Nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để lai ADN hoặc ARN trên màng cellulose hoặc màng nylon. Đặc điểm của màng dùng trong kỹ thuật lai ảnh hƣởng trực tiếp tới kết quả thu đƣợc. Màng nitrocellulose cho khả năng gắn axit nucleic kém (50-100 µg/cm2) và chỉ giữ đƣợc ADN hay ARN có kích thƣớc trên 400 bazơ [55]. ADN và ARN gắn trên màng nitrocellulose bởi tƣơng tác kỵ nƣớc, vì vậy tốc độ lai và rửa rất chậm ở nhiệt độ cao. Điều kiện cố định axit nucleic ở 800C khiến màng trở nên giòn [55]. Khi độ ẩm cao, màng sẽ hấp thụ, nở ra, cong và xuất hiện nhiều nếp nhăn [28]. Sự ra đời của màng nylon đã khắc phục các vấn đề trên. Nghiên cứu của Twomey và cs. so sánh chín loại màng nylon và màng cellulose sử dụng bốn phƣơng pháp gắn axit nucleic đích khác nhau [66]. Kết quả chỉ ra rằng màng nylon có độ nhạy cao hơn và có thể tăng độ nhạy bằng cách biến tính trình tự đích (bằng UV hoặc ủ ở nhiệt độ cao) trƣớc khi gắn lên màng [66]. Với ƣu điểm nhƣ vậy, hiện nay màng nylon đã đƣợc phát triển thành nhiều loại với các đặc tính riêng nhƣ màng tích điện dƣơng liên kết chủ yếu bằng tƣơng tác ion (và cộng hóa trị sau khi chiếu UV) hay màng không tích điện liên kết bằng tƣơng tác tĩnh điện (và cộng hóa trị sau khi chiếu UV) với kích thƣớc lỗ màng cho phép gắn tối đa giữa trình tự đích với đầu dò, đồng thời loại bỏ đầu dò không lai để ngăn chặn nhiễu nền (Bảng 1) [80]. Màng Biodyne C đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc [82]. Sau khi hoạt hóa bằng dung dịch EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), màng sẽ "bộc lộ" các nhóm carboxyl, từ đó ƣu tiên gắn các oligo có nhóm amin ở đầu 5' lên màng [11, 76].
Các kỹ thuật lai trên màng nhƣ Southern blot, northern blot, dot blot hay reverse dot blot đều trải qua các bƣớc tƣơng tự nhau, bao gồm: biến tính các phân tử sợi kép, tiền lai, lai, rửa và phát hiện kết quả lai. Nếu trình tự đích và đầu dò ở dạng sợi kép thì chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn. Nhiệt độ cao thƣờng đƣợc sử dụng để bẻ gãy các liên kết hydro giữa hai mạch. Năng lƣợng để phá vỡ các liên kết này phụ thuộc vào một số yếu tố chính là chiều dài đoạn ADN, thành phần GC
và thành phần đệm. Đoạn ADN càng dài và tỷ lệ GC càng lớn thì nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao. Những điểm bắt cặp sai (ví dụ nhƣ A bắt cặp với C, G bắt cặp với T...) cũng làm giảm tính ổn định của một phân tử lai [70]. Thông thƣờng ngƣời ta ƣớc lƣợng Tm giảm 10C cho 1% bắt cặp sai [58]. Tuy nhiên, các bắt cặp sai chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn ADN ngắn. Ngoài ra, lực ion (nồng độ muối) và sự có mặt của formamide trong đệm lai cũng ảnh hƣởng tới giá trị Tm [7, 14, 50].
Bảng 1: Đặc điểm của một số loại màng dùng trong kỹ thuật lai axit nucleic [55]
Đặc điểm Các loại màng Nitrocellulose Nylon không tích điện Nylon tích điện dƣơng Khả năng gắn (µg axit nucleic/cm2) 80-120 ~100 400-500 Kích thƣớc axit nucleic > 400 bp > 50 bp > 50 bp Đệm chuyển Có lực ion ở pH
trung tính Có lực ion yếu trong một dải pH rộng
Điều kiện cố định axit nucleic
Ủ ở 800
C trong 2 giờ (điều kiện chân không)
Ủ ở 700C trong 1 giờ hoặc trong dung dịch kiềm yếu hoặc chiếu UV ở bƣớc sóng 254 nm
(màng ẩm: 1,6 kJ/m2 ; màng khô: 160 kJ/m2) Sản phẩm thƣơng mại Hybond-H Gene-Screen Hybond-N+ Zeta-Probe Nytran+ Gene-Screen Plus Sau khi biến tính phân tử sợi kép, màng sẽ đƣợc tiền lai với dung dịch đệm lai không chứa đầu dò. Các vị trí trên màng không có ADN sẽ bị bão hòa đối với các loại ADN và phân tử trùng phân có trong đệm tiền lai. Đệm tiền lai đƣợc thay thế bằng đệm lai chứa đầu dò và ủ ở nhiệt độ thích hợp để quá trình lai giữa đầu dò đã đánh dấu với phân tử axit nucleic diễn ra. Nhiệt độ lai tối ƣu đƣợc xác định bằng thực nghiệm, thƣờng bắt đầu khảo sát ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm 250
đầu dò dƣ thừa đƣợc loại bỏ thông qua các bƣớc rửa. Điều kiện rửa ít nghiêm ngặt (nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp) giúp tăng độ nhạy, tuy nhiên tín hiệu có thể không đặc hiệu và nhiễu nền cao. Điều kiện rửa rất nghiêm ngặt (nồng độ muối thấp và nhiệt độ cao, gần với nhiệt độ lai) có thể loại bỏ nhiễu nền và chỉ có những tín hiệu đặc hiệu đƣợc giữ lại [7].