2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối với kỹ thuật lai điểm dot blot: hai đoạn ADN đích (kí hiệu là đoạn C và đoạn T) có cùng kích thƣớc 150 bp đã đƣợc tách dòng trong hai plasmid: plasmid pGEM-C mang đoạn chèn C và plasmid pTZ57-T mang đoạn chèn T. Hai đoạn chèn này chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp. Đoạn ADN làm đầu dò (kí hiệu đoạn M) đã đƣợc tách dòng trong plasmid pTZ57-M. Đoạn M có kích thƣớc 225 bp gồm đoạn 75 bp lặp lại ba lần trong đó 75 bp này là trình tự có mặt trong đoạn C. Tính tƣơng đồng của các đoạn C, T và M đƣợc trình bày trên Hình 8.
Hình 8: Tính tƣơng đồng của các đoạn C, T và M. Ký hiệu ● thể hiện vị trí sai khác giữa trình tự C và trình tự T.
- Đối với kỹ thuật lai điểm ngƣợc reverse dot blot: sử dụng 30 mẫu máu của ngƣời bệnh thalassemia (ký hiệu từ T1 đến T30) đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ƣơng trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2012.
2.1.2. Hóa chất
- dNTPs (Promega); - MgCl2 (Promega);
- Đệm Taq polymerase 10x (chứa 15mM Mg2+) (Sigma-Aldrich); - JumpStart Taq ADN polymerase (Sigma-Aldrich);
- Đệm Colorless GoTaq Flexi 5x (Promega); - GoTaq Flexi ADN polymerase (Promega); - Biotin-11-dUTP (Fermentas);
- Streptavidin Alkaline phosphatase (Promega); - DIG-11-dUTP (Roche);
- Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (Roche); - Blocking reagent (Roche);
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich);
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega);
- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega);
- Kit tinh sạch sản phẩm PCR High pure PCR cleanup micro (Roche);
- Các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 2;
- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2: Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngƣợc
Dung dịch Thành phần B1 NaOH 0,5M; NaCl 1,5M B2 Tris-HCl 0,5M pH 7,6; NaCl 1,5M H1 SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1% H2 SSC 5x; Blocking 1x 10%; SDS 0,1% H3 SSC 2x; SDS 0,1% W1 SSC 2x; SDS 0,1% W2 SSC 2x U1 Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M U2 Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M; MgCl2 0,05M U3 Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5, Tween 20 0,3% U4 Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M
U5 Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M SSC 1x NaCl 0,15M; Natri citrat 0,15M pH 7
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%
Đệm maleic 1x Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5
Blocking 1x Blocking reagent 1% (w/v) (pha trong đệm maleic 1x)
2.1.3. Các mồi
Cặp mồi CT F/R khuếch đại đoạn C và T từ plasmid pGEM-C và pTZ57-T. Cặp mồi M13 F/R khuếch đại đoạn M từ vector pTZ57-M (Hình 8). Cặp mồi CD F/R thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin công bố trong ngân hàng dữ liệu gen [81]. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41-42 MR dùng trong phản ứng PCR đa mồi để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin. Các mồi trên đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3: Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng Tên mồi Trình tự (5' - 3') Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) CT F TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 150 CT R CGACGAAACTCCAACGAAAAC M13 F GTAAAACGACGGCCAGT 380 M13 R CGAGAAACAGCTATGAC CD F CCAATCTACTCCCAGGAGCAG 700 CD R CCACACTGATGCAATCATTCG 17 MR ACTTCATCCACGTTCACCTA 200 (với mồi CD F) 26 MR CCAACCTGCCCAGGGCCTT 220 (với mồi CD F) 41-42 MR GGACAGATCCCCAAAGGACTCA 400 (với mồi CD F) 2.1.4. Các đầu dò oligo
Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc gắn thêm nhóm amin ở đầu 5'. Cấu trúc này giúp đầu dò hình thành liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C. Trình tự các oligo đƣợc trình bày trong Bảng 4 và Hình 9.
Bảng 4: Trình tự các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc (nucleotide gạch chân tƣơng ứng với đột biến)
Tên đầu dò oligo Trình tự (5' - 3')
CD17 N NH2-TGTGGGGCAAGGTGAACGTG CD17 M [A→T] NH2-TGTGGGGCTAGGTGAACGTG CD26 N NH2-AGTTGGTGGTGAGGCCCTGGG CD26 M [G→A] NH2-AGTTGGTGGTAAGGCCCTGGG CD41 N NH2-CCCAGAGGTTCTTTGAGTCC CD41 M [-TCTT] NH2-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG
2.1.5. Màng lai
- Màng nylon tích điện dƣơng (Nylon membrane, positively charged - Roche); - Màng nylon Biodyne C 0.45µm (Pall).
2.1.6. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế đầu dò
Trong thí nghiệm lai điểm, đoạn M (mang trình tự lõi của đoạn C) đƣợc sử dụng làm đầu dò với mong muốn phân biệt sự khác biệt giữa trình tự C và trình tự T (Hình 8).
Đối với thí nghiệm lai điểm ngƣợc, chúng tôi thiết kế ba cặp đầu dò oligo để phát hiện đồng thời ba đột biến điểm trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia: đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]. Mỗi cặp đầu dò gồm một đầu dò bình thƣờng (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của ngƣời bình thƣờng) và một đầu dò đột biến (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của ngƣời bệnh β-thalassemia). Vị trí các đầu dò và cặp mồi CD F/R đƣợc trình bày trên Hình 9.
Hình 9: Vị trí các đầu dò oligo và cặp mồi CD F/R trên gen β-globin [81]. Trình tự ADN
gạch chân là vị trí của cặp mồi CD F/R. Trình tự màu xanh tƣơng ứng với vị trí oligo CD17 N/M (chứa Cd 17 [A → T]); Trình tự màu vàng tƣơng ứng với vị trí oligo CD26 N/M (chứa Cd 26 [G → A]); Trình tự màu xám tƣơng ứng với vị trí oligo CD41 N/M (chứa Cd 41-42 [-TCTT]); Các nucleotide màu đỏ là vị trí xảy ra đột biến.
2.2.2. Phương pháp PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một hay nhiều đoạn ADN. Thành phần chính của phản ứng gồm có khuôn ADN, mồi, Taq ADN polymerase và dNTP. Phản ứng này gồm có ba giai đoạn chính:
Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (940 - 950C) để tách hai mạch của chuỗi ADN xoắn kép.
Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống để các mồi gắn bổ sung với sợi ADN khuôn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần nucleotide và chiều dài của mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.
Giai đoạn kéo dài: Sử dụng một mạch ADN làm khuôn, ADN polymerase tổng hợp mạch polynucleotide mới theo nguyên tắc bổ sung.
Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại các đoạn C, đoạn T, đầu dò M và đoạn gen β-globin. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C và T đƣợc trình bày trên Bảng 5.
Bảng 5: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C và T
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 11,3 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 650 C trong 10 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 10 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 CT F 10 µM 0,25 CT R 10 µM 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2
ADN khuôn 1,0
Tổng thể tích 15,0
Ngoài ra, phƣơng pháp này còn dùng để đánh dấu đầu dò M và đoạn gen β- globin với biotin (sử dụng biotin-11-dUTP) và digoxigenin (sử dụng DIG-11-dUTP). PCR đa mồi là một dạng cải tiến của kỹ thuật PCR thông thƣờng. Đây là kĩ thuật sử dụng từ hai cặp mồi trở lên trong cùng một hỗn hợp phản ứng để phát hiện hai hay nhiều trình tự quan tâm, giúp tiết kiệm hoá chất và thời gian tiến hành PCR. Điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi phụ thuộc vào điều kiện tối ƣu cho sự bắt cặp của từng cặp mồi. Chúng tôi sử dụng phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc đồng thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin cho 30 mẫu bệnh phẩm.
2.2.3. Quá trình lai điểm
2.2.3.1. Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche)
Biến tính ADN trên màng nylon: 2 µl (nồng độ 5 ng/µl) sản phẩm PCR khuếch đại đoạn C và đoạn T (với cặp mồi CT F/R) đƣợc chấm lên màng nylon (Roche). Chuyển màng vào dung dịch B1 (NaOH 0,5M; NaCl 1,5M) trong 10 phút. Tiếp theo màng đƣợc chuyển vào dung dịch B2 (Tris-HCl 0,5M pH 7,6; NaCl 1,5M) trong 10 phút, sau đó để khô màng;
Cố định ADN trên màng nylon tích điện dƣơng bằng UV: chiếu tia cực tím ở bƣớc sóng 254 nm trong 1 phút 30 giây.
2.2.3.2. Tiền lai và lai Đối với đầu dò đánh dấu biotin Đối với đầu dò đánh dấu biotin
Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H1 (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Biến tính đầu dò M đánh dấu biotin: bổ sung 15 µl đầu dò M vào 100 µl đệm lai H1, ủ 950C trong 5 - 10 phút rồi chuyển ngay lên đá;
Cho đầu dò đã biến tính vào 1,5 ml đệm lai H1. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;
Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W1 (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.
Đối với đầu dò đánh dấu DIG
Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H2 (SSC 5x; Blocking 1x 10%; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Biến tính đầu dò M đánh dấu DIG: bổ sung 15 µl đầu dò M vào 100 µl đệm lai H2, ủ 950C trong 5 - 10 phút rồi chuyển ngay lên đá;
Cho đầu dò đã biến tính vào 1,5 ml đệm lai H2. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;
Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W1 (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.
2.2.3.3. Phát hiện đầu dò Đối với đầu dò đánh dấu biotin Đối với đầu dò đánh dấu biotin
"Khóa" màng
Rửa màng với đệm U1 (Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;
Ủ màng với dung dịch Denhardt 5x (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U1) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Gắn đầu dò với Streptavidin Alkaline phosphatase (SA-AP)
Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm U1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M; MgCl2
0,05M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
Đối với đầu dò đánh dấu DIG "Khóa" màng
Ủ màng với đệm Blocking 1x trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Gắn đầu dò với Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (AD-AP)
Pha loãng AD-AP trong đệm Bocking 1x (AD-AP : đệm Blocking 1x = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm đệm U3 (Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5, Tween 20 0,3%) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U4 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M ) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
2.2.4. Quá trình lai điểm ngược
2.2.4.1. Hoạt hóa màng nylon (Pall)
Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng; Tráng nhẹ màng với nƣớc và để khô màng.
2.2.4.2. Cố định đầu dò trên màng nylon (Pall)
Đầu dò oligo (Bảng 4) đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 nM trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5M, pH 8,4;
Chấm 2 µl đầu dò đã pha loãng lên màng, để khô 15 phút, cố định bằng NaOH 0,5 N trong 1 phút.
2.2.4.3. Tiền lai và lai
Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H3 (SSC 2x; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Biến tính đoạn gen β-globin đánh dấu biotin trong đệm lai H3: bổ sung 45 µl sản phẩm PCR với cặp mồi CD F/R (bổ sung biotin-11-dUTP) vào 100 µl đệm lai, ủ 950
Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H3. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;
Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W2 (SSC 2x) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.
2.2.4.4. Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin "Khóa" màng "Khóa" màng
Rửa màng với đệm U5 (Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;
Ủ màng với dung dịch 5x Denhardt (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U5) trong 30 phút ở nhiệt độ lai.
Gắn đầu dò với SA-AP
Pha loãng SA-AP trong đệm U5 (SA-AP : đệm U3 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U5 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U2 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ màng trong tối. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
2.2.5. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm
ADN đƣợc tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia bằng kit ReliaprepTM Blood gADN MiniPrep System (Promega). Quy trình gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Mẫu máu bảo quản ở -800C đƣợc lấy ra để tan hoàn toàn, trộn đều nhẹ nhàng trong 10 phút
Chia 20 µl Proteinase K vào các ống eppendorf 1,5 ml Thêm 200 µl máu vào mỗi ống
Thêm 200 µl đệm Cell lysis, trộn đều và ủ 10 phút ở 560C Bổ sung 250 µl đệm Binding, trộn đều
Chuyển hỗn hợp lên cột. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 500 µl dung dịch Column Wash. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút, loại dịch. Lặp lại bƣớc này 2 lần
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 200 µl H2O và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa ADN. Bảo quản ở -200C.
2.2.6. Tách plasmid
Quy trình tách chiết plasmid gồm các bƣớc cơ bản sau:
Ly tâm (6000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút) 1,5 ml dịch nuôi tế bào bão hòa qua đêm rồi loa ̣i bỏ di ̣ch trong
Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15 phút ở nhiệt đô ̣ phòng
Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 3 phút
Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 5 phút
Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25: 24 : 1), trô ̣n nhe ̣ Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủ a
Rƣ̉a tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút, thu tủa và làm khô tủa
Hòa tủa trong 30µl H2O, bảo quản ở -200C.
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro (Roche)
Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng kit gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Cắt băng ADN từ gel agarose đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml và cân khối lƣợng miếng gel
Bổ sung 300 µl đệm Bingding cho mỗi 100 mg gel. Ủ ở 560
C trong 10 phút Bổ sung 100 µl đệm Binding Enhancer cho mỗi 100 mg gel, trộn đều
Chuyển hỗn hợp lên cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để bỏ hết