luận án tiến sĩ nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ) TRONG RAU XANH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 9.44.01.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Nguyễn Quang Trung TS Vũ Đức Nam Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài Luận án “Nghiên cứu xây dựng phát triển số phương pháp phân tích chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) rau xanh” thực với hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Quang Trung TS Vũ Đức Nam Các kết nghiên cứu luận án trung thực, không trùng lặp chép với cơng trình khoa học khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Lê Văn Nhân ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận án, nghiên cứu sinh nhận đƣợc hỗ trợ giúp đỡ từ nhiều cá nhân tập thể; nghiên cứu sinh trân trọng biết ơn hỗ trợ giúp đỡ Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến thầy giáo PGS TS Nguyễn Quang Trung, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hƣớng cho tơi q trình nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Vũ Đức Nam, ngƣời quan tâm, nhắc nhở, hƣớng dẫn động viên tơi sớm hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ tạo điều kiện mặt thời gian, sở vật chất, trang thiết bị phục vụ cho việc nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học Cơng nghệ mời giảng viên có nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên sâu giảng dạy cho nghiên cứu sinh nhƣ bố trí thời gian học tập linh hoạt phổ biến thông tin kịp thời tới nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị em bạn bè, đồng nghiệp động viên, khích lệ, cổ vũ giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận án Con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cha mẹ, vợ, con, anh chị em ngƣời thân ln động viên, khích lệ cổ vũ hồn thành chƣơng trình đào tạo nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu sinh Lê Văn Nhân iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng thực vật 1.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý chất kích thích sinh trƣởng thực vật .3 1.2.1 Đặc điểm, tính chất hóa lý chất thuộc nhóm auxin 1.2.2 Đặc điểm, tính chất hóa lý chất thuộc nhóm gibberellin 1.2.3 Đặc điểm, tính chất hóa lý chất thuộc nhóm cytokinin .7 1.3 Vai trị chức chất kích thích sinh trƣởng thực vật 1.3.1 Vai trò chức chất thuộc nhóm auxin 1.3.2 Vai trị chức chất thuộc nhóm gibberellin .10 1.3.3 Vai trò chức chất thuộc nhóm cytokinin 11 1.4 Các nghiên cứu tác dụng chất kích thích sinh trƣởng thực vật .11 1.4.1 Các nghiên cứu tác dụng chất thuộc nhóm auxin .11 1.4.2 Các nghiên cứu tác dụng chất thuộc nhóm gibberellin 14 1.4.3 Các nghiên cứu tác dụng chất thuộc nhóm cytokinin 15 1.5 Các nghiên cứu dƣ lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật 17 1.6 Các phƣơng pháp phân tích chất kích thích sinh trƣởng thực vật 18 1.6.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 18 1.6.1.1 Thu thập mẫu 19 1.6.1.2 Chiết tách 19 1.6.1.3 Làm tinh chế mẫu 19 1.6.2 Phƣơng pháp phân tích 20 1.6.2.1 Phương pháp phân tích hợp chất auxin 21 1.6.2.2 Phương pháp phân tích hợp chất gibberellin 22 1.6.2.3 Phương pháp phân tích hợp chất cytokinin 23 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất thí nghiệm 25 iv 2.1.1 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 25 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 25 2.1.2.1 Hóa chất 25 2.1.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 26 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2.2 Đối tƣợng phân tích 27 2.2.3 Thu thập mẫu 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện tối ƣu quy trình phân tích 28 2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện khối phổ 28 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký lỏng .28 2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu 30 2.3.3 Phƣơng pháp xây dựng xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 32 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá dƣ lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau thu thập Hà Nội 35 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến phát triển số loại rau mức độ tích lũy chúng 36 2.3.5.1 Bố trí thí nghiệm 36 2.3.5.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thực vật đến phát triển loại rau 38 2.3.5.3 Phương pháp đánh giá tích lũy chất kích thích sinh trưởng thực vật loại rau 38 2.3.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 39 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu quy trình phân tích chất kích thích sinh trƣởng thực vật rau 40 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích khối phổ 40 3.1.1.1 Khảo sát mức lượng phân mảnh ion 40 3.1.1.2 Khảo sát hướng phân mảnh chất KTST 45 3.1.1.3 Khảo sát thơng số nguồn ion hóa 56 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 57 3.1.2.1.Khảo sát cột phân tích dung mơi pha động 57 3.1.2.2 Khảo sát chế độ gradient pha động 66 v 3.2 Tối ƣu hóa điều kiện xử lý mẫu 69 3.3 Xây dựng xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 74 3.3.1 Xây dựng quy trình phân tích đồng thời chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau 74 3.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng quy trình phân tích 77 3.3.2.1 Đánh giá độ ổn định chu kỳ đông/rã đông mẫu .77 3.3.2.2 Đường chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng 79 3.3.2.3 Ảnh hưởng mẫu 81 3.3.2.4 Hiệu suất thu hồi độ xác phương pháp phân tích 83 3.3.2.5 So sánh với số phịng thí nghiệm 86 3.4 Kết đánh giá trạng dƣ lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau thu thập Hà Nội 89 3.4.1 Số lƣợng mẫu rau phát chứa chất kích thích sinh trƣởng thực vật 89 3.4.2 Số lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát đƣợc mẫu rau cải xanh 90 3.4.3 Hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật phát đƣợc mẫu rau cải xanh 91 3.4.4 Sự tồn dƣ nhiều hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau cải xanh khu vực nghiên cứu 93 3.5 Đánh giá ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng thực vật đến phát triển số loại rau mức độ tích lũy chúng 97 3.5.1 Ảnh hƣởng GA3 đến phát triển số loại rau xanh 97 3.5.1.1 Ảnh hưởng GA3 đến phát triển rau cải xanh 97 3.5.1.2 Ảnh hưởng GA3 đến phát triển rau mồng tơi 100 3.5.1.3 Ảnh hưởng GA3 đến phát triển rau xà lách 102 3.5.2 Sự tích lũy GA3 số loại rau 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .110 ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN 111 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO 114 PHỤ LỤC 128 PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU 128 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT 133 vi PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN 139 PHỤ LỤC ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ NGHIỆM 144 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU 145 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu 2,4,5-T 2,4,5-Trichloro 2,4-D 2,4-Dichloroph 4-CI-IAA 4-Chloroindole AIA β-Indolyaxetic APCI Atmospheric P BA N6-Benzylade Ctv Et al DHZR Dihydrozeatin EI Electron Ioniza ELISA Enzym Link Im ESI Electrospray Io FLD Flourescence D GA1 Gibberellin A1 GA3 Gibberellin A3 GA4 Gibberellin A4 GA7 Gibberellin A7 GAs Gibberellin GC Gas Chromato HPLC High Performa IAA Indole-3-acetic IBA Indole-3-butyr ICA Indole-3-carbo iP N6-Isopenteny IPA Indole-3-propi iPR Isopentenylade IT MS Ion Trap Mass K Kinetin KTST Plant growth s LFMCE Leaf-Ferrocene Electrode Multiple React MRM 131 tốc độ 100 vòng.phút-1 thời gian 30 phút, nhiệt độ 4oC Tiến hành siêu âm mẫu thời gian phút Bƣớc 4: Thực ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 điều kiện nhiệt độ 4oC thời gian phút Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1mL phần dung dịch suốt lớp phía ống teflon thí nghiệm cho vào eppendorf đựng mẫu tích mL Bƣớc 5: Thêm mL dung dịch Dichloromethane rung lắc mẫu thời gian 30 phút nhiệt độ 4oC, sau đó, tiếp tục chiết siêu âm thời gian phút Bƣớc 6: Thực ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 thời gian phút, có hai lớp chất lỏng khác đƣợc hình thành sau ly tâm mảnh vụn thực vật phân bố hai lớp Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút mL phần dung dịch suốt lớp phía ống teflon thí nghiệm, sau cho vào eppendorf đựng phần dung dịch hút bƣớc Tiến hành xoáy mẫu máy Votex thời gian phút để trộn lẫn hai phần dung dịch với Sau đó, dùng micropipet hút mL mẫu cho vào lọ đựng mẫu 1,5 mL để phân tích máy HPLC-ESI-MS2 Bƣớc 7: Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút mL phần dung dịch lớp phía dƣới ống teflon thí nghiệm, sau cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 mL Tiến hành cạn dịng khí nitơ, hồ tan chất sau cô cạn mL dung môi MeOH Bƣớc 8: Thực lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm trƣớc phân tích thiết bị HPLC-ESI-MS2  Hàm lƣợng chất phân tích đƣợc xác định tổng hàm lƣợng chất thu đƣợc phân đoạn đƣợc thực bƣớc 4, bƣớc Tính tốn kết Hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật mẫu rau xanh đƣợc tính tốn theo đƣờng ngoại chuẩn Kết nghiên cứu đƣợc trình bày dƣới dạng TB ± độ lệch chuẩn (SD) Trong đó, giá trị trung bình đƣợc tính theo cơng thức sau: aa  a    a n n Trong đó: a trung bình cộng a1, a2, , an giá trị xác định tƣơng ứng lần thứ 1, 2, , n n số số hạng Cơng thức tính giá trị trung vị: Trong đó: Me số trung vị X n lƣợng biến đứng vị trí X n 2  lƣợng biến đứng vị trí Báo cáo kết Bản báo cáo kết gồm có thơng tin sau: 1) Thông tin đối tƣợng mẫu thu thập 2) Phƣơng pháp phân tích 3) Kết phân tích mẫu 133 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT Gradient 1: Từ bắt đầu đến phút 10% MeOH, sau từ đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH phút đƣa điều kiện ban đầu 0,5 phút trì cho hết chu trình gradient Tốc độ dịng dung mơi 0,1 mL/phút Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.1) Hình 2.1 Chu trình dung mơi gradient (Ion âm) 20000 RT: 0.00 - 15.08 10000 0.40 1.01 20000 10000 0.73 2000 1000 1.11 Intensity 4000 2000 0.40 1.01 0.42 1.14 1500 1000 500 3000 2000 1000 3000 2000 1000 1000 0.47 0 Time (min) Hình 2.2 Sắc ký đồ chất KTST theo chế độ gradient 134 Nhận xét: Tín hiệu chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động khoảng: 3,75-6,96 phút Tuy nhiên, hợp chất IPA rửa giải chƣa hoàn toàn Gradient 2: Từ bắt đầu đến phút 20% MeOH, sau từ đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH phút đƣa điều kiện ban đầu 0,5 phút trì cho hết chu trình gradient Tốc độ dịng dung mơi 0,1 mL/phút Tổng thời gian 15 phút Hình 3.3 Chu trình dung mơi gradient (Ion âm) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 (Ion dƣơng) iP K tZ BA iPR tZR DHZR Hình 2.4 Sắc ký đồ chất KTST theo chế độ gradient 135 Nhận xét: Tín hiệu chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động khoảng: 3,42-6,96 phút Tuy nhiên, hợp chất IPA chƣa rửa giải hoàn toàn Gradient 3: Từ bắt đầu đến phút 30% MeOH, sau từ đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH phút đƣa điều kiện ban đầu 0,5 phút trì cho hết chu trình gradient Tốc độ dịng dung mơi 0,1 mL/phút Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.5) Hình 2.5 Chu trình dung môi gradient (Ion âm) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 (Ion dƣơng) iP K tZ BA iPR tZR DHZR Hình 2.6 Sắc ký đồ chất PGR theo chế độ gradient 136 Nhận xét: Tín hiệu chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động khoảng: 3,07-6,31 phút Tất hợp chất phân tích đƣợc rửa giải hồn tồn píc gọn, sắc nét, cân đối, rõ ràng, độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,5 phút Gradient 4: Từ bắt đầu đến phút 30% MeOH, sau từ đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH phút đƣa điều kiện ban đầu 0,5 phút trì cho hết chu trình gradient Tốc độ dịngdungmơi0,3 mL/phút Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.7) (Ion âm (Ion dƣơng) Hình 2.8 Sắc ký đồ chất KTST theo chế độ gradient 137 Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm khơng xuất tín hiệu sắc ký đồ Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng có tín hiệu píc sắc ký đƣợc rửa giải sớm so với tốc độ dòng 0,1 mL/phút với thời gian lƣu khoảng 1,5 phút Gradient 5: Từ bắt đầu đến phút 30% MeOH, sau từ đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH phút đƣa điều kiện ban đầu 0,5 phút trì cho hết chu trình gradient Tốc độ dịng dung mơi 0,5 mL/phút Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.9) Hình 2.9 Chu trình dung mơi gradient (Ion âm) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 (Ion dƣơng) iP K tZ BA iPR tZR DHZR Hình 2.10 Sắc ký đồ chất PGR theo chế độ gradient 138 Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm khơng xuất tín hiệu sắc ký đồ Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng đƣợc phát thời gian lƣu từ 0,8 đến 1,2 phút; sớm so với điều kiện gradient 139 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN 144 PHỤ LỤC ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ NGHIỆM Hình 4.1 Đƣờng chuẩn GA3 mẫu rau thí nghiệm 145 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU Hệ thống sắc ký lỏng HPLC-ESI-MS Máy ly tâm Cột C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) Ct Purospher đ RP-18 endcapped (5 àm, 250 x 4,6 mm) Bộ cô mẫu nitơ Micropipette đơn kênh Máy lọc nƣớc siêu Cân phân tích Hình 5.1 Một số thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 146 Hình 5.2 Một số hình ảnh bố trí thí nghiệm 147 Hình 5.3 Một số hình ảnh khảo sát thu thập mẫu ... CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài Luận án ? ?Nghiên cứu xây dựng phát triển số phương pháp phân tích chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) rau xanh? ?? thực với hƣớng dẫn PGS TS... chất sử dụng sản xuất nông nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, nghiên cứu sinh đề xuất thực đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng phát triển phương pháp phân tích số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin,. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ VĂN NHÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG (AUXIN, GIBBERELLIN, CYTOKININ)