Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa j02 và bắc thơm số 7

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOA Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA J02 VÀ BẮC THƠM SỐ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K48 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn : TS Bùi Tri Thức TS Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN – NĂM 2020 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 BắcThơm số 7” Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa lời chúc sức khỏe lời cảm ơn sâu sắc, với sự bảo, quan tâm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Bùi Tri Thức, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã bảo, quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em hồn thành tớt q trình thực hiện đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ và đồng hành với śt thời gian qua Trong q trình thực tập, làm báo cáo thực tập với điều kiện thời gian kinh nghiệm cịn hạn chế khơng thể tránh được sai sót Em mong nhận được sự bảo, đóng góp ý kiến của thầy bạn để em có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình để đề tài được hồn thiện phục vụ tớt công tác thực tế sau Sau cùng, em xin kính chúc q thầy, nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học Công nhệ Thực phẩm dồi sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của truyền đạt kiến thức cho hệ sau Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày… tháng ….năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Thị Hoa ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về lúa 2.1.1 Vai trò của lúa gạo 2.1.2 Giá trị kinh tế chất lượng dinh dưỡng của lúa 2.1.3 Cây trồng biến đổi gen 2.1.4 Các phương pháp - kỹ thuật biến đổi gen (chuyển gen) trồng 2.1.5 Chỉ thị chọn lọc chuyển gen vào thực vật 13 2.2 Tổng quan tình hình nước giới 14 2.2.1 Tình hình nước 14 2.2.2 Tình hình giới 18 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 iii 3.3.1 Phương pháp bớ trí thí nghiệm 24 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium 25 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 26 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy 26 3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc 27 3.3.6 Phương pháp nhuộm GUS 28 3.3.7 Hồn thiện quy trình chuyển gen 28 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 28 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn Agrobacterium 29 4.1.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 29 4.1.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc Thơm 30 4.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 31 4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 31 4.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc thơm 32 4.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy hiệu chuyển gen 33 4.3.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen của giống J02 33 4.3.2 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen của giống Bắc Thơm số 34 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen 35 iv 4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen của giống lúa J02 35 4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHẦN PHỤ LỤC v DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh tiếng Việt) CRISPER/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat GMO Genetically Modified Organisms NST Nhiễm sắc thể CT Công thức GM Genetically Modified 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 23 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống J02 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc thơm 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống Bắc Thơm số 32 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu chuyển gen của giống lúa J02 33 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của thời gian đồng lây nhiễm đến hiệu chuyển gen của giống lúa Bắc Thơm số 34 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen của giống lúa J02 35 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số 36 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Agrobacterium mang plasmid gây khới u thực vật (tumour inducing plasmid- Ti plasmid), plasmid chứa gen vir vùng gene cần chuyển (T-DNA) Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA Các tế bào tổn thương thực vật tiết hợp chất bảo vệ, hợp chất kích thích sự biểu hiện gen vir Agrobacterium Vir protein tạo T-strand một số protein vir chuyển vaoftees bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-trand tạo phức hệ (T-complex) Phức hệ vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật biểu hiện gen quan tâm .12 Hình 2.2: Sản lượng lúa gạo của Việt Nam từ năm 2013-2018 15 Hình 3.1 Sơ đờ quy trình chuyển gen lúa [6] 24 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế tác nhân làm giảm suất chất lượng lúa gạo, hiện xu hướng sử dụng giống lúa biến đổi gen được nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan tâm Một số nhà nghiên cứu đã thành công tạo giống lúa biến đổi gen như: Daisuke Tokuhara cộng sự đã tạo giớng lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có khả cung cấp kháng thể chớng Rotavirus [7]; nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]; Phan Tố Phượng cộng sự đã thành công việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc vào lúa thông qua A.tumerfaciens [17] Trên thực tế hiệu chuyển gen lúa gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ nhân nhanh hiệu tái sinh thấp, phụ thuộc khả xâm nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu biến nạp gen thấp (chỉ khoảng 11%) Ngồi ra, nghiên cứu tạo giớng trùn thớng chủ yếu dựa các phương pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu đạt được không thực sự cao Hơn nữa, giớng lúa Việt Nam cịn có hạn chế như: chịu hạn kém, hạt ngắn đem lại suất chất lượng Sử dụng một số phương pháp tạo giống như: Chỉnh sửa vector, dùng thị phân tử, gây đột biến, lai tạo chọn giống truyền thống,… còn tồn đọng một số hạn chế định Một số ứng dụng chọn giống trồng nhờ dùng thị phân tử, gây đột biến đã đạt được một số kết định có hạn chế Thách thức đặt khơng riêng Việt Nam mà vấn đề chung của q́c gia tồn giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp phải tạo nguồn lương thực lớn mà sản xuất canh tác mợt diện tích khơng thay đổi và có nguy bị thu hẹp Phương pháp chuyển gen đời được ví “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vớn gây nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo một giống trồng “hoàn hảo” chúng được kết hợp với Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định tính trạng quan tâm được chủ đợng chuyển vào lúa, từ tạo giớng lúa mang các đặc tính mong ḿn của người Vì vậy phương pháp ch̉n gen vi khuẩn Agrobacterium nuôi cấy phôi non biến nạp gen vào lúa được nghiên cứu giải pháp chọn tạo giống lúa Giải pháp sử dụng các kĩ thuật chuyển gen để cải tạo giống lúa có chứa hàm lượng vi chất dinh dưỡng cao hơn, hạt dài hơn, suất hiệu cao Hơn nữa, quy trình chuyển gen vào giớng lúa thơng qua vi kh̉n Agrobacterium có ưu điểm như: gen bị đào thải; sớ lượng tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau; tồn tại bền vững thể thực vật sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thớng protein Vir, cịn phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu dễ dàng bị tách sau Tuy nhiên cịn mợt sớ hạn chế như: có phổ cơng giới hạn; gây khối u cho hai mầm ( mợt mầm tḥc nhóm tiến hóa nhất, tích lũy nhiều chế kháng bệnh hai lá mầm bị thương tế bào có xu hướng hóa gỡ khơng phân chia mạnh để tái tạo tiếp hợp chất phenol hai lá mầm…) [10] Do vậy, tiếp tục nghiên cứu về quy trình chuyển gen vào giớng lúa thơng qua vi kh̉n Agrobacterium Với mục tiêu góp phần nghiên cứu tạo giớng lúa có kích thước hạt dài, đáp ứng nhu cầu thị trường gạo giới, tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 Bắc Thơm số 7” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng qt Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giớng lúa J02 Bắc Thơm số thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 28 Công thức 1: mg/l Công thức 2: mg/l Công thức 3: mg/l Công thức 4: mg/l Công thức 5: mg/l Công thức 6: 11mg/l 3.3.6 Phương pháp nhuộm GUS Để kiểm tế bào chuyển gen có mang gen GUS hay khơng, tế bào chuyển gen được nhuộm với dung dịch 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohezylamine 48 giờ Mẫu chuyển gen được rửa dung dịch Ethanol 70% trước quan sát kính lúp soi 3.3.7 Hồn thiện quy trình chuyển gen Kết nghiên cứu được thu thập, tổng hợp so sánh từ rút quy trình chuyển gene có hiệu chuyển gene cao phục vụ cho nghiên cứu 3.4 Các phương pháp xử lý số liệu Sớ liệu của thí nghiệm được thu thập hàng t̀n Sớ liệu tinh được phân tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi One-way ANOVA with post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) phần mềm Excel Hệ số mẫu nhânsống chồi(%) = = Tỷ lệ Tổng số chồi thusống được(mẫu) Tổng mẫu  100%  100% Tổng mẫunuôi đưacấy vào (mẫu) Tổngsốchồi Các tiêu theo dõi được tính toán theo các công thức sau: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) 29 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chủng khuẩn Agrobacterium Chủng vi khuẩn A tumefaciens sử dụng ảnh hưởng nhiều đến hiệu chuyển gen Để lựa chọn được chủng kh̉n có hiệu chuyển gen cao vào giớng lúa Việt Nam , nhóm nghiên cứu đã tiên hành thí nghiệm về khả chuyển gen của chủng vi khuẩn khác giống lúa giống lúa Bắc thơm số 4.1.1 Ảnh hưởng chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 Kết thử nghiệm khả chuyển gen của chủng vi khuẩn A tumefaciens giống lúa J02 thu được bảng 4.1 Bảng 4.1 Ảnh hưởng chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống J02 Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình dùng vi khuẩn (đ/c) Chủng AGL1 Chủng EHA105 Chủng GV3101 Chủng LBA4404 300 300 300 300 300 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu Số mẫu sống chết trung trung bình bình 0,0 300,0 70,0 230,0 100,7 199,3 73,0 227,0 89,7 210,3 Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0c 23,3d 33,6a 24,3c 29,9b LSD0,05 1,27 CV% 8,09 Số bắt màu GUS (mẫu) 57 83 60 74 (Ghi chú:a, b, c d nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05) Số liệu bảng 4.1 rằng, chủng khuẩn khác có khả chuyển gene khác vào lúa JO2 Hiệu chuyển gen+ thông qua tỷ lệ mẫu sống dao động từ 23,3% đến 33,6% So sánh hiệu chuyển gen phân chúng thành 02 nhóm Nhóm có hiệu chuyển gen cao chủng A tumefaciens EHA105 với tỷ lệ sớng lên đến 33,6% Tiếp là nhóm của chủng LBA4404 cho hiệu chuyển gen đạt 29,9% Đứng sau nhóm gờm chủng AGL1 chủng GV301 có 30 hiệu chuyển gen thấp lần lượt đạt tỷ lệ sống 23,3 24,3% Ảnh hưởng của chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen đã được kiểm tra giống lúa Bắc thơm 4.1.2 Ảnh hưởng chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc Thơm Bảng 4.2 Ảnh hưởng chủng khuẩn đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc thơm Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Công thức dùng vi khuẩn(đ/c) Chủng vi AGL1 Chủng EHA105 Chủng GV3101 Chủng LBA4404 LSD0,05 Số mẫu lây nhiễm trung bình 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 56,7 94,0 61,7 84 Số mẫu chết Trung bình 300,0 243,3 206,0 238,3 216,0 Tỷ lệ mẫu sống (%) Số bắt màu GUS (mẫu) 0,0e 18,9d 31,3a 20,6c 28,0b 1,21 46 77 51 69 CV% 5,81 (Ghi chú:a, b, c, d e nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05) Số liệu bảng 4.2 ảnh hưởng của chủng khuẩn nêu trên giống Bắc thơm Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc dao động từ 18,9 đến 31,3 % Theo tỷ lệ mẫu sớng sớ lượng mẫu bắt màu GUS chia chủng kh̉n thành nhóm Nhóm gờm chủng AGL1 chủng GV3101 cho tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc thấp lần lượt là 18,9 và 20,6% Trong đó, chủng EHA105 chủng LBA4404 cho hiệu cao Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt 28,0 31,3% Từ kết thử nghiệm về tác động của chủng khuẩn giớng lúa Bắc thơm sớ rút chủng EHA105 chủng LBA4404 cho hiệu chuyển gen cao EHA105 có phần tớt hẳn tiếp tục được sử dụng cho nghiên 31 cứu Nhóm nghiên cứu tiếp tục xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy chủng EHA105 đến hiệu chuyển gen 4.2 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu được thực hiện hai giống lúa JO2 Bắc thơm được trồng phổ biến Việt Nam 4.2.1 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 Để xác định ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2, mô sẹo ngày tuổi từ hạt gạo được lây nhiễm với chủng khuẩn A tumefaciens EHA105 Kết bảng 4.3 Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa JO2 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây nhiễm trung bình Tỷ lệ mẫu Số bắt màu sống GUS (mẫu) (%) phút (đ/c) 300 0,0f e phút 300 19,6 48 d phút 300 21,6 53 c phút 300 33,9 81 phút 300 35,2 a 83 phút 300 35,1b 84 LSD0,05 1,32 CV% 3,28 (Ghi chú:a ,b, c, d, e f nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân Cơng thức Số mẫu sống trung bình 0,0 58,7 64,7 101,7 105,7 105,3 Số mẫu chết trung bình 300,0 241,3 235,3 198,3 194,3 194,7 tích one-way ANOVA Tukey HSD, mức ý nghĩa  = 0,05) Qua bảng số liệu cho thấy thay đổi thời gian lây nhiễm làm ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen Tăng thời gian lây nhiễm từ phút đến phút hiệu chuyển gen tăng Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc tăng từ 0,0% lên 33,9% Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian lây nhiễm lên phút phút, hiệu chuyển gen không thay đổi Tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc lần lượt 35,3% 35,1% không khác biệt so với công thức lây nhiễm phút Kết lý giải sau: thời gian 32 tiếp súc không đủ lâu, vi khuẩn dễ dàng bị tách khỏi khối mô sẹo ta nhấc mẫu khỏi dung dịch Khi mẫu để dung dịch khoảng phút đảm bảo đủ thời gian cho vi khuẩn kịp bám ổn định khới mơ sẹo Từ hiệu chuyển gen được cải thiện Tuy nhiên tăng thời gian lên phút không làm thay đổi sự tiếp súc của vi khuẩn A tumefaciens với khối mô sẹo Từ khơng gây lên sự khác biệt cơng thức lây nhiễm phút với công thức lây nhiễm lâu phút và phút Thí nghiệm được tiến hành tương tự với giống lúa Bắc thơm số 4.2.2 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc thơm Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu được thực hiện giống lúa Bắc thơm được trồng phổ biến Việt Nam Kết được thể hiện bảng 4.4 Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen giống Bắc Thơm số Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình phút (đ/c) phút phút phút phút phút 300 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình 0,0 52,0 53,0 83,7 82,0 86,7 Số mẫu chết trung bình 300,0 248,0 247,0 216,3 218,0 213,3 Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0f 17,3e 17,7d 27,9b 27,3 c 28,9a LSD0,05 0,32 CV% 1,44 Số bắt màu GUS (mẫu) 43 43 69 67 69 (Ghi chú: a, b, c, d, e f nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05) Kết chuyển gen giớng lúa Bắc thơm có phần thấp so với kết thu được giống JO2 một mốc thời gian Mặc dù vậy, số liệu bảng 4.2 kết qủa tương tự kết thử nghiệm giống lúa JO2 về ảnh hưởng của 33 thời gian lây nhiễm Khi tăng thời gian lây nhiễm từ phút đến phút, tỷ lệ sống tăng từ 0,0% lên đến 27,9% Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian lây nhiễm không làm tăng hiệu chuyển gene số mẫu chuyển gen cơng thức khơng có sự sai khác ý nghĩa Từ kết thời gian lây nhiễm phút phù hợp cho chuyển gen vào lúa JO2 Bắc thơm Thời gian lây nhiễm được sử dụng vào thí nghiệm sau 4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng ni cấy hiệu chuyển gen Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen được tiến hành hai giống lúa JO2 Bắc thơm sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 4.3.1 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen giống J02 Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen của giống lúa JO2 được thể hiện bảng 4.5 Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen giống lúa J02 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Công thức Số mẫu lây nhiễm trung bình Số mẫu sống trung bình 0,0 32,0 59,0 97,0 92,0 69,3 Số mẫu chết trung bình 300,0 268,0 241,0 203,0 208,0 230,7 Tỷ lệ mẫu sống (%) Số bắt màu GUS (mẫu) ngày (đ/c) 300 0,0f e ngày 300 10,7 26 d ngày 300 19,7 48 a ngày 300 32,3 80 ngày 300 30,7b 75 c ngày 300 23,1 57 LSD0,05 1,08 CV% 7,64 (Ghi chú: a, b, c, d, e f nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05) Kết bảng 4.4 việc thay đổi thời gian đồng nuôi cấy làm thay đổi hiệu chuyển gen thông qua tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc Khi tăng 34 thời gian đồng nuôi cấy từ ngày lên ngày, hiệu chuyển gen tăng lên từ đến 32,3% Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên ngày không làm tăng hiệu chuyển gen Ngược lại, hiệu chuyển gen có phần giảm Thí nghiệm được thử nghiệm giống lúa Bắc thơm 4.3.2 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen giống Bắc Thơm số Kết thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen của giống Bắc thơm được thể hiện bảng 4.6 Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen giống lúa Bắc Thơm số Công thức Số mẫu đồng ni cấy trung bình Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu Số mẫu sống trung chết bình trung bình Tỷ lệ mẫu sống trung bình (%) Số bắt màu GUS (mẫu) ngày (đ/c) 300 0,0 300,0 0,0f e ngày 300 29,0 271,0 9,7 24 d ngày 300 52,7 247,3 17,6 43 ngày 300 90,3 209,7 30,1a 74 b ngày 300 85,0 215,0 28,3 70 c ngày 300 67,0 233,0 22,3 55 LSD0,05 1,32 CV% 3,95 (Ghi chú: a, b, c, d, e f nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05) Kết bảng 4.6 tương tự kết thu được giống lúa JO2 Tăng thời gian đồng nuôi cấy từ đến ngày góp phần tăng tỷ lệ mẫu sống từ 9,7% lên 30,1% Tiếp tục tăng thời gian đồng nuôi cấy lên ngày không làm thay đổi hiệu chuyển gen Tuy nhiên, tăng thời gian đồng nuôi cấy lên ngày hiệu chuyển gen bắt đầu giảm Kết giải thích sau: tăng thời gian đờng ni cấy từ 1-3 ngày làm số lượng vi khuẩn tăng sớ lượng lên nhiêu Từ đó, góp phần làm tăng hội để vi khuẩn A tumefaciens thực hiện quá trình đưa gene 35 vào vật chủ Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian lên sớ lượng vi khuẩn dần chết và sinh độc tố làm ảnh hưởng tiêu cực đến chủng vi kh̉n cịn sớng, đờng thời ảnh hưởng đến tế bào chuyển gen Từ làm giảm hiệu chuyển gen Kết hợp kết thu được từ thử nghiệm về thời gian đồng nuôi cấy hai giống lúa trên, rút thời gian đờng ni cấy thích hợp ngày 4.4 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen Nồng độ chất chọn lọc ảnh hưởng nhiều đến sự sàng lọc tế bào chuyển gen sự tái sinh của chúng Nếu nồng độ chất chọn lọc thấp ta thu được nhiều tế bào sau chuyển gen Tuy nhiên khó để phân biệt đâu là tế bào mang gen chuyển, đâu là tế bào khơng mang gen tất chúng đều sinh trưởng được môi trường Ngược lại, nờng đợ chất chọn lọc q cao tiêu diệt tế bào mang gen chuyển, từ gây khó khăn cho việc tái sinh sau chuyển gen Thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc được tiến hành hai giống lúa JO2 Bắc thơm 4.4.1 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen giống lúa J02 Kế thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh của giống lúa JO2 được thể hiện bảng 4.6 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen giống lúa J02 Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Công thức mg/l (đ/c) mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 11 mg/l LSD0,05 CV% Số mẫu lây nhiễm trung bình 300 300 300 300 300 300 300 Số mẫu sống trung bình Số mẫu chết trung bình Tỷ lệ mẫu sống trung bình (%) Số bắt màu GUS (mẫu) 300,0 258,3 142,3 112,3 68,0 43,0 36,0 0,0 41,7 157,7 187,7 232,0 257,0 264,0 100,0a 86,1b 47,4c 37,4d 22,7e 14,3f 12,0g 0,61 2,94 4,6 39,3 80,1 95,6 95,3 94,4 36 (Ghi chú: a, b, c, d, e, f g nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-way ANOVA Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05) Kết bảng 4.7 tăng nồng độ chất chọn lọc làm giảm tỷ lệ sống của mẫu sau chuyển gen từ 100% xuống còn 12% Đồng thời làm tăng tỷ lệ mẫu bắt màu GUS từ 0% đến 95.6% Công thức không bổ sung glufocinat-ammonium cho số mẫu sống cao 100% Tuy nhiên tỷ lệ bắt màu GUS lại thấp 0% Trong đó, công thức 5mg glufocinat-ammonium/l môi trường cho số mẫu sống đạt 37,4% số mẫu bắt màu GUS đạt cao 80,1 % Ở cơng thức có nờng độ chất chọn lọc cao hơn, tỷ lệ mẫu sống giảm mợt cách đáng kể từ làm cho số mẫu bắt màu GUS giảm theo lần lượt 65, 41, 34 mẫu Thí nghiệm được tiến hành với giống lúa Bắc thơm 4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số Kết thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến tỷ lệ tái sinh chuyển gen giống lúa Bắc thơm được thể hiện bảng 4.8 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen đến giống lúa Bắc Thơm số Chỉ tiêu đánh giá sau 14 ngày Số mẫu lây nhiễm trung bình Tỷ lệ Số bắt mẫu sống màu GUS trung (mẫu) bình (%) mg/l (đ/c) 300 100,0a b mg/l 300 88,4 4,9 c mg/l 300 50,2 39,8 d mg/l 300 36,1 79,4 e mg/l 300 24,7 94,6 mg/l 300 15,0f 93,3 g 11 mg/l 300 11,9 95,4 LSD0,05 0,64 CV% 2,88 (Ghi chú: a, b, c, d, e, f g nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp Công thức Số mẫu sống trung bình 300,0 265,3 150,7 108,3 74,0 45,0 35,7 Số mẫu chết trung bình 0,0 34,7 149,3 191,7 226,0 255,0 264,3 phân tích one-way ANOVA Tukey HSD ,có mức ý nghĩa  = 0,05) 37 Kết bảng 4.8 tương tự kết thu được với giống lúa JO2 Khi tăng nồng độ chất chọn lọc làm giám tỷ lệ mẫu sống đồng thời làm tăng tỷ lệ mẫu nhuộm GUS Công thức sử dụng 5mg Glufocinate/ lit môi trường cho số mẫu bắt màu GUS cao 76,4% Mẫu sống môi trường chọn lọc tiếp tục được theo dõi đến 28 ngày Kết khơng có sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tái sinh Kết giải thích sau: Glufocinate là mợt loại th́c trừ cỏ tự nhiên, tác đợng lên sự sàng lọc tế bào thực vật có chứa gen kháng Glufocinate Tuy nhiên không ảnh hưởng đến khả tái sinh sư các chất kích thích sinh trưởng 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong khuôn khổ thí nghiệm nghiên cứu chúng tơi đưa một số kết luận nghiên cứu sau: - Hai chủng khuẩn A.tumefaciens EHA105 LBA4404 cho hiệu chuyển gen cao hai giống lúa thử nghiệm Tỷ lệ sống sau chọn lọc đạt 33,6 29,9 cho giống lúa J02 31,3 28,0% 28,0% cho giống lúa Bắc Thơm - Thời gian lây nhiễm hiệu là phút, hiệu chuyển gen thơng qua môi trường chọn lọc của giống J02 Bắc Thơm lần lượt 33,9 27,9% - Thời gian đồng nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens với tế bào mô sẹo ngày cho tỷ lệ chuyển gen cao Tỷ lệ sống sau chọn lọc lần lượt cho giống J02 Bắc Thơm số thời gian đồng nuôi cấy ngày đạt lần lượt 32,3% 30,1% - Nồng độ chất chọn lọc không gây ảnh hưởng đến khả chuyển gen của hai giống lúa J02 Bắc Thơm sớ Nó góp phần làm tăng hiệu sàng lọc tế bào chuyển gen môi trường chọn lọc - Nghiên cứu thành công quy trình chuyển gen hai giớng lúa J02 Bắc Thơm số 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chủng vi khuẩn khác đến khả lây nhiễm của hai giống lúa J02 Bắc Thơm số - Nghiên cứu thêm về thời gian đồng nuôi cấy hiệu tốt đạt tỉ lệ thành công cao - Nghiên cứu về điều kiện ngoại cảnh( ẩm độ, nhiệt độ,ánh sáng, dinh dưỡng) đến khả sinh trưởng phát triển của hai giống lúa J02 Bắc Thơm số - Nghiên cứu thêm về nồng độ chất chọn lọc đến hiệu chuyển gen của hai giống lúa J02 Bắc Thơm số 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, Nxb Đại học Sư phạm Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nxb Khoa học tự nhiên cơng nghệ Trần Thị Lệ, Nguyễn Hồng Lợc, Trần Q́c Dũng (2006), Giáo trình cơng nghệ gen nông nghiệp, Huế Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen vào thực vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ tḥt Hà Nợi Hồng Thị Giang, Mai Đức Chung, Nguyễn Thị Huế, Jérémy Lavarenne, Mathieu Gonin, Nguyễn Thanh Hải, Đỡ Năng Vịnh, Pascal Gantet (2015) “Hồn thiện quy trình chuyển gen cho giớng lúa Taichung 65 thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, tạp chí Khoa học Phát triển Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính, Nguyễn Thị Then (1988), “ Kết xây dựng quỹ gen và chọn tạo giớng lúa mới”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, (số 11) Nguyễn Trọng Khanh (2016), “Nghiên cứu chọn tạo giống lúa chất lượng tốt cho vùng đồng sông Hồng”, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Nguyễn Hồng Lợc (2007), Theo nhập mơn cơng nghệ sinh học, Nhà xuất Đại học Huế Phan Thị Thu Hiền (2012), "Khả tạo callus tái sinh của tập đoàn 31 giống lúa nương miền Bắc Việt Nam phục vụ công tác chuyển gen", Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 10 (sớ 4: 567-575) 10 Trịnh Đình Đạt (2006), Công Nghệ Sinh Học Tập 4-Công Nghệ Di Truyền 173 Trang 40 Tiếng Anh 11 Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H (1992) Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens Plant Cell Physiol., 33: 577-583 12 Yoshida (1981), Fundamentals of rice crop science, The International rice research institute, Los Banos, Philippines 13 Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T- DNA PlantJ.,6:271-282 14 Jenning P.R, W.R Coffmen and H.E Kauffman (1979), Rice improvement, IRRI, Los Bnaros, Philippines, pp 101-102 15 P.D Hsu, D.A Scott, J.A.Weinstein, F.A Ran, S Konermann, V Agarwala, Y Li, E.J Fine, X Wu, O Shalem (2013), “DNA targeting specificity of RNAguided Cas9 nucleases”, Nat Biotechnol 16 Koornneef, M., Bade, J., Hanhart, C., Horsman, K., Schel, J., Soppe, W., Verkerk, R & Zabel, P, (1993) Plant J , 131-141 17 Cheng M Fry J.E., S Pang, I Zhou, T.W.L Conner, Y Wang (1992) “Genetic transfomation of the wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens” Plant Physiol, 115, pp 971-980 18 Zhou H, He M, Li J, Chen L, Huang Z, Zheng S, (2016), Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system Sci Rep 6:37395 19 Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C et al, (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew Nat Biotechnol 32, 947–951 20 Wang F, Wang C, Liu P, Lei P, Hao W, Gao Y, et al (2016), Enhanced rice blast resistance by CRISPR/ Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922 PLoS One 11:e0154027 41 21 Ricroch A, Clairand P, Harwood W, (2017), Use of CRISPR systems in plant genome editing: toward new opportunities in agriculture Emerg Top Life Sci.1, 169–182 22 Li Q, Zhang D, Chen M, Liang W, Wei J, Qi Y, et al (2016), Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9 J Genet Genomics 43, 415–419 23 Huang X.Z, Zeng X.F, Li J.R., Zhao D.G, (2017), Construction and analysis of tify1a and tify1b mutants in rice (Oryza sativa) based on CRISPR/Cas9 technology J Agric Biotechnol 25, 1003–1012 24 Shao G, Xie L, Jiao G, Wei X, Sheng Z, Tang S, et al (2017), CRISPR/CAS9mediated editing of the fragrant gene Badh2 in Rice Chin J Rice Sci 31, 216–222 PHẦN PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH Ảnh hưởng vi khuẩn LBA4404 giống J02) sau 03 ngày Lây nhiễm phút (giống J02) sau 07 ngày Đồng lây nhiễm ngày (giống J02) Ảnh hưởng vi khuẩn EHA105 (giống Bắc Thơm số 7) sau 03 ngày Lây nhiễm phút (giống Bắc Thơm số 7) sau 07 ngày Đồng lây nhiễm ngày (giống Bắc Thơm số 7) ... hành đề tài: ? ?Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống lúa J02 Bắc Thơm số 7? ?? 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giớng lúa J02 Bắc Thơm số thông... (giống J02) sau 07 ngày Đồng lây nhiễm ngày (giống J02) Ảnh hưởng vi khuẩn EHA105 (giống Bắc Thơm số 7) sau 03 ngày Lây nhiễm phút (giống Bắc Thơm số 7) sau 07 ngày Đồng lây nhiễm ngày (giống Bắc Thơm. .. khả chuyển gen của hai giống lúa J02 Bắc Thơm sớ Nó góp phần làm tăng hiệu sàng lọc tế bào chuyển gen môi trường chọn lọc - Nghiên cứu thành cơng quy trình chuyển gen hai giống lúa J02