Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt

Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh Vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Quỳnh NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƢỚC SINH HOẠT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Quỳnh NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƢỚC SINH HOẠT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Tâm Thƣ GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội - 2018 ii LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Tâm Thƣ GS.TS Phan Tuấn Nghĩa tận tình bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh truyền đạt cho tơi kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thủ trƣởng Viện Cơng nghệ mới, cán Phịng, Ban đặc biệt đồng chí thuộc Phịng Cơng nghệ sinh học và Phịng Cơng nghệ Hóa sinh ngƣời tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi nhiều để tơi hồn thành luận văn nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, ngƣời quan tâm, ủng hộ để tơi hồn thành luận văn nghiên cứu Luận văn nghiên cứu đƣợc thực với hỗ trợ kinh phí đề tài thuộc chƣơng trình AN-QP Thành phố Hồ Chí Minh năm 2015: "Nghiên cứu chế tạo kit phát nhanh số vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột nguồn nƣớc sinh hoạt, ứng dụng cho đội đóng quân đảo lực lƣợng tàu ngầm" Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Trần Thị Thanh Quỳnh iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG iii BẢNG VIẾT TẮT v MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Vibrio cholerae 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm sinh học 1.1.2 Khả gây bệnh 1.1.3 Tình hình dịch bệnh tả 1.2 Các phƣơng pháp xác định Vibrio cholerae 1.2.1 Phƣơng pháp soi kính 1.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập 1.2.3 Phƣơng pháp xác định nhóm huyết 10 1.2.4 Phƣơng pháp PCR 11 1.2.5 Phƣơng pháp lai khuẩn lạc với đầu dò DNA RNA 12 1.2.6 Phƣơng pháp lai huỳnh quang chỗ 12 1.2.7 Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp - Đếm trực tiếp 13 1.2.8 Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp 13 1.2.9 Phƣơng pháp ELISA 14 1.2.10 Phƣơng pháp sắc ký miễn dịch 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 19 2.2 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 19 2.2.1 Nguyên liệu 19 2.2.2 Hóa chất 19 i 2.2.3 Thiết bị 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Lấy mẫu để phân lập vi khuẩn 20 2.3.2 Phân lập Vibrio cholerae 20 2.3.3 Xác định trình tự gen 16S rARN chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 20 2.3.4 Xác định môi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V cholerae 22 2.3.5 Đánh giá phản ứng V cholerae - kháng thể phƣơng pháp ELISA 22 2.3.6 Phƣơng pháp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 23 2.3.7 Phƣơng pháp cộng hợp vàng vào kháng thể 23 2.3.8 Xác định nồng độ tối ƣu kháng thể gắn lên màng nitrocellulose 24 2.3.9 Phân tích mẫu que thử 24 2.3.10 Phƣơng pháp xác định ngƣỡng phát que thử 25 2.3.11 Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu que thử 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Phân lập vi khuẩn V cholerae 26 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn V cholerae từ số nguồn ô nhiễm 26 3.1.2 Xác định trình tự gen 16S rARN chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 26 3.2 Xác định môi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V cholerae 30 3.3 Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể phù hợp phƣơng pháp ELISA để phát vi khuẩn V cholerae 32 3.4 Chế tạo que thử phát V cholerae nguồn nƣớc sinh hoạt 33 3.4.1 Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose 33 3.4.2 Tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano cộng hợp vào kháng thể 34 3.4.3 Tối ƣu nồng độ kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng 37 3.4.4 Tối ƣu nồng độ kháng thể gắn lên vạch thử nghiệm 38 ii 3.4.5 Đánh giá số tiêu kỹ thuật que thử 39 3.4.5.1 Ngưỡng thời gian phát 39 3.4.5.2 Đánh giá độ đặc hiệu que thử 41 KẾT LUẬN 44 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae Hình 1.2 Cấu tạo độc tố Vibrio cholerae Hình 1.3 Cơ chế gây bệnh Vibrio cholerae Hình 1.4 Vibrio cholerae mơi trƣờng chọn lọc Hình 1.5 Cấu tạo que thử dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch 15 Hình 1.6 Bộ kit dùng để phát nhanh E coli O157 Hãng DuPont 18 Hình 1.7 Quy trình sử dụng kit phát nhanh E coli O157 Hãng DuPont 18 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 22 Hình 3.1 Sự phát triển vi khuẩn V cholerae mơi trƣờng thạch TCBS 26 Hình 3.2 Kết tách chiết DNA tổng số 27 Hình 3.3 Kết nhân gen 16S rRNA vi khuẩn V cholerae 28 Hình 3.4 Kết so sánh trình tự nucletide gen 16S rRNA từ mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc với trình tự nucleotide tƣơng ứng ngân hàng gen giới (sử dụng phần mềm ClustalW) 28 Hình 3.5 Sự tăng sinh tế bào Vibrio cholerae chuẩn (ATCC 9458) môi trƣờng khác 31 Hình 3.6 Sự tăng sinh tế bào Vibrio cholerae O1 mơi trƣờng khác 31 Hình 3.7 Sự tăng sinh tế bào Vibrio cholerae HP mơi trƣờng khác 32 Hình 3.8 Hình ảnh ELISA đánh giá bắt cặp Vibrio cholerae kháng thể đặc hiệu 33 Hình 3.9 Hình ảnh cố định kháng thể KT3 lên màng nitrocellulose 34 Hình 3.10 Q trình tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano 34 Hình 3.11 Hình ảnh hạt vàng soi dƣới kính hiển vi điện tử 35 Hình 3.12 Phản ứng kháng thể cộng hợp vàng vạch kiểm chứng màng nitrocellulose 37 Hình 3.13 Kết tối ƣu lƣợng kháng thể cố định vị trí vạch kiểm chứng iii 38 Hình 3.14 Kết tối ƣu lƣợng kháng thể cố định vị trí vạch thử nghiệm 39 Hình 3.15 Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại 40 Hình 3.16 Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại 40 Hình 3.17 Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử phát V cholerae 42 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Số trƣờng hợp mắc bệnh tử vong dịch bệnh tả theo công bố WHO năm 2011 Bảng 3.1 Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại 03 chủng V cholerae 41 Bảng 3.2 Độ đặc hiệu que thử phát V cholerae iv 42 BẢNG VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt BSA Bovine serum albumin Abumin huyết bò cAMP Cyclic adenosine monophosphate AMP vòng Cystic fibrosis transmembrane Nhân tố điều hòa vận chuyển regulator màng xơ nang CFU Colony forming unit Khuẩn lạc DNA Deoxyribonucleic acid ADN ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELISA HRP Horseradish peroxidase Peroxidase củ cải ngựa Anti-Vibrio Cholerae antibody Kháng thể đơn dòng kháng (ABIN1825015) V cholerae Anti-Vibrio Cholerae antibody Kháng thể đơn dòng kháng (ABIN1825014) V cholerae Goat anti-mouse IgG (HRP) Kháng thể đa dòng kháng IgG (Ab6789) chuột có gắn HRP PBS Phosphate buffered saline Đệm photphat PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN ribosome SDS Sodium dodecyl sulfate Natri laureth sunfat TMB 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine Cơ chất TMB WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới CFTR KT1 KT2 KT3 v MỞ ĐẦU Vi khuẩn tả Vibrio cholerae đƣợc Robert Koch tìm năm 1884 Đức [27] Thế kỷ XIX xảy vụ dịch lớn châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử vong Ở Việt Nam, bệnh tả xuất từ năm 1850 bùng phát thành dịch nhiều tỉnh, thành nhiều năm khiến hàng trăm ngƣời tử vong Năm 2007 dịch lại bùng phát 19 tỉnh/thành phố phía Bắc có hàng ngàn trƣờng hợp mắc bệnh Ngày nay, vi khuẩn tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nƣớc uống Hàng năm, giới ƣớc tính khoảng - triệu trƣờng hợp mắc bệnh 100.000 - 120.000 trƣờng hợp tử vong bệnh tả [51] Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ đến ngày, nhiều khả bùng phát dịch bệnh Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân chất nôn ngƣời bệnh từ ổ chứa thiên nhiên nhƣ số động vật thủy sinh, lồi nhuyễn thể (cá, cua, trai sị, ngao ) vùng cửa sông ven biển Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp tính, khơng phát chữa trị kịp thời dẫn đến tử vong Vì vậy, việc phát có mặt vi khuẩn tả V cholerae nguồn nƣớc thực phẩm cần thiết Hiện Việt Nam nhƣ giới có nhiều phƣơng pháp phát vi khuẩn tả nhƣ: soi tƣơi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết học, PCR, ELISA, sắc ký miễn dịch [4, 5, 12, 21, 40] Mỗi phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm riêng Trong phƣơng pháp PCR phƣơng pháp đƣợc áp dụng phổ biến, có độ nhạy độ đặc hiệu cao Hiện thị trƣờng có kit phát vi khuẩn tả V cholerae phƣơng pháp PCR nhƣ kit hãng: VeTeKTM, Genesig Tuy nhiên, phƣơng pháp địi hỏi máy móc, trang thiết bị đại kỹ thuật viên có trình độ chun mơn cao, khó áp dụng ngồi trƣờng Mặt khác, tình trạng ngộ độc thực phẩm có nguy xảy cao ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời thực phẩm ô nhiễm ngày nhiều việc kiểm sốt vệ sinh an tồn thực phẩm cịn chƣa thực chặt chẽ Chính vậy, phƣơng pháp đơn giản, áp dụng trực tiếp trƣờng hay Vạch C a b c d Hình 3.12: Phản ứng kháng thể cộng hợp vàng vạch kiểm chứng màng nitrocellulose a: Màng chƣa xử lý + Kháng thể KT1 b: Màng chƣa xử lý + Kháng thể KT2 c: Màng xử ký + Kháng thể KT1 d: Màng xử lý + Kháng thể KT2 3.4.3 Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng Kháng thể KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose với nồng độ khác (0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm 0,3 µg/mm) để lựa chọn lƣợng kháng thể thấp dùng cho que thử mà vạch kiểm chứng xuất rõ Sau cố định KT3, que thử đƣợc nhỏ trực tiếp 10 µl KT1 cộng hợp vàng 20 µg/ml vào đầu que Kết cho thấy rằng, sau khoảng phút vạch kiểm chứng xuất rõ que thử số 3, cịn que thử số vạch có xuất nhƣng khơng đƣợc rõ nét (Hình 3.13) Để tiết kiệm chi phí cho việc sản xuất que thử, thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi lựa chọn nồng độ KT3 sử dụng cho lần cố định lên màng nitrocellulose 0,2 µg/mm Đối với que thử có chiều rộng mm tƣơng đƣơng với lƣợng kháng thể 0,6 µg/que Trong nghiên cứu Trần Thị Sao Mai cộng (2015), kháng thể IgY kháng BSA đƣợc sử dụng làm kháng thể phun vị trí vạch kiểm chứng với nồng độ tối ƣu 0,3 µg/mm tƣơng dƣơng với 1,2 µg/que thử rộng 4mm 37 Vạch C Hình 3.13: Kết tối ƣu lƣợng kháng thể cố định vị trí vạch kiểm chứng Nồng độ kháng thể µg/mm Nồng độ kháng thể 0,05 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,1 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,2 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,3 µg/mm 3.4.4 Tối ưu nồng độ kháng thể gắn lên vạch thử nghiệm Sau lựa chọn đƣợc lƣợng kháng thể cố định lên vạch kiểm chứng, tiếp tục tối ƣu lƣợng kháng thể cố định lên vạch thử nghiệm với phƣơng pháp cụ thể là: KT3 đƣợc cố định lên màng nitrocellulose vị trí vạch kiểm chứng với lƣợng 0,2 µg/mm Đồng thời KT1 KT2 đƣợc cố định vị trí vạch thử nghiệm với nồng độ khác là: 0,05 µg/mm; 0,1 µg/mm; 0,2 µg/mm 0,3 µg/mm Sau đó, que thử đƣợc nhúng vào giếng có chứa dung dịch bao gồm: 10 µl dịch ni vi khuẩn V chlerae 108 CFU/ml 10 µl KT2 cộng hợp vàng 20 µg/ml que thử có vạch thử nghiệm KT1 10 µl KT1 cộng hợp vàng 20 µg/ml que thử có vạch thử nghiệm KT2 Kết cho thấy rằng, lƣợng kháng thể KT1 thấp dùng cho vạch thử nghiệm 0,2 µg/mm tƣơng đƣơng với 0,6 µg/que thử có độ rộng mm (Hình 3.14) Kết tƣơng tự đƣợc ghi nhận vạch thử nghiệm kháng thể KT2 38 Vạch C Vạch T Hình 3.14: Kết tối ƣu lƣợng kháng thể cố định vị trí vạch thử nghiệm Nồng độ kháng thể µg/mm Nồng độ kháng thể 0,05 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,1 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,2 µg/mm Nồng độ kháng thể 0,3 µg/mm Kết nghiên cứu tối ƣu nồng độ kháng thể phù hợp với kết công bố nghiên cứu Trần Thị Sao Mai cộng [3] xác định lƣợng kháng thể IgY kháng độc tố tụ cầu vàng (SEA, SEB, SEC, SED SEE) cần cố định vị trí vạch thử nghiệm 0,6 µg/que thử rộng mm 3.4.5 Đánh giá số tiêu kỹ thuật que thử 3.4.5.1 Đánh giá ngưỡng thời gian phát que thử Sau tạo đƣợc loại que thử (bao gồm màng nitrocellulose màng thấm hút trên): Loại (dùng KT1 làm kháng thể phát KT2 làm kháng thể bắt giữ) loại (ngƣợc lại so với que thử loại 1), tiến hành đánh giá khả phát vi khuẩn V cholerae chuẩn (ATCC 9458) loại que thử Kết cho thấy, hai loại que thử có khả phát vi khuẩn V cholerae, vạch màu bắt đầu xuất sau phút trở nên rõ nét sau phút Tuy nhiên, que thử loại cho phép phát ngƣỡng nồng độ 105 CFU/ml (Hình 3.15), que thử loại phát đến 106 CFU/ml, thời gian phát từ - phút (Hình 3.16) Kết phù hợp với kết tăng sinh tế bào vi khuẩn V cholerae, sau - nuôi cấy số lƣợng tế bào đạt đƣợc từ 106 - 107 CFU/ml 39 Que thử loại tiếp tục đƣợc thử nghiệm với chủng V cholerae O1 chủng V cholerae HP môi trƣờng pepton kiềm nƣớc sinh hoạt Kết cho thấy, que thử cho kết dƣơng tính mẫu chứa vi khuẩn V cholerae 105 CFU/ml (Bảng 3.1) Nhƣ vậy, sử dụng trực tiếp que thử để phát vi khuẩn V cholerae phát đến 105 CFU/ml Trong khi, với nồng độ vi khuẩn tả ruột đạt khoảng 102 - 103 CFU/ ml gây bệnh [2] Chính vậy, bƣớc tiến hành ni cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn môi trƣờng pepton kiềm quan trọng, làm tăng độ nhạy que thử, cụ thể que thử phát đƣợc mẫu chứa vi khuẩn V cholerae có nồng độ từ - CFU/ml sau - Hình 3.15: Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại (dùng KT1 làm kháng thể phát KT2 làm kháng thể bắt giữ) 108 107 106 105 CFU/ml Hình 3.16: Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại (dùng KT2 làm kháng thể phát KT1 làm kháng thể bắt giữ) 40 Bảng 3.1: Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử loại 03 chủng V cholerae Môi trƣờng Pepton kiềm Nƣớc sinh hoạt Nồng độ (CFU/ml) 108 107 106 105 104 107 106 105 104 V cholerae chuẩn 3/3 3/3 3/3 3/3 1/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V cholerae O1 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 V cholerae HP 3/3 3/3 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 Số que thử dƣơng tính (lặp lại 03 lần) Kết đánh giá ngƣỡng phát que thử nghiên cứu tƣơng đồng với kết nghiên Chakraborty cộng với ngƣỡng phát 107 CFU/ml, mẫu có nồng độ < 10 CFU/ml cần ni cấy tăng sinh mơi trƣờng pepton kiềm 24 để phát [12]; Amanda Debes cộng tạo thành công que thử có ngƣỡng phát 106 CFU/ml chủng V cholerae O1 107 CFU/ml chủng V cholerae O139 với thời gian phát 5-10 phút Để đảm bảo mẫu dƣơng tính cho kết mẫu đƣợc ủ mơi trƣờng pepton kiềm từ 5-8 tiếng để khuếch đại tín hiệu cách tăng nồng độ vi khuẩn mẫu [21] 3.4.5.2 Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật que thử Độ đặc hiệu que thử đƣợc đánh giá qua khả có phản ứng chéo với vi khuẩn khác Các vi khuẩn đƣợc sử dụng nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu que thử số vi khuẩn gây bệnh nhƣ Salmonella, Shigella, Listeria, Klebsiella, S aureus E coli Độ đặc hiệu kỹ thuật que thử tỷ lệ phần trăm số que thử âm tính với vi khuẩn khác tổng số que thử thử nghiệm Kết độ đặc hiệu que thử phát V cholerae đƣợc trình bày Bảng 3.2 Hình 3.17 41 Bảng 3.2 Độ đặc hiệu que thử phát V cholerae Chủng Que thử V cholerae Salmonella Số que thử dƣơng tính (3 lần lặp lại) Shigella Listeria Klebsiella S aureus 0/3 0/3 0/3 1/3 E coli 0/3 0/3 Hình 3.17 Kết đánh giá độ đặc hiệu que thử phát V cholerae (1: Salmonella, 2: Shigella, 3: Listeria, 4: Klebsiella, 5: S aureus, 6: E coli) Kết trình bày Bảng 3.2 cho thấy với 18 que thử phát V cholerae khả phản ứng chéo với vi khuẩn khác (3 que/loại vi khuẩn), có que cho kết dƣơng tính với vi khuẩn Klebsiella, 17 que cho kết âm tính Từ đó, xác định độ đặc hiệu kỹ thuật que thử thử nghiệm 17/18 = 0,94 tƣơng đƣơng 94% Trong nghiên cứu Debes công [21], độ đặc hiệu que thử phát vi khuẩn V cholerae đƣợc xác định sử dụng trực tiếp với mẫu phân bệnh nhân 60% - 70% Kết đánh giá độ đặc hiệu thấp cho thấy cần phải có cải tiến trình xét nghiệm để hạn chế kết dƣơng tính giả Trên thực tế, có nhiều cơng trình nghiên cứu chế tao que thử phƣơng pháp sắc ký miễn dịch để sử dụng cho xét nghiệm tƣơng tự có độ đặc hiệu cao, chất chế hoạt động que thử dựa 42 tƣơng tác đặc hiệu sinh học kháng nguyên kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên Trong nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu xét nghiệm thƣơng mại để phát loài Cryptosporidium động vật, kết cho thấy phƣơng pháp sắc ký miễn dịch có độ đặc hiệu 100% phƣơng pháp lại EIA (enzyme immunoassay) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) có độ đặc hiệu lần lƣợt 75.9% 78.9% [20] 43 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu rút số kết luận sau đây: Đã phân lập đƣợc 01 chủng vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA tƣơng đồng 99% với trình tự gen V cholerae từ mẫu nƣớc đầm tơm Hải Phịng Đã lựa chọn đƣợc mơi trƣờng peton kiềm thích hợp cho việc tăng sinh vi khuẩn V cholerae sau nuôi cấy, số lƣợng tế bào vi khuẩn tăng từ 34 CFU/ml lên đến 106 - 107 CFU/ml Đã bƣớc đầu chế tạo thành công que thử gồm: màng nitrocellulose màng thấm hút trên, có kích thƣớc 3mm x cm, với vạch kiểm chứng kháng thể đa dịng kháng IgG chuột gắn enzyme peroxidase (Ab6789_Abcam) có nồng độ tối ƣu 0,2 µg/mm kháng thể vạch thử nghiệm kháng thể đơn dòng kháng V cholerae gây chuột (ABIN1825015) có nồng độ tối ƣu 0,2 µm/mm Kháng thể phát dùng cho que thử kháng thể đơn dòng kháng V cholerae (ABIN1825014) đƣợc cộng hợp với hạt nano vàng có kích thƣớc khoảng 20 nm đƣợc dùng µl 20 µg/ml cho 01 lần thử nghiệm Ngƣỡng phát que thử là 105 CFU/ml - phút độ đặc hiệu 94% HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Đánh giá đầy đủ độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian sử dụng khả ứng dụng vào thực tiễn que thử Tạo que thử phát tác nhân gây bệnh khác: vi khuẩn, độc tố vi khuẩn, 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Ngọc Dao (2004), Nghiên cứu chế tạo kit phát nhanh, xác vi sinh vật độc hại gây ô nhiễm khơng khí nước, Báo cáo tổng kết đề tài nhánh Đề tài cấp Nhà nƣớc, mã số KC.04.10 Nguyễn Khánh Linh (2010), “Vi khuẩn Vibrio cholerae dịch bênh tả”, Tạp chí Khoa học Ứng dụng, 13, tr 44-45 Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Lê Quang Hòa (2015), “Nghiên cứu phát triển hệ thống sắc ký miễn dịch cạnh canh phát độc tố ruột tụ cầu sữa”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 31(1), tr 23-31 Hà Thị Quyến, Dƣơng Hồng Quân, Đinh Duy Kháng, Phùng Đắc Cam, (2005),“Nghiên cứu chế tạo kit để phát nhanh vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) nƣớc”, Tạp chí Sinh học, 27(4), tr 57-60 Hà Thị Quyến (2006), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử việc định typ vi khuẩn Vibrio cholerae phân lập Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Trần Linh Thƣớc (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất Giáo dục Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Amann R I., Ludwig W., and Schleifer K H (1995), “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”, Microbiological Reviews, 59(1), pp 143-169 Baumann P., Furniss A L & Lee J V (1984), “Genus I Vibrio”, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1, pp 518-538 Binsztein N., Costagliola M., Pichel M., Jurquiza V., Ramírez F., Akselman R., Vacchino M., Huq A., Colwell R., Ram F (2004), “Viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in the aquatic environment of Applied and Environmental Microbiology, 70(12), pp 7481-7486 45 Argentina”, 10 Brayton P.R, Roszak D., Palmer L., Huq S., Grimes D., Colwell R (1986), “Fluorescent antibody enumeration of V cholerae in the marine environment”, Microbiology, 3, pp 507-514 11 CDC (1999), “for Disease Control and Prevention”, Centers of for Disease Control and Prevention, pp 136 12 Chakraborty S., Alam M., Scobie H M., Sack D A (2013),“Adaptation of a simple dipstick test detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in environmental water”, Frontiers in Microbiology, 4(320), pp 1-3 13 Chakraborty S., Mukhopadhyay A K., Bhadra R., Ghosh A., Mitra R., Shimada T., Yamasaki S., Faruque S., Takeda Y., Colwell R (2000), “Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae”, Applied and Environmental Microbiology, 66(9), pp 4022-4028 14 Ching K H., He X., Stanker L H., Lin A.V., McGarvey J.A and Hnasko R (2015), “Detection of shiga toxins by lateral flow assay”, Toxins, 7, 1163-1173 15 Choopun N., Louis V., Huq A., Colwell R (2002), “Simple procedure for rapid identification of Vibrio cholerae from the aquatic environment”, Applied and Environmental Microbiology , 68(2), pp 995–998 16 Chowdhury M A R., Hasan J A K., Huq A., Xu B., Montilla R (1994), “DVC-DFA: A simplified technique for detection of viable Vibrio cholerae O1 and O139”, Canadian Journal of Microbiology, 42, pp 87–93 17 Chun J., Huq A., Colwell R (1999), “Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp 2202–2208 18 Colwell R., Tamplin M., Brayton P., Gauzens A., Tall B., Herrington D., Levine M., Hall S., Huq A., Sack D (1990), “Environmental aspects of V cbolerae in transmission of cholera”, Advances in Research on Cbolera and Related Areas, pp 327-343 19 Dallas W., Falkow S (1980), “Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heatlabile toxin”, Nature, 288(5790), pp 46 499–501 20 Danisová O., Halánová M., Valencáková A., Luptáková L (2017), “Sensitivity, specificity and comparison of three commercially available immunological tests in the diagnosis of Cryptosporidium species in animals”, Brazilian Journal of Microbiology, pii: S1517-8382(16)30986-8 21 Debes A., Chakraborty S., Ali M., Sack D A.(2014), Manual for detecting Vibrio cholerae O1 and O139 from Fecal sample and from environmental water using a dipstick assay, the DOVE Project,based in the Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health 22 Fields P I., Popovis T., Wachsmuth K and Olsvik O (1992), “Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae 01 Strains from the Latin American Cholera Epidemic”, Journal of Clinical Microbiology, 30(8), pp 2118-2121 23 Hasan J A K., Bernstein D., Huq A., Loomis L., Tamplin M., Colwell R (1994), “Cholera DFA: An improved direct fluorescent monoclonal antibody staining kit for rapid detection and enumeration of V cholerae O1”, FEMS Microbiology Letters, 120(1-2), pp 143–148 24 Hasan J., Huq A., Nair G., Garg S., Mukhopadhyay A., Loomis L., Bernstein D., Colwell R (1995), “Development and testing of monoclonal antibody-based rapid immunodiagnostic test kits for direct detection of Vibrio cholerae O139 synonym Bengal”, Journal of Clinical Microbiology, 33(11), pp 2935–2939 25 Hasan J., Loomis L., et al (1992), Development of a fast, simple, and sensitive immunoassay to detect Vibrio cholerae O1 from clinical samples using SMART™ Kit, American Society for Microbiology, New Orleans, LA, USA 92nd 26 Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A., Chakraborty S., Basu A., Bhattacharya S., Nair G., Shimada T., Takeda Y (1998), “Development and evaluation of a multitest PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139”, FEMS Immunology & Medical Microbiology, 20(3), pp 201–207 47 27 Howard-Jones N (1984), "Robert Koch and the cholera vibrio: a centenary", British Medical Journal, 288 (6414) , pp 379-81 28 Huq A., Colwell R., Rahman R., Ali A., Chowdhury M., Parveen S., Sack D., Russek-Cohen E (1990), “Detection of Vibrio cholerae O1 in the aquatic environment by fluorescent monoclonal antibody and culture method”, Applied and Environmental Microbiology, 56(8), pp 2370–2373 29 Huq A., Haley B J., Taviani E., Chen A., Hasan N A., Colwell R R (2012), “Detection, Isolation, and Identification of Vibrio cholerae from the Environment”, Current Protocols in Microbiology, chapter: Unit6A.5 30 Keasler S P., Hall R H (1993), “Detecting and biotyping Vibrio cholerae O1 with multiplex polymerase chain reaction”, Lancet, 341(8861), pp 1661 31 Kim M., Oh H S., Park S C., Chun J (2014), “Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64(Pt 2), pp 346-51 32 Kim Y K., Lim S I., Cho I S., Cheong K M., Lee E J., Lee S., Kim J., Kim J., Jeong D., An B., An D (2015), “A novel diagnostic approach to detecting porcine epidemic diarrhea virus: the lateral immunochromatography assay”, Journal of virological methods, 225, pp 4–8 33 Kogure K., Simidu U., Taga N (1979), “A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria”, Canadian Journal of Microbiology, 25(3), pp 415–20 34 Margosch D., Moravek M., Gaenzle M C., Maertlbauer E., Vogel R F., and Ehrmann M A (2005), “Effect of High Pressure and Heat on Bacterial Toxins”, Food Technology and Biotechnology, 43(3), pp 211–217 35 Nandi B., Nandy R., Mukhopadhyay S., Nair G., Shimada T., Ghose A (2000), “Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the gene of outer membrane protein”, Journal of Clinical Microbiology, 38(11), pp 4145–4151 48 36 Parija S C (2014), Textbook of Microbiology & Immunology, Elsevier Health Sciences 37 Raphael C W., Harley Y T (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer Science + Business Media, Book: 223 38 Ren M., Xu H., Huang X., Kuang M., Xiong Y., Xu H., Chen H., Wang A (2014), “Immunochromatographic assay for ultrasensitive detection of aflatoxin B(1) in maize by highly luminescent quantum dot beads”, ACS Applied Materials and Interfaces, 6(16), pp 14215–14222 39 Rivas L., Alfredo de la Escosura-Muñiz, Serrano L., Altet L., Francino O., Armand Sỏnchez, and Arben Merkoỗ (2015), Triple lines gold nanoparticlebased lateral flow for enhanced and simultaneous Leishmania DNA detection of Leishmania DNA and endogenous control”, Nano Research, 8(11), pp 3704-3714 40 Rivera I N., Chun J., Huq A., Sack R B., Colwell R R (2001), “Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae”, Applied and Environmental Microbiology, 67(6), pp 2421-2429 41 Roszak D., Colwell R (1987), “Survival strategies of bacteria in the natural environment”, Microbiological Reviews, 51(3), pp 365–379 42 Sack R., Siddique A., Nizam A., Yunus M., Islam M, Morris J., Ali A., Huq A., Nair G., Qadri F., Faruque S., Sack D (2003), “A 4-Year Study of the Epidemiology of Vibrio cholerae in Four Rural Areas of Bangladesh”, Journal of Infectious Diseases, 187(1), pp 96–101 43 Schramm E C., Staten N R., Zhang Z., Bruce S S., Kellner C., Atkinson J P Kyttaris V., Tsokos G., Petri M., Sander C E., Olson P (2015), “A quantitative lateral flow assay to detect complement activation in blood”, Analytical Biochemistry, 477, pp 78–85 44 Shirai H., Nishibuchi M., Ramamurthy T., Bhattacharya S K., Pal S C., and Takeda Y (1991), “Polymerase chain reaction for detection of the cholera 49 enterotoxin operon of Vibrio cholerae”, Journal of Clinical Microbiology, 29(11), pp 2517-2521 45 Shukla S., Leem H., Lee J., Kim M (2014), “Immunochromatographic strip assay for the rapid and sensitive detection of Salmonella Typhimurium in artificially contaminated tomato samples”, Canadian Journal of Microbiology, 60(6), pp 399-406 46 Smith D C., Lord J M., Roberts L M., Johannes L (2004), “Glycosphingolipids as toxin receptors”, Seminars in Cell & Developmental Biology, 15(4), pp 397–408 47 Song L W., Wang Y B., Fang, L L., Wu Y., Yang L., Chen J Y., Ge S,, Zhang J,, Xiong Y,, Deng X,, Min X,, Zhang J,, Chen P,, Yuan Q,, Xia N, (2015), “Rapid fluorescent lateral-flow immunoassay for hepatitis B virus genotyping”, Analytical Chemistry 87(10), pp 5173–5180 48 Sun Z., Bai X., Chen X., McCrae D., Saaki E (2013), “A simple, specific and rapid lateral-flow immunochromatographic test method for detection of Legionella pneumophila in water samples”, International Conference on Biology Environment and Chemistry, 58, pp 125-130 49 Turkevich J., Stevenson P C., Hillie J (1951), “A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold”, Discussion of the Faraday Society, 11, pp 55-75 50 Wang D B., Tian B., Zhang Z P., Wang X Y., Fleming J., Bi, L J., Yang R., Zhang X (2015), “Detection of Bacillus anthracis spores by superparamagnetic lateral-flow immunoassays based on Road Closure”, Biosensors and Bioelectronics, 67, pp 608–614 51 WHO (2012), “Weekly epidemiological record”, World Health Organization, 87, pp 289–304 52 WHO (2017), “Weekly epidemiological record”, World Health Organization, 92, pp 477–500 50 53 Xu H S., Roberts N., Adams L., West P., Siebeling R., Huq A., Huq I M., Rahman R (1984), “An indirect fluorescent antibody staining procedure for detection of Vibrio cholerae serovar O1 cells in aquatic environmental samples”, Journal of Microbiologial Methods, 2, pp 221–231 54 http://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1081/benh-ta 55 http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/cholera-yemen-mark/en/ 56 http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/admicrob6.pdf 57 http://ydvn.net/contents/view/24321.vi-khuan-ta-vibrio-cholerae.html 58 https://mechpath.com/2015/12/01/vibrio-cholerae/ 59 https://www.cdc.gov/cholera/general/index.html 51 ... ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Quỳnh NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƢỚC SINH HOẠT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN... trƣờng công tác phát nhanh tác nhân sinh học Do vậy, để chế tạo que thử phát nhanh V cholerae chọn phƣơng án que thử nhanh Đây que thử dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch cho phép phát trực tiếp vi... cơng trình nghiên cứu việc tạo que thử phát nhanh vi khuẩn tả V cholerae phƣơng pháp sắc ký miễn dịch, lý để lựa chọn thực đề tài nhằm phát nhanh vi khuẩn tả V cholerae nguồn nƣớc sinh hoạt CHƢƠNG