A- KẾT QUẢ
3.1.3. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng
Trong quá trình lai điểm, chúng tôi sử dụng hai trình tự ADN để chấm lên màng. Trình tự đích là đoạn C đƣợc tách dòng trong vector pGEM, trình tự đối chứng là đoạn T đƣợc tách dòng trong vector pTZ57. Hai đoạn ADN này có kích thƣớc 150 bp và chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp (Hình 8). Trƣớc tiên chúng tôi nuôi bão hòa các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp trong môi trƣờng LB lỏng và tiến hành tách plasmid theo quy trình 2.2.6. Hai loại plasmid này đƣợc dùng làm
khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi CT F/R để khuếch đại đoạn C và đoạn T. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 5 (2.2.2). Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 8% xuất hiện băng khoảng 150 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn C và T (Hình 12). Nhƣ vậy, chúng tôi đã khuếch đại đƣợc trình tự đích và trình tự đối chứng cho kỹ thuật lai điểm.
Hình 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C và đoạn T. Giếng ĐC: đối chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng C: đoạn chèn C; Giếng T: đoạn chèn T; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
3.1.4. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích (đoạn C) và trình tự đối chứng (đoạn T)
Trong thí nghiệm lai điểm nhằm phân biệt đoạn C và đoạn T, chúng tôi chấm lên màng 2 µl (nồng độ 5 ng/µl) các sản phẩm nhƣ sau: sản phẩm PCR đoạn C và đoạn T (150 bp), đầu dò M đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra hiệu quả đánh dấu), đoạn M không đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra toàn bộ quá trình lai). Sau khi chấm các sản phẩm này lên màng, chúng tôi tiến hành các bƣớc theo mục 2.2.3, sử dụng nhiệt độ lai 650C nhƣ đã thử nghiệm ở mục 3.1.2. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 13.
Quan sát Hình 13 chúng tôi nhận thấy vị trí chấm đầu dò M không đánh dấu và có đánh dấu biotin cho tín hiệu rõ ràng chứng tỏ đầu dò đánh dấu tốt và quá trình lai diễn ra ở điều kiện phù hợp. Vị trí chấm đoạn C cho tín hiệu màu chứng tỏ đoạn C đã lai với đầu dò M. Trong khi đó, vị trí chấm đoạn T không xuất hiện màu,
chứng tỏ sau quá trình lai và rửa không có sự bắt cặp bổ sung giữa trình tự này và đầu dò M. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tối ƣu đƣợc điều kiện để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm.
Hình 13: Kết quả lai điểm phân biệt đoạn C và đoạn T ở 650C. T: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn T; C: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn C; +: vị trí chấm đầu dò M đánh dấu biotin; -: vị trí chấm đoạn M không đánh dấu biotin.
Để kiểm tra khả năng phát hiện sự có mặt đoạn C trong hỗn hợp các đoạn ADN khác, chúng tôi trộn sản phẩm khuếch đại đoạn C với đoạn ADN ngoại lai bất kỳ (theo tỷ lệ 1:1). Trong thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn đoạn ADN ngoại lai (kích thƣớc 700 bp) là sản phẩm của phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R, sử dụng khuôn là ADN tách từ mẫu máu (mục 2.2.5). Mẫu ADN ngoại lai này đƣợc kí hiệu là In700. Mẫu trộn đoạn C với In700 đƣợc kí hiệu là C700. Ngoài ra, trình tự đoạn C và đoạn T còn có mặt trong hai plasmid pGEM-C và pTZ57-T. Từ đó, chúng tôi quyết định sử dụng cả hai loại ADN plasmid này (kí hiệu pC và pT) cùng chấm lên màng với các mẫu khác là đoạn T, đoạn C, đoạn In700, mẫu trộn C700. Tiến hành lai điểm với các bƣớc không đổi, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 14.
Hình 14: Kết quả lai điểm với các loại ADN khác nhau chứa đoạn C và đoạn T. pT: plasmid pTZ57-T; pC: plasmid pGEM-C; T và C: đoạn T và đoạn C; In700: trình tự đoạn ADN có kích thƣớc 700 bp; C700: mẫu trộn đoạn C và đoạn ADN 700 bp.
Vị trí chấm mẫu trộn C700 cho tín hiệu hầu nhƣ không có sự khác biệt so với chấm chỉ có đoạn C. Điều đó chứng tỏ với tỷ lệ đã trộn thì sự có mặt của đoạn ADN ngoại lai không ảnh hƣởng tới sự phát hiện đoạn C. Tuy nhiên, hai plasmid chứa trình tự C và T khi chấm lên màng đều lên màu đậm. Tín hiệu đậm là do kích thƣớc của ADN gắn trên màng ảnh hƣởng đến hiệu quả lai: ADN dài gắn trên màng ít bị rửa trôi trong quá trình lai so với đoạn ADN ngắn. Độ dài của đoạn ADN gắn trên màng và tín hiệu lai đã đƣợc khảo sát trong một số nghiên cứu [54]. Một nguyên nhân nữa khiến cả hai plasmid pC và pT lai với đầu dò M là chúng đều có chứa trình tự nucleotide bổ sung với mồi M13 F/R (17 nucleotide). Đây là cặp mồi của vector tách dòng bao gồm cả pTZ57 và pGEM. Cặp mồi này đƣợc dùng để đánh dấu đầu dò M bằng phản ứng PCR (Bảng 8). Vì vậy, chúng tôi thực hiện thí nghiệm để kiểm tra: (i) Khả năng lai của đầu dò M với trình tự đích chỉ chứa trình tự nucleotide của hai mồi M13 F/R (mà không chứa các đoạn C hay T), (ii) Hiệu quả lai phụ thuộc vào chiều dài của đoạn ADN chấm lên màng.
Để khẳng định đầu dò M lai với trình tự mồi M13, chúng tôi sử dụng ADN plasmid pGEM và pTZ57 không chứa đoạn chèn để chấm lên màng cùng với các pGEM-C và pTZ57-T. Kết quả lai điểm với đầu dò M đƣợc trình bày trên Hình 15.
Kết quả trên Hình 15A cho thấy cả 4 loại plasmid, chứa hay không chứa đoạn chèn đều lai với đầu dò M và cho tín hiệu rõ nét. Các plasmid này chỉ có
chung phần trình tự mồi M13 F/R, phần trình tự này cũng có mặt trong đầu dò M. Tiếp tục, chúng tôi sử dụng plasmid cũng mang trình tự mồi M13 F/R là pBluescript để chấm lên màng rồi tiến hành lai điểm. Kết quả trên Hình 15B cho thấy plasmid này cũng lai với đầu dò M. Nhƣ vậy, với việc sử dụng các plasmid tách dòng khác nhau đã khẳng định đầu dò M lai với các plasmid là do plasmid và đầu dò cùng chứa trình tự mồi M13.
Hình 15: Kết quả lai đầu dò M với plasmid không mang đoạn chèn C và T. pT: plasmid pTZ57-T; pC: plasmid pGEM-C; p1: plasmid pTZ57; p2: plasmid pGEM; p3: plasmid pBluescript; T và C: đoạn T và đoạn C; +: đầu dò M đánh dấu biotin.
Để kiểm tra hiệu quả lai phụ thuộc vào chiều dài đoạn ADN gắn trên màng, chúng tôi chọn pBluescript mang trình tự các mồi M13 F/R và các mồi M13 F, M13 R cùng chấm lên màng để thực hiện lai điểm với đầu dò M. Kết quả trên Hình 16 cho thấy chỉ có pBluescript lai với đầu dò M, còn hai mồi M13 F và M13 R không cho tín hiệu màu. Điều này thêm phần khẳng định độ dài đoạn ADN chấm trên màng có ảnh hƣởng lớn đến kết quả lai. Các plasmid mang trình tự M13 F/R có kích thƣớc lớn nên có thể cố định trên màng trong suốt quá trình lai và rửa, còn mồi M13 F/R có kích thƣớc ngắn, dễ dàng bị rửa trôi.
Hình 16: Kết quả lai điểm với cặp mồi M13 F/R. M13 F và M13 R: mồi khuếch đại đầu dò M; T và C: đoạn T và đoạn C; p3: plasmid pBluescript; +: đầu dò M đánh dấu biotin.
3.2. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC
3.2.1. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin
Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega), chúng tôi thu đƣợc ADN tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia. ADN này đƣợc dùng làm khuôn trong phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin. Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi lựa chọn ba đột biến phổ biến nhất gây bệnh β-thalassemia ở ngƣời Việt Nam, bao gồm đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]). Đột biến tại Cd 17 và Cd 26 là những đột biến điểm, tức là trình tự đột biến và trình tự bình thƣờng chỉ sai khác nhau một nucleotide. Điều này gây cho chúng tôi không ít khó khăn trong quá trình chuẩn hóa phản ứng PCR đa mồi để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả. Sau khi thay đổi lƣợng mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, thời gian tổng hợp, chúng tôi đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện PCR đa mồi (Bảng 9).
Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 7,2 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9 dNTP 2 mM mỗi loại 1,0 CD F 10 µM 1,0 17 MR 10 µM 0,2 26 MR 10 µM 0,1 41-42 MR 10 µM 0,3 CD R 10 µM 0,4
GoTaq Flexi ADN
polymerase 5 u/µl 0,1
ADN 20 - 50 ng
Tổng thể tích 15,0
Trong phản ứng PCR đa mồi, chúng tôi thiết kế cặp mồi nội kiểm CD F/R khuếch đại vùng chứa ba đột biến nghiên cứu và cho sản phẩm có kích thƣớc 700 bp. Việc sử dụng cặp mồi này giúp chúng tôi (1) kiểm tra chất lƣợng ADN tách chiết, (2) kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41-42 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến tại codon tƣơng ứng (Hình 17). Ba mồi đột biến này kết hợp với mồi CD F để tạo ra sản phẩm PCR có kích thƣớc lần lƣợt là 200 bp (đột biến tại Cd 17), 220 bp (đột biến tại Cd 26) và 400 bp (đột biến tại Cd 41-42). Chúng tôi sử dụng phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc đột biến trên 30 mẫu bệnh phẩm (từ T1 đến T30). Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2%, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 18.
Hình 17: Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR đa mồi.
Hình 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR đa mồi. Giếng ĐC: đối chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng 1-30: mẫu T1-T30; M: thang chuẩn ADN 100 bp (Fermentas).
Quan sát Hình 18 chúng tôi nhận thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng 700 bp chứng tỏ ADN tách chiết đạt chất lƣợng và thao tác PCR đảm bảo độ tin cậy. Trong tổng số 30 mẫu có 15 mẫu không đột biến, 10 mẫu đột biến đơn và 5 mẫu đột biến kép (Bảng 10).
Bảng 10: Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30 mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng PCR đa mồi
Kết quả PCR đa mồi Loại đột biến Tên mẫu
Không đột biến T1, T3, T7, T8, T10, T11, T13, T16, T18, T20, T21, T22, T26, T27, T28 Đột biến đơn Cd 17 T2, T4, T19, T30 Cd 26 T25, T29 Cd 41-42 T5, T6, T12, T17 Đột biến kép Cd 17 và Cd 26 T14 Cd 17 và Cd 41-42 T9, T15, T24 Cd 26 và Cd 41-42 T23
Để khẳng định chắc chắn hơn về tính chính xác của các mồi thiết kế, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên mẫu T9 (đột biến kép tại Cd 17 và Cd 41-42) để xác định trình tự. Trƣớc tiên, chúng tôi sử dụng ADN tổng số của mẫu T9 làm khuôn trong PCR khuếch đại trình tự 700 bp của gen β-globin bằng cặp mồi CD F/R. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 11.
Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R khuếch đại đoạn gen β-globin kích thƣớc 700 bp
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 7,9 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 CD F 10 µM 0,3 CD R 10 µM 0,3
GoTaq Flexi ADN
polymerase 5 u/µl 0,1
ADN 20 - 50 ng
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit High pure PCR cleanup micro (Roche) và điện di kiểm tra trên gel agarose 2% (Hình 19).
Hình 19: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R. Giếng 9: mẫu T9; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
Sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc dùng trực tiếp để xác định trình tự với mồi CD F. Kết quả giải trình tự đƣợc trình bày trong Phụ lục. So sánh trình tự nucleotide thu đƣợc với ngân hàng dữ liệu (Hình 20) cho thấy đoạn ADN nhân từ cặp mồi chúng tôi thiết kế tƣơng đồng với trình tự gen β-globin của ngƣời. Đoạn ADN này mang đột biến Cd 17: nucleotide A (trên trình tự gốc) thay thế bởi nucleotide T và đột biến Cd 41-42 mất 4 nucleotide TCTT trên gen β-globin. Đây cũng chính là hai đột biến chúng tôi đã phát hiện đƣợc trên mẫu T9 bằng kỹ thuật PCR đa mồi (Hình 18). Kết quả này một lần nữa khẳng định tính chính xác của các mồi dùng trong nghiên cứu. Kết quả sàng lọc đột biến trên các mẫu đảm bảo độ tin cậy, không có hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả. Từ đây chúng tôi dùng một số mẫu đã sàng lọc để thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngƣợc với ba cặp đầu dò đã thiết kế (Bảng 4).
Hình 20: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi CD F/R với ngân hàng dữ liệu NCBI. Query: Trình tự đoạn 700 bp nhân lên từ mẫu T9 bằng phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R; Sbjct: Trình tự đoạn gen β-globin của ngƣời ; Identities: độ tƣơng
đồng tính theo tỷ lệ % các nucleotide giống nhau trên tổng số nucleotide đƣợc so sánh.
3.2.2. Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quá trình lai điểm ngược
Nhƣ đã trình bày ở mục 3.2.1, cặp mồi CD F/R đƣợc chúng tôi thiết kế để khuếch đại vùng tập trung các đột biến phổ biến trên gen β-globin, trong đó có đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]. Sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R và ADN tách từ mẫu bệnh phẩm đƣợc chúng tôi sử dụng làm trình tự đích để xác định các đột biến bằng kỹ thuật lai điểm ngƣợc. Để thực hiện đƣợc điều đó, chúng tôi đã thiết kế ba cặp đầu dò tƣơng ứng với ba loại đột biến. Mỗi cặp gồm một đầu dò bình thƣờng (bổ sung với trình tự trên gen β- globin của ngƣời bình thƣờng) và một đầu dò đột biến (bổ sung với trình tự trên gen
β-globin của ngƣời bệnh β-thalassemia). Với mỗi cặp đầu dò nhƣ vậy, kỹ thuật lai điểm không chỉ phát hiện đƣợc trình tự đích có mang đột biến mà còn có thể phân biệt đột biến đồng hợp và dị hợp.
Trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc, đầu dò đƣợc cố định trên màng trong khi trình tự đích tồn tại "tự do" trong dung dịch đệm lai. Yêu cầu đặt ra là đầu dò phải "bám" đƣợc trên màng, tránh bị rửa trôi bởi các bƣớc (rửa màng, "khóa" màng... ) trong suốt quá trình lai điểm ngƣợc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế đầu dò mang nhóm amin ở đầu 5'. Màng nylon Biodyne C (Pall) sau khi đƣợc hoạt hóa bằng dung dịch EDC 16% sẽ "bộc lộ" các nhóm carboxyl. Cấu trúc amin ở đầu 5' giúp đầu dò hình thành liên kết với nhóm carboxyl, từ đó giúp chúng cố định trên màng.
Trình tự đích (đoạn gen β-globin) đƣợc đánh dấu nhờ phản ứng PCR có mặt biotin-11-dUTP (Bảng 12). Chúng tôi lựa chọn ba loại mẫu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo, bao gồm mẫu T1 không đột biến; mẫu T2 mang đột biến đơn (đột biến Cd 17), mẫu T5 (đột biến Cd 41-42) và mẫu T25 (đột biến Cd 26); mẫu T9 mang đột biến kép (đột biến Cd 17/Cd 41-42), mẫu T14 (đột biến Cd 17/Cd 26) và mẫu T23 (đột biến Cd 16/Cd 41-42).
Bảng 12: Thành phần và điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 7,9 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút