu Lai điểm ngược cho phép phát hiện trực tiếp các đột biến điểm, mất đoạn hay thêm đoạn [30] Ngoài ưu điểm nhanh chóng, chính xác, tin cậy, kỹ thuật này còn có khả năng sàng lọc đồng thời nhiều đột biến Với mỗi đột biến, việc thiết kế một cặp đầu

dò (gồm đầu dò chứa vị trí đột biến và đầu dò không đột biến) còn giúp phân biệt đột biến là đồng hợp hay dị hợp Tuy nhiên, các đầu dò oligo có kích thước ngắn thường không thể cố định trên màng bằng các phương pháp truyền thống Việc gắn thêm một trình tự poly(dT) ở đầu 3' của đầu dò giúp chúng bám được trên màng nhờ chiếu tia cực tím [54] Hiện nay, đầu dò sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngược thường được gắn nhóm amin bậc một vào đầu 5' Các đầu dò này có thể dễ dàng cố định trên màng nylon Biodyne C đã hoạt hóa [76] Màng nylon gắn nhiều đầu dò oligonucleotide có thể chuẩn bị trước với số lượng lớn và bảo quản được ở nhiệt độ phòng trong nhiều tháng Một yêu cầu quan trọng cho hệ thống phát hiện đột biến bằng kỹ thuật lai điểm ngược là điều kiện lai và điều kiện rửa đối với tất cả các đầu

dò trên màng phải giống nhau Kỹ thuật này được Saiki và cs mô tả lần đầu tiên vào năm 1989, sau đó được phát triển để phục vụ chẩn đoán các bệnh di truyền mang nhiều đột biến như bệnh thiếu máu huyết tán (thalassemia) và bệnh xơ nang (cystic fibrosis) [10, 35, 46]

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN

Nhiều phương pháp được sử dụng để lai ADN hoặc ARN trên màng cellulose hoặc màng nylon Đặc điểm của màng dùng trong kỹ thuật lai ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả thu được Màng nitrocellulose cho khả năng gắn axit nucleic kém (50-100 µg/cm2) và chỉ giữ được ADN hay ARN có kích thước trên 400 bazơ [55] ADN và ARN gắn trên màng nitrocellulose bởi tương tác kỵ nước, vì vậy tốc

độ lai và rửa rất chậm ở nhiệt độ cao Điều kiện cố định axit nucleic ở 800C khiến màng trở nên giòn [55] Khi độ ẩm cao, màng sẽ hấp thụ, nở ra, cong và xuất hiện nhiều nếp nhăn [28] Sự ra đời của màng nylon đã khắc phục các vấn đề trên Nghiên cứu của Twomey và cs so sánh chín loại màng nylon và màng cellulose sử dụng bốn phương pháp gắn axit nucleic đích khác nhau [66] Kết quả chỉ ra rằng màng nylon có độ nhạy cao hơn và có thể tăng độ nhạy bằng cách biến tính trình tự đích (bằng UV hoặc ủ ở nhiệt độ cao) trước khi gắn lên màng [66] Với ưu điểm như vậy, hiện nay màng nylon đã được phát triển thành nhiều loại với các đặc tính riêng như màng tích điện dương liên kết chủ yếu bằng tương tác ion (và cộng hóa trị sau khi chiếu UV) hay màng không tích điện liên kết bằng tương tác tĩnh điện (và cộng hóa trị sau khi chiếu UV) với kích thước lỗ màng cho phép gắn tối đa giữa trình tự đích với đầu dò, đồng thời loại bỏ đầu dò không lai để ngăn chặn nhiễu nền (Bảng 1) [80] Màng Biodyne C được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật lai điểm ngược [82] Sau khi hoạt hóa bằng dung dịch EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), màng sẽ "bộc lộ" các nhóm carboxyl, từ đó ưu tiên gắn các oligo có nhóm amin ở đầu 5' lên màng [11, 76]

Các kỹ thuật lai trên màng như Southern blot, northern blot, dot blot hay reverse dot blot đều trải qua các bước tương tự nhau, bao gồm: biến tính các phân tử sợi kép, tiền lai, lai, rửa và phát hiện kết quả lai Nếu trình tự đích và đầu dò ở dạng sợi kép thì chúng phải được tách mạch tạo dạng sợi đơn Nhiệt độ cao thường được

sử dụng để bẻ gãy các liên kết hydro giữa hai mạch Năng lượng để phá vỡ các liên kết này phụ thuộc vào một số yếu tố chính là chiều dài đoạn ADN, thành phần GC

và thành phần đệm Đoạn ADN càng dài và tỷ lệ GC càng lớn thì nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao Những điểm bắt cặp sai (ví dụ như A bắt cặp với C, G bắt cặp với T ) cũng làm giảm tính ổn định của một phân tử lai [70] Thông thường người

ta ước lượng Tm giảm 10C cho 1% bắt cặp sai [58] Tuy nhiên, các bắt cặp sai chỉ có

ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn ADN ngắn Ngoài ra, lực ion (nồng độ muối) và sự có mặt của formamide trong đệm lai cũng ảnh hưởng tới giá trị Tm [7, 14, 50]

Bảng 1: Đặc điểm của một số loại màng dùng trong kỹ thuật lai axit nucleic [55]

; màng khô: 160 kJ/m2)

Sản phẩm

thương mại

Hybond-H Gene-Screen

Hybond-N+ Zeta-Probe Nytran+

Gene-Screen Plus Sau khi biến tính phân tử sợi kép, màng sẽ được tiền lai với dung dịch đệm lai không chứa đầu dò Các vị trí trên màng không có ADN sẽ bị bão hòa đối với các loại ADN và phân tử trùng phân có trong đệm tiền lai Đệm tiền lai được thay thế bằng đệm lai chứa đầu dò và ủ ở nhiệt độ thích hợp để quá trình lai giữa đầu dò

đã đánh dấu với phân tử axit nucleic diễn ra Nhiệt độ lai tối ưu được xác định bằng thực nghiệm, thường bắt đầu khảo sát ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm 250

C [58] Sau đó,

đầu dò dư thừa được loại bỏ thông qua các bước rửa Điều kiện rửa ít nghiêm ngặt (nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp) giúp tăng độ nhạy, tuy nhiên tín hiệu có thể không đặc hiệu và nhiễu nền cao Điều kiện rửa rất nghiêm ngặt (nồng độ muối thấp

và nhiệt độ cao, gần với nhiệt độ lai) có thể loại bỏ nhiễu nền và chỉ có những tín hiệu đặc hiệu được giữ lại [7]

1.6 ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC

Cho đến nay, đầu dò axit nucleic nói chung và đầu dò ADN nói riêng đã được cải biến để không chỉ phù hợp trong nghiên cứu mà còn thuận lợi trong ứng dụng thực tế [47] Thứ nhất, nguồn tổng hợp đầu dò chuyển từ nhân dòng và cADN sang oligonucleotide sợi đơn và ARN Thứ hai là sự phát triển của các kỹ thuật đánh dấu phóng xạ và không phóng xạ Thứ ba phải kể đến sự ra đời của kỹ thuật khuếch đại axit nucleic cho phép phát hiện lượng axit nucleic dưới attomol, điều mà các kỹ thuật lai truyền thống không thể thực hiện được Thứ tư, sự cải tiến của các

hệ thống tín hiệu cũng góp phần tăng độ nhạy phát hiện [47] Thứ năm, các phương pháp xử lý mẫu được cải tiến để rút ngắn thời gian thao tác Cuối cùng, việc sản xuất đầu dò phân tử một cách tự động thúc đẩy việc đưa chúng trở thành xét nghiệm thường quy trong các phòng thí nghiệm cận lâm sàng [12]

Lai tại chỗ CISH thể hiện rõ ưu thế của mình trong nghiên cứu gen

HER-2/neu, một yếu tố tiên lượng quan trọng của bệnh ung thư vú [22] HER-2/neu là thụ

thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì Khoảng 20-30% các trường hợp ung thư vú có biểu hiện quá mức thụ thể này trên bề mặt tế bào [46] Hiện nay, nhiều kỹ thuật đã

được sử dụng để đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER-2/neu Phương pháp hóa

mô miễn dịch IHC tiện lợi, tiết kiệm, dễ dàng bảo quản mẫu sau khi phân tích và chỉ cần sử dụng kính hiển vi thông thường khi quan sát Tuy nhiên, bất lợi của phương pháp này là kết quả phụ thuộc vào một số yếu tố như điều kiện bảo quản trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể dùng để nhuộm (đơn dòng hay đa dòng), và quan trọng hơn cả đó là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để

có kết luận chính xác [44] FISH là một phương pháp xét nghiệm chính xác với độ

nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sự khuếch đại bất thường của gen HER-2/neu

nhưng đòi hỏi giá thành cao, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và đôi khi khó xác định trong những trường hợp u bướu xâm lấn [44] CISH được coi là một chọn lựa thay thế với ưu điểm của cả hai phương pháp IHC và FISH Với kỹ thuật

này, gen HER-2/neu được phát hiện bằng phản ứng peroxidase quan sát dưới kính

hiển vi ánh sáng thường trong khi chi phí chỉ bằng 1/4 của FISH [22] Hiện nay, kết

quả FISH hoặc CISH phát hiện sự khuếch đại bất thường của gen HER-2/neu được

cơ quan kiểm định thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) xác nhận là tiêu chuẩn chẩn đoán vàng đối với ung thư vú [24]

Trong công nghệ thực phẩm, lai FISH cũng được ứng dụng để phát hiện các

vi khuẩn lactic trong môi trường sữa cho sản xuất pho mát và định lượng vi khuẩn ruột kết trong thực phẩm lên men [8, 34] Hơn nữa, FISH còn là phương pháp thuận lợi để phát hiện sự sinh trưởng độc lập của các vi sinh vật trong nhiều loại mẫu khác

nhau [5] Lactobacillus là một trong những vi khuẩn có lợi, chiếm ưu thế trong cơ

thể con người và được sử dụng như một "tá dược vi sinh vật" ở các nước phát triển [46] Việc xác định các vi khuẩn probiotic thông thường được thực hiện nhờ kỹ thuật nuôi cấy Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều thời gian và có thể cho kết

quả không chính xác, đặc biệt khi có mặt Lactobacillus trong hỗn hợp vi khuẩn Nghiên cứu của Machado và cs nhằm xác định chính xác Lactobacillus spp nhờ

thiết kế đầu dò dùng trong kỹ thuật lai FISH [43] Đầu dò Lac663 đã được thử

nghiệm trên 36 chủng khác nhau thuộc loài Lactobacillus và 20 chủng của các loài

vi khuẩn khác Phương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 95% [43] Thêm vào

đó, nhóm nghiên cứu còn thử nghiệm trên các mẫu sữa có bổ sung các chủng

Lactobacillus theo một dải nồng độ và các vi khuẩn liên quan khác cũng như các vi

khuẩn gây bệnh Kết quả cho thấy đầu dò Lac663 gắn đặc hiệu với các chủng

Lactobacillus và kỹ thuật FISH có thể định lượng trực tiếp Lactobacillus ssp ở

nồng độ có lợi cho sức khỏe con người [43]

Đầu dò ADN còn được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật lai để phát hiện

vi sinh vâ ̣t gây hại, phát hiện các trình tự lặp lại và phát hiê ̣n sự thay đổi axit nucleic [5, 46] Đầu dò có thể được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật không thể nuôi cấy

và các mầm bệnh trong môi trường hoặc chỉ đơn giản là xác định nhanh chóng các loài và dưới loài [5] Trong nghiên cứ u để phát hiê ̣n rotavirus , Fernandez và cs đã thiết kế đầu dò là mô ̣t trình tự dài 40 nucleotide tương đồng với nucleotide 33 - 72 của gen mã hóa cho glycoprotein VP 7 của rotavirus chủng NCDV [18] Đây là đoa ̣n trình tự bảo thủ cao ở tất cả các chủng rotavirus tại thời điểm nghiên cứu Tính đặc hiệu của đầu dò thể hiện ở chỗ không lai với adenovirus, virus hơ ̣p bào hô hấp (respiratory syncytia virus ) hay các virus có hê ̣ gen ARN khác như reo hoặc pararotavirus Đầu dò này được sử dụng trong kỹ thuâ ̣t lai điểm với ARN hê ̣ gen rotavirus tách chiết từ 303 mẫu phân trẻ em bi ̣ tiêu chảy cấp Kết quả cho thấy kỹ thuâ ̣t lai có đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao hơn kỹ thuâ ̣t điê ̣n di PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) kết hợp với nhuộm ba ̣c : độ nhạy trong lai điểm (200 pg) cao hơn nhiều so với đô ̣ nha ̣y khi điê ̣n di và nhuô ̣m ba ̣c (20ng); 24 mẫu cho kết quả âm tính khi điện di nhưng cho kết quả dương tính khi lai với đầu dò Không những thế, sử du ̣ng đầu dò này còn giúp loa ̣i bỏ các trường hợp dương tính giả khi phát hiê ̣n rotavirus thông qua kháng nguyên bề mă ̣t virus [18] Với những ưu điểm đó , chẩn đoán bằng kỹ thuâ ̣t lai sử dụng đầu dò không phóng xạ có tiềm năng trở thành xét nghiê ̣m thường quy ta ̣i các bê ̣nh viê ̣n [18]

Các trình tự lặp lại thường có chiều dài 30-50bp Kích thước và sự phân bố của chúng khác nhau ở mỗi cá thể Chúng có thể được phát hiện nhờ sử dụng đầu

dò axit nucleic và PCR Phương pháp "dấu vân tay ADN" (ADN fingerprinting) dùng trong khoa học hình sự để xác nhận danh tính của một nghi phạm từ mẫu vật (dịch cơ thể, da và tóc) để lại tại hiện trường vụ án [67] Phương pháp này cũng có thể được sử dụng cho các xét nghiệm quan hệ cha con, xác nhận anh, chị, em ruột

và phân loại mô Nghiên cứu 21 trường hợp, Moliaka và cs cho thấy , đầu dò đa locus (Red4) và hai đầu dò đơn locus (YNH24, CMM101) phát hiện tính đa hình

cao (96%) ở hai locus D 2S44 và D14S13 [49] Sự kết hơ ̣p của hai loa ̣i đầu dò này cho phép xét nghiệm quan hệ cha con trong pháp y và y tế [49]

Sự thay đổi trình tự ADN là những đột biến mất , thêm hoặc thay thế nucleotide Sự thay đổi trong trình tự gen cu ̣ thể có thể gây bê ̣nh di truyền như xơ nang, loạn dưỡng cơ, phenyl keto niệu, biến đổi apolipoprotein, thiếu máu huyết tán đều có thể chẩn đoán bởi sự phát hiện đầu dò [17, 61, 68, 74] Kỹ thuật lai axit nucleic rất thành công trong viê ̣c phát hiê ̣n nhiều đô ̣t biến [37, 48] Với mô ̣t số bê ̣nh

di truyền có thể có nhiều đô ̣t biến gây bê ̣nh , trong trường hợp này, đầu dò có thể dùng ở điều kiện lai ít nghiêm ngặt hoặc dùng một số đầu dò để đảm bảo lai với tất

cả các trình tự đích Thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến gây ra

bởi các biến đổi về trình tự gen α-globin hoặc β-globin [48] Trong nghiên cứu vào

năm 2012, Lin và cs đã thiết lập phương pháp lai điểm ngược nhằm phát hiện 5 đột biến gây bệnh α-thalassemia và 16 đột biến gây bệnh β-thalassemia [38] Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật giải trình tự và gap-PCR (sử dụng kit thương mại) Hơn nữa, phương pháp này có thể sử dụng trong phân tích nhiều loại mẫu khác nhau như máu, dịch màng ối, lông nhung màng đệm và máu cuống rốn [38] Đầu năm 2013, một quy trình lai điểm ngược cho phép phát hiện 11 đột biến gây bệnh thiếu hụt men G6PD được công bố bởi Lu và cs [42] Áp dụng trên 213 mẫu bệnh phẩm và so sánh với kết quả giải trình tự trực tiếp, quy trình thu được mức độ phát hiện đạt 95,8% Như vậy lai điểm ngược reverse dot blot đã cung cấp một phương pháp sàng sàng lọc di truyền hiệu quả, năng suất cao, tiến hành dễ dàng

và đảm bảo độ tin cậy [11, 19, 42]

Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật lai điểm ngược, một số hãng thương mại đã sản xuất các bộ kit phục vụ chẩn đoán thường quy Điển hình như kit phát hiện

virus viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV) INNO-LiPA HBV Genotyping assay

(Innogenetics N V., Ghent, Bỉ) có độ nhạy 99,3% và độ đặc hiệu 100% [51, 52]

Như vậy, kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngược đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi, cho thấy ưu điểm vượt trội trong phát hiện sự khác biệt về trình tự

axit nucleic so với các phương pháp khác Tại Việt Nam, kỹ thuật lai điểm ngược đã

được ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến

bệnh ung thư cổ tử cung [3] Đây là loại ung thư thường gặp ở phụ nữ, đứng hàng thứ hai sau ung thư vú tại Hà Nội và đứng đầu tại Thành phố Hồ Chí Minh [2] Bộ

kit LightPower iVAHPV Genotype RDB do Công ty cổ phần công nghệ Việt Á sản

xuất có thể xác định sự đồng nhiễm của 8 type HPV nguy cơ thấp và 16 type HPV nguy cơ cao [84] Tuy nhiên, đây là bộ kit duy nhất dựa trên kỹ thuật lai điểm ngược được sử dụng ở nước ta

Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến trên

thế giới, do đột biến trên gen globin gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi

β-globin Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang đột biến gây bệnh β-thalassemia là 1,5-25%

[62] Cho đến nay, khoảng hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen β-globin

[48] Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc Ở nước ta hiện nay, các xét nghiệm cận lâm sàng hỗ trợ chẩn đoán bệnh β-thalassemia tại các bệnh viện chủ yếu là tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, điện di huyết sắc tố và PCR với cặp mồi đặc hiệu Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phát hiện được một hoặc một số đột biến đồng thời và người thực hiện phải tiếp xúc với

hóa chất độc hại như ethidium bromide Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Thiết

kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai điểm dot blot" với mục đích: (1) thiết lập được

quy trình lai điểm để phân biệt hai trình tự tương đồng chỉ sai khác nhau tại một số

vị trí nucleotide; (2) thiết kế đầu dò và chuẩn hóa được điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngược phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối với kỹ thuật lai điểm dot blot: hai đoạn ADN đích (kí hiệu là đoạn C và đoạn T) có cùng kích thước 150 bp đã được tách dòng trong hai plasmid: plasmid pGEM-C mang đoạn chèn C và plasmid pTZ57-T mang đoạn chèn T Hai đoạn chèn này chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp Đoạn ADN làm đầu

dò (kí hiệu đoạn M) đã được tách dòng trong plasmid pTZ57-M Đoạn M có kích thước 225 bp gồm đoạn 75 bp lặp lại ba lần trong đó 75 bp này là trình tự có mặt trong đoạn C Tính tương đồng của các đoạn C, T và M được trình bày trên Hình 8

Hình 8: Tính tương đồng của các đoạn C, T và M Ký hiệu ● thể hiện vị trí sai

khác giữa trình tự C và trình tự T

- Đối với kỹ thuật lai điểm ngược reverse dot blot: sử dụng 30 mẫu máu của người bệnh thalassemia (ký hiệu từ T1 đến T30) được cung cấp bởi Viện Huyết học

và Truyền máu Trung ương trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2012

2.1.2 Hóa chất

- dNTPs (Promega);

- MgCl2 (Promega);

- Đệm Taq polymerase 10x (chứa 15mM Mg2+) (Sigma-Aldrich);

- JumpStart Taq ADN polymerase (Sigma-Aldrich);

- Đệm Colorless GoTaq Flexi 5x (Promega);

- GoTaq Flexi ADN polymerase (Promega);

- Biotin-11-dUTP (Fermentas);

- Streptavidin Alkaline phosphatase (Promega);

- DIG-11-dUTP (Roche);

- Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (Roche);

- Blocking reagent (Roche);

- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich);

- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega);

- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega);

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR High pure PCR cleanup micro (Roche);

- Các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngược được trình bày trong Bảng 2;

- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Bảng 2: Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngƣợc

B2 Tris-HCl 0,5M pH 7,6; NaCl 1,5M H1 SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%

U5 Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M SSC 1x NaCl 0,15M; Natri citrat 0,15M pH 7

Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%;

Bovine serum albumin 0,02%

Đệm maleic 1x Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5

Blocking 1x Blocking reagent 1% (w/v) (pha trong đệm maleic 1x)

2.1.3 Các mồi

Cặp mồi CT F/R khuếch đại đoạn C và T từ plasmid pGEM-C và pTZ57-T Cặp mồi M13 F/R khuếch đại đoạn M từ vector pTZ57-M (Hình 8) Cặp mồi CD

F/R thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin công bố trong ngân hàng dữ liệu gen

[81] Các mồi 17 MR, 26 MR, 41-42 MR dùng trong phản ứng PCR đa mồi để phát

hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin Các mồi trên đƣợc

cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ) Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 3

Bảng 3: Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu và kích thước sản phẩm PCR tương ứng

Bảng 4: Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngược

(nucleotide gạch chân tương ứng với đột biến)

Tên đầu dò oligo Trình tự (5' - 3')

2.1.5 Màng lai

- Màng nylon tích điện dương (Nylon membrane, positively charged - Roche);

- Màng nylon Biodyne C 0.45µm (Pall)

2.1.6 Thiết bị

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh

Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế đầu dò

Trong thí nghiệm lai điểm, đoạn M (mang trình tự lõi của đoạn C) được sử dụng làm đầu dò với mong muốn phân biệt sự khác biệt giữa trình tự C và trình tự T (Hình 8)

Đối với thí nghiệm lai điểm ngược, chúng tôi thiết kế ba cặp đầu dò oligo để

phát hiện đồng thời ba đột biến điểm trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia: đột

biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT] Mỗi cặp đầu dò

gồm một đầu dò bình thường (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của người bình thường) và một đầu dò đột biến (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của người

bệnh β-thalassemia) Vị trí các đầu dò và cặp mồi CD F/R được trình bày trên Hình 9

Hình 9: Vị trí các đầu dò oligo và cặp mồi CD F/R trên gen β-globin [81] Trình tự ADN

gạch chân là vị trí của cặp mồi CD F/R Trình tự màu xanh tương ứng với vị trí oligo CD17 N/M (chứa Cd 17 [A → T]); Trình tự màu vàng tương ứng với vị trí oligo CD26 N/M (chứa Cd 26 [G → A]); Trình tự màu xám tương ứng với vị trí oligo CD41 N/M (chứa Cd 41-42 [-TCTT]); Các nucleotide màu đỏ là vị trí xảy ra đột biến

2.2.2 Phương pháp PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR được sử dụng để khuếch đại một hay nhiều đoạn ADN Thành phần chính của phản ứng gồm có khuôn ADN, mồi, Taq ADN polymerase và dNTP Phản ứng này gồm có ba giai đoạn chính:

 Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (940

- 950C) để tách hai mạch của chuỗi ADN xoắn kép

 Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống để các mồi gắn bổ

sung với sợi ADN khuôn Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần nucleotide và chiều dài của mồi được sử dụng trong nghiên cứu

 Giai đoạn kéo dài: Sử dụng một mạch ADN làm khuôn, ADN polymerase

tổng hợp mạch polynucleotide mới theo nguyên tắc bổ sung

Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn

C, đoạn T, đầu dò M và đoạn gen β-globin Thành phần và điều kiện phản ứng

khuếch đại đoạn C và T được trình bày trên Bảng 5