Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng kit gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Cắt băng ADN từ gel agarose đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml và cân khối lƣợng miếng gel
Bổ sung 300 µl đệm Bingding cho mỗi 100 mg gel. Ủ ở 560
C trong 10 phút Bổ sung 100 µl đệm Binding Enhancer cho mỗi 100 mg gel, trộn đều
Chuyển hỗn hợp lên cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để bỏ hết dịch qua cột
Thêm 400 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch Thêm 300 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch
Thêm 20 µl H2O vào giữa cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu lấy phần dịch. Bảo quản ở -200C.
2.2.8. Phương pháp điện di
Điện di là phƣơng pháp phổ biến để phân tách các phân tử axit nucleic. Dƣới tác dụng của điện trƣờng một chiều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng nhờ có nhóm phosphat tích điện âm. Các phân tử ADN đƣợc phân tách dựa vào kích thƣớc
và cấu hình. Có hai loa ̣i gel đƣợc dùng phổ biến là agarose và polyacrylamide (Bảng 6). Hai loại gel này đƣợc dùng để điện di ADN trong đệm TBE 1x (Tris base, Axit boric, EDTA). Các băng ADN đƣợc phát hiện dƣớ i tia tƣ̉ ngoa ̣i sau khi nhuô ̣m với ethidium bromide.
Bảng 6: Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong phân tách ADN
Thành phần Thể tích (ml) H2O 3,135 TBE 10x 0,5 Bis-acrylamide 30% 1,33 APS 10% 0,035 TEMED 0,005 Tổng số 5
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
A - KẾT QUẢ
3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM
3.1.1. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng plasmid pTZ57-M chứa đoạn chèn M để làm đầu dò. Đoạn M có trình tự 75 bp đƣợc lặp lại ba lần (Hình 8). Trình tự 75 bp giống hệt với một phần trình tự của đoạn C và sai khác 7 nucleotide với đoạn T. Với đặc điểm nhƣ vậy, đoạn M đƣợc chọn làm đầu dò để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm. Đoạn M đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pTZ57-M, cặp mồi vector M13 F/R cùng thành phần và điều kiện trình bày trong Bảng 7.
Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dò M
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 11,3 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 M13 F 10 µM 0,25 M13 R 10 µM 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2
ADN khuôn 10 - 20 ng
Tổng thể tích 15,0
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%. Kết quả trên Hình 10 cho thấy chúng tôi thu đƣợc băng ADN khoảng 380 bp. Đây là kích thƣớc đoạn ADN gồm đoạn chèn M cộng với khoảng cách giữa hai mồi M13 F và M13 R. Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã khuếch đại đƣợc đoạn M.
Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR để đánh dấu đầu dò M sử dụng nucleotide gắn chất đánh dấu biotin hoặc digoxigenin (DIG). Với điều kiện chu trình nhiệt không đổi nhƣng bổ sung thêm biotin-11-dUTP (hoặc DIG-11-dUTP) so với dTTP theo tỷ lệ tƣơng ứng trong Bảng 8, chúng tôi thu đƣợc kết quả trình bày trên Hình 10A và Hình 10B.
Bảng 8: Thành phần và điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M với biotin và DIG
Thành phần Biotin (µl) DIG (µl) Điều kiê ̣n
H2O 9,8 9,8 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C, 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 1,5 d(A, C, G)TP 1mM mỗi loại 1,0 1,0 dTTP 1mM 0,6 0,65 Biotin-11-dUTP 1mM 0,4 DIG-11-dUTP 1 mM 0,35 M13 F 10 µM 0,25 0,25 M13 R 10 µM 0,25 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2 0,2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ADN 10 - 20 ng 10 - 20 ng
Tổng thể tích 15,0 15,0
Đoạn M đƣợc đánh dấu có kích thƣớc cao hơn đoạn M không đánh dấu vì khối lƣợng phân tử của biotin-11-dUTP (927.6 Da) và DIG-11-dUTP (1090.7 Da) lớn hơn dTTP thông thƣờng (548.1 Da). Kết quả điện di trên Hình 10 chứng tỏ chúng tôi đã đánh dấu thành công đầu dò M với biotin và DIG.
Hình 10: Kết quả đánh dấu đầu dò M với biotin (A) và DIG (B). Giếng 1 và 3: lần lƣợt là đầu dò M đánh dấu biotin và DIG; Giếng 2: đoạn M không đánh dấu; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
3.1.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG
Với mong muốn so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG, chúng tôi chấm 2 µl mỗi loại đầu dò (thu đƣợc từ mục 3.1.1) lên màng nylon. Đồng thời, để kiểm tra độ nhạy của kỹ thuật lai điểm, chúng tôi pha loãng đoạn M không đánh dấu theo dải nồng độ 5 ng/µl, 10 ng/µl, 20 ng/µl, 40 ng/µl, sau đó sử dụng 2 µl mỗi nồng độ để chấm lên màng. Các bƣớc trong quy trình lai điểm bao gồm biến tính và cố định ADN trên màng, tiền lai và lai, phát hiện đầu dò đánh dấu biotin và DIG đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.3. Chúng tôi thăm dò dải nhiệt độ lai: 550C, 600C, 650C và 700C. Sau khi ủ màng với cơ chất của enzyme alkaline phosphatase (hỗn hợp dung dịch NBT/BCIP) trong tối, chúng tôi quan sát kết quả. Hình 11 minh họa cho kết quả lai điểm ở nhiệt độ lai 600C và 650C. Chúng tôi nhận thấy ở nhiệt độ lai 650C các chấm có tín hiệu rõ ràng hơn cả. Phông màng sạch chứng tỏ bƣớc rửa sau lai đã loại bỏ đƣợc đầu dò dƣ thừa bám vào màng. Các vị trí chấm đầu dò đánh dấu biotin và DIG đều lên màu chứng tỏ đầu dò đánh dấu tốt. Ở cả hai nhiệt độ 600
C và 650C hầu nhƣ không có sự khác biệt đáng kể giữa hai loại chất đánh dấu biotin (224$/50 µl biotin-11-dUTP, Fermentas) và DIG (227$/25 µl DIG-11-dUTP, Roche). Do đó, để tiết kiệm chi phí, chúng tôi sử dụng biotin để đánh dấu đầu dò trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 11: Kết quả so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG và kiểm tra độ nhạy của kỹ thuật lai điểm. 5, 10, 20, 40 ng: nồng độ đoạn M không đánh dấu; M*: đầu dò đánh dấu biotin hoặc DIG.
Kết quả trên Hình 11 cho thấy, khi nồng độ đoạn M không đánh dấu giảm dần thì chấm tƣơng ứng cũng nhạt dần. Ở nồng độ đoạn M thấp nhất trong thí nghiệm này là 5 ng, chúng tôi vẫn quan sát đƣợc tính hiệu rõ nét. Chúng tôi tiếp tục sử dụng nồng độ này cho thí nghiệm lai nhằm phân biệt hai đoạn trình tự đích và trình tự đối chứng.
3.1.3. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng
Trong quá trình lai điểm, chúng tôi sử dụng hai trình tự ADN để chấm lên màng. Trình tự đích là đoạn C đƣợc tách dòng trong vector pGEM, trình tự đối chứng là đoạn T đƣợc tách dòng trong vector pTZ57. Hai đoạn ADN này có kích thƣớc 150 bp và chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp (Hình 8). Trƣớc tiên chúng tôi nuôi bão hòa các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp trong môi trƣờng LB lỏng và tiến hành tách plasmid theo quy trình 2.2.6. Hai loại plasmid này đƣợc dùng làm
khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi CT F/R để khuếch đại đoạn C và đoạn T. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 5 (2.2.2). Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 8% xuất hiện băng khoảng 150 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn C và T (Hình 12). Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại đƣợc trình tự đích và trình tự đối chứng cho kỹ thuật lai điểm.
Hình 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C và đoạn T. Giếng ĐC: đối chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng C: đoạn chèn C; Giếng T: đoạn chèn T; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
3.1.4. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích (đoạn C) và trình tự đối chứng (đoạn T)
Trong thí nghiệm lai điểm nhằm phân biệt đoạn C và đoạn T, chúng tôi chấm lên màng 2 µl (nồng độ 5 ng/µl) các sản phẩm nhƣ sau: sản phẩm PCR đoạn C và đoạn T (150 bp), đầu dò M đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra hiệu quả đánh dấu), đoạn M không đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra toàn bộ quá trình lai). Sau khi chấm các sản phẩm này lên màng, chúng tôi tiến hành các bƣớc theo mục 2.2.3, sử dụng nhiệt độ lai 650C nhƣ đã thử nghiệm ở mục 3.1.2. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 13.
Quan sát Hình 13 chúng tôi nhận thấy vị trí chấm đầu dò M không đánh dấu và có đánh dấu biotin cho tín hiệu rõ ràng chứng tỏ đầu dò đánh dấu tốt và quá trình lai diễn ra ở điều kiện phù hợp. Vị trí chấm đoạn C cho tín hiệu màu chứng tỏ đoạn C đã lai với đầu dò M. Trong khi đó, vị trí chấm đoạn T không xuất hiện màu,
chứng tỏ sau quá trình lai và rửa không có sự bắt cặp bổ sung giữa trình tự này và đầu dò M. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tối ƣu đƣợc điều kiện để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm.
Hình 13: Kết quả lai điểm phân biệt đoạn C và đoạn T ở 650C. T: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn T; C: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn C; +: vị trí chấm đầu dò M đánh dấu biotin; -: vị trí chấm đoạn M không đánh dấu biotin.
Để kiểm tra khả năng phát hiện sự có mặt đoạn C trong hỗn hợp các đoạn ADN khác, chúng tôi trộn sản phẩm khuếch đại đoạn C với đoạn ADN ngoại lai bất kỳ (theo tỷ lệ 1:1). Trong thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn đoạn ADN ngoại lai (kích thƣớc 700 bp) là sản phẩm của phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R, sử dụng khuôn là ADN tách từ mẫu máu (mục 2.2.5). Mẫu ADN ngoại lai này đƣợc kí hiệu là In700. Mẫu trộn đoạn C với In700 đƣợc kí hiệu là C700. Ngoài ra, trình tự đoạn C và đoạn T còn có mặt trong hai plasmid pGEM-C và pTZ57-T. Từ đó, chúng tôi quyết định sử dụng cả hai loại ADN plasmid này (kí hiệu pC và pT) cùng chấm lên màng với các mẫu khác là đoạn T, đoạn C, đoạn In700, mẫu trộn C700. Tiến hành lai điểm với các bƣớc không đổi, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 14.
Hình 14: Kết quả lai điểm với các loại ADN khác nhau chứa đoạn C và đoạn T. pT: plasmid pTZ57-T; pC: plasmid pGEM-C; T và C: đoạn T và đoạn C; In700: trình tự đoạn ADN có kích thƣớc 700 bp; C700: mẫu trộn đoạn C và đoạn ADN 700 bp.
Vị trí chấm mẫu trộn C700 cho tín hiệu hầu nhƣ không có sự khác biệt so với chấm chỉ có đoạn C. Điều đó chứng tỏ với tỷ lệ đã trộn thì sự có mặt của đoạn ADN ngoại lai không ảnh hƣởng tới sự phát hiện đoạn C. Tuy nhiên, hai plasmid chứa trình tự C và T khi chấm lên màng đều lên màu đậm. Tín hiệu đậm là do kích thƣớc của ADN gắn trên màng ảnh hƣởng đến hiệu quả lai: ADN dài gắn trên màng ít bị rửa trôi trong quá trình lai so với đoạn ADN ngắn. Độ dài của đoạn ADN gắn trên màng và tín hiệu lai đã đƣợc khảo sát trong một số nghiên cứu [54]. Một nguyên nhân nữa khiến cả hai plasmid pC và pT lai với đầu dò M là chúng đều có chứa trình tự nucleotide bổ sung với mồi M13 F/R (17 nucleotide). Đây là cặp mồi của vector tách dòng bao gồm cả pTZ57 và pGEM. Cặp mồi này đƣợc dùng để đánh dấu đầu dò M bằng phản ứng PCR (Bảng 8). Vì vậy, chúng tôi thực hiện thí nghiệm để kiểm tra: (i) Khả năng lai của đầu dò M với trình tự đích chỉ chứa trình tự nucleotide của hai mồi M13 F/R (mà không chứa các đoạn C hay T), (ii) Hiệu quả lai phụ thuộc vào chiều dài của đoạn ADN chấm lên màng.
Để khẳng định đầu dò M lai với trình tự mồi M13, chúng tôi sử dụng ADN plasmid pGEM và pTZ57 không chứa đoạn chèn để chấm lên màng cùng với các pGEM-C và pTZ57-T. Kết quả lai điểm với đầu dò M đƣợc trình bày trên Hình 15.
Kết quả trên Hình 15A cho thấy cả 4 loại plasmid, chứa hay không chứa đoạn chèn đều lai với đầu dò M và cho tín hiệu rõ nét. Các plasmid này chỉ có
chung phần trình tự mồi M13 F/R, phần trình tự này cũng có mặt trong đầu dò M. Tiếp tục, chúng tôi sử dụng plasmid cũng mang trình tự mồi M13 F/R là pBluescript để chấm lên màng rồi tiến hành lai điểm. Kết quả trên Hình 15B cho thấy plasmid này cũng lai với đầu dò M. Nhƣ vậy, với việc sử dụng các plasmid tách dòng khác nhau đã khẳng định đầu dò M lai với các plasmid là do plasmid và đầu dò cùng chứa trình tự mồi M13.
Hình 15: Kết quả lai đầu dò M với plasmid không mang đoạn chèn C và T. pT: plasmid pTZ57-T; pC: plasmid pGEM-C; p1: plasmid pTZ57; p2: plasmid pGEM; p3: plasmid pBluescript; T và C: đoạn T và đoạn C; +: đầu dò M đánh dấu biotin.
Để kiểm tra hiệu quả lai phụ thuộc vào chiều dài đoạn ADN gắn trên màng, chúng tôi chọn pBluescript mang trình tự các mồi M13 F/R và các mồi M13 F, M13 R cùng chấm lên màng để thực hiện lai điểm với đầu dò M. Kết quả trên Hình 16 cho thấy chỉ có pBluescript lai với đầu dò M, còn hai mồi M13 F và M13 R không cho tín hiệu màu. Điều này thêm phần khẳng định độ dài đoạn ADN chấm trên màng có ảnh hƣởng lớn đến kết quả lai. Các plasmid mang trình tự M13 F/R có kích thƣớc lớn nên có thể cố định trên màng trong suốt quá trình lai và rửa, còn mồi M13 F/R có kích thƣớc ngắn, dễ dàng bị rửa trôi.
Hình 16: Kết quả lai điểm với cặp mồi M13 F/R. M13 F và M13 R: mồi khuếch đại đầu dò M; T và C: đoạn T và đoạn C; p3: plasmid pBluescript; +: đầu dò M đánh dấu biotin.
3.2. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC
3.2.1. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin
Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega), chúng tôi thu đƣợc ADN tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia. ADN này đƣợc dùng làm khuôn trong phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin. Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi lựa chọn ba đột biến phổ biến nhất gây bệnh β-thalassemia ở ngƣời Việt Nam, bao gồm đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]). Đột biến tại Cd 17 và Cd 26 là những đột biến điểm, tức là trình tự đột biến và trình tự bình thƣờng chỉ sai khác nhau một nucleotide. Điều này gây cho chúng tôi không ít khó khăn trong quá trình chuẩn hóa phản ứng PCR đa mồi để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả. Sau khi thay đổi lƣợng mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, thời gian tổng hợp, chúng tôi đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện PCR đa mồi (Bảng 9). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 7,2 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9 dNTP 2 mM mỗi loại 1,0 CD F 10 µM 1,0 17 MR 10 µM 0,2 26 MR 10 µM 0,1 41-42 MR 10 µM 0,3 CD R 10 µM 0,4
GoTaq Flexi ADN
polymerase 5 u/µl 0,1
ADN 20 - 50 ng
Tổng thể tích 15,0