Nghiên cứu sản xuất fructooligosaccharide (fos) bởi chế phẩm pectinex ultra sp l cố định trên alginate

Luận văn này được thực hiện nhằm mục tiêu nâng cao hàm lượng FOS trong quá trình sản xuất sử dụng enzyme cố định.. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và thiết bị

+ Đường Biên Hòa hàm lượng sucrose >99,8 (%)

+ Chế phẩm Pectinex Ultra SP–L (Novoferm 14) của nhà phân phối Nam Giang, dạng lỏng

+ Natri alginate (Kanto Chemical Co, INC, Nhật)

Các hóa chất cần thiết được phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM cung cấp

Bơm định lượng, máy quang phổ, bể lắc ổn nhiệt, cân phân tích và một số thiết bị cơ bản ở phòng thí nghiệm.

Phương pháp

3.2.1 Phương pháp xác định các thông số cơ bản

3.2.1.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp

3.2.1.2 Phương pháp xác định đường khử bằng DNS [6]

Hoạt tính của enzyme được xác định thông qua lượng đường khử có trong hỗn hợp sản phẩm sau quá trình phản ứng

3.2.1.3 Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex

Ultra SP–L tự do và cố định

Hoạt tính fructosyltransferase trong chế phẩm Pectinex Ultra SP–L tự do (cố định) được xác định qua lượng đường khử tạo thành theo phương pháp định lượng hàm lượng đường khử DNS

S ơ đồ 3.1: Các b ướ c xác đị nh ho ạ t tính enzyme fructosyltransferase

Mỗi thí nghiệm được bố trí như sau: sử dụng bình tam giác thêm 10 (ml) dung dịch sucrose nồng độ 40 (%) (w/v), pH = 5,42, 0,2 (ml) chế phẩm Pectinex Ultra SP–L tự do (hoặc “m” gam enzyme cố định) Hỗn hợp được thực hiện phản ứng trong bể ủ nhiệt tại nhiệt độ 55,00 ( o C), thời gian phản ứng 30 (phút) Sau phản ứng đun sôi cách thủy trong 10 (phút) để bất hoạt enzyme tự do (loại bỏ enzyme cố định trước khi đun) Sau đó xác định hàm lượng đường khử bằng

0,2 (ml) chế phẩm Pectinex Ultra SP-L

Hỗn hợp phản ứng 10ml dung dịch sucrose 40 (%) (w/v)

Phản ứng chuyển gốc fructosyl pH = 5,42

Nhiệt độ: 55,00 ( o C) Thời gian: 30 (phút)

DNS và xác định hoạt tính của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L tự do (cố định) theo công thức (5)

Xác định hàm lượng đường khử ban đầu trong sucrose: sử dụng bình tam giác thêm 10 (ml) dung dịch sucrose nồng độ 40 (%) (w/v), pH = 5,42, không bổ sung chế phẩm Pectinex Ultra SP–L Hỗn hợp được ủ trong bể ủ nhiệt tại nhiệt độ 55,00 ( o C), thời gian 30 (phút) Sau đó đun sôi cách thủy hỗ hợp trong 10 (phút), tiếp đến xác định hàm lượng đường khử bằng DNS

Tổng lượng protein ban đầu đem cố định:

Tổng protein ban đầu = (Hàm lượng protein ban đầu) * m (1) Trong đó m : là lượng enzyme (ml hoặc mg)

Tổng lượng protein còn lại không được cố định:

Tổng protein còn lại = ( hàm lượng protein trong CaCl2) * n *V (2) Trong đó n : hệ số pha loãng

V : thể tích dung dịch sau khi rửa

Tổng lượng protein cố định được:

Tổng protein cố định = Tổng protein ban đầu – Tổng protein còn lại (3)

Hiệu suất cố định protein:

HS cố định protein (%) = Tổng protein cố định / Tổng protein ban đầu (4)

Xác định hoạt tính enzyme ban đầu và enzyme cố định:

GF2 (1–kestose), GF3 (nystose), GF4 (fructofuranosylnystose) : FOS

Hoạt độ của enzyme được tính theo đơn vị UI, một UI là hoạt độ của ezyme xúc tác cho sự chuyển hóa tạo thành 1 mol sản phẩm sau 1 phút ở điều kiện nhiệt

35 độ 55,00 ( o C), pH cơ chất là 5,42, nồng độ cơ chất sucrose là 40 (%) khối lượng, lượng enzyme tự do là 0,2 (ml), thời gian phản ứng là 30 (phút)

Theo các phương trình phản ứng thì quá trình phản ứng tạo ra lượng glucose tương ứng với từng phản ứng Do đó:

Công thức xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex

Ultra SP–L tự do và sau quá trình cố định (tính theo sản phẩm glucose): t m

HT : Hoạt tính enzyme = (mol/phút)/m enzyme = UI/m enzyme

180 : Khối lượng phân tử của glucose (g/mol)

V : Thể tích dung dịch đường khử sau phản ứng (ml)

G : Tổng hàm lượng đường khử trong mẫu (lượng glucose do quá trình chuyển hóa + lượng đường khử ban đầu có trong sucrose) (mg/ml) a : Hàm lượng đường khử trong cơ chất ban đầu (mg/ml)

G – a : Là hàm lượng glucose do chuyển hóa tạo thành trong mẫu (mg/ml) m : Khối lượng hoặc thể tích enzyme dùng để thực hiện phản ứng (g, ml) t : Thời gian thực hiện phản ứng (phút)

Tổng đơn vị hoạt tính enzyme tự do ban đầu được sử dụng cho cố định :

Tổng HT enzyme tự do = HT enzyme tự do * M enzyme ban đầu (6)

M : Thể tích (ml) hoặc khối lượng (gam) enzyme tự do ban đầu được sử dụng cho cố định

Tổng đơn vị hoạt tính enzyme cố định được :

Tổng HT enzyme cố định HT enzyme cố định * Khối lượng enzyme cố định thu được (7)

Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme

HS cố định enzyme (%) Tổng HT enzyme cố định / Tổng HT enzyme tự do * 100 (8)

3.2.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

Quy hoạch thực nghiệm được tiến hành theo một phương án chọn trước, cho phép xác định nhanh các chế độ và thành phần tối ưu của môi trường Do sử dụng phương pháp toán học kế hoạch hóa thực nghiệm nên quy hoạch thực nghiệm đã khắc phục được nhược điểm của thực nghiệm thụ động (khảo sát đơn biến) là giảm đáng kể số thí nghiệm tiến hành

Xét yếu tố được ký hiệu Z j , ta có: k

Trong đó: Z max j là mức cao (mức trên); min

Z j là mức thấp (mức dưới); Z o j là mức cơ sở Điểm có tọa độ ( Z 1 o , Z 2 o , , Z k o )được gọi là tâm phương án, là khoảng biến thiên của yếu tố Z j tính từ mức cơ sở k

 (10) Để việc tính toán được thực hiện thuận lợi, người ta chuyển từ hệ trục tự nhiên Z1, …, Zk sang hệ trục không thứ guyen (hệ mã hóa) Việc mã hóa thực hiện được dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc hệ trục tọa độ k

Trong hệ trục không thứ nguyên ta có mức trên là 1, mức dưới là –1 Tọa độ của tâm phương án bằng không, trùng với gốc hệ trục tọa độ

Phương trình hồi quy tuyến tính (đối với 3 yếu tố) có dạng:

1 (13) Ý nghĩa của các hệ số hồi quy và sự tương thích của phương trình được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Student và Fisher

Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology – RSM)

Giới thiệu chung về phương pháp đáp ứng bề mặt

Hàm đáp ứng liên hệ giữa thông số tối ưu hóa đặc trưng cho những kết quả thực nghiệm với các thông số biến đổi khi làm thí nghiệm:

) , , (x 1 x k y  (14) là mô thức toán học

Người ta gọi các biến độc lập x1, x2, …, xk là những nhân tố, không gian tọa độ với những tọa độ x1, x2, … xk là không gian nhân tố và sự biễu diễn hình học các hàm đáp ứng trong không gian nhân tố là mặt đáp ứng Khi sử dụng các phương pháp thống kê, mô thức toán học thường được biểu diễn dưới dạng đa thức – một phần của chuỗi Taylo:

Bởi vì trong quá trình thật luôn luôn tồn tại những biến không kiểm tra và điều kiển được nên sự biến đổi đại lượng y mang tính chất ngẫu nhiên, vì vậy khi xử lý các số liệu thực nghiệm sẽ nhận được các hệ số hồi quy của mẫu bo, bj, buj,

38 bjj là những ước lượng của các hệ số lý thuyết o, j, uj, jj Phương trình hồi quy nhận được trên cơ sở thí nghiệm được viết như sau:

Hệ số bo được gọi là số hạng tự do của phương trình hồi quy Các hệ số bj là những hiệu ứng tuyến tính, bjj là những hiệu ứng bậc 2, buj là những hiệu ứng tương tác đôi

Bài toán tối ưu sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt được trình bày dưới dạng bậc bậc 2 và bậc 3 Trong đó mô hình bậc 2 thông dụng hơn, mô hình bậc 3 rất ít khi sử dụng do phức tạp, chỉ ứng dụng cho những trường hợp rất đặc biệt khi không dùng được mô hình bậc 2 để giải bài toán tối ưu Mô hình đầy đủ của phương trình hồi quy bậc 2 và 3 ứng với 3 yếu tố x1, x2, x3 được trình bày như sau:

Mô hình b ậ c 2: Ph ươ ng án c ấ u trúc có tâm (CCD) [2]:

Phương án cấu trúc có tâm (CCD) là một trường hợp đặc biệt trong nhóm các mô hình quy hoạch thực nghiệm Nó được cấu thành từ ba thành phần:

+ Nhân: là một phương án tuyến tính với 2 k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều Nếu k>5, có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2 k–1

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đường chuẩn

4.1.1 Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose

Hàm lượng đường khử trong mẫu được xác định theo phương pháp DNS Hàm lượng đường khử trong mẫu được quy về glucose do sự hiện diện của hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L làm cho sự hình thành fructose trong sản phẩm với một tỷ lệ rất nhỏ so với glucose

B ả ng 4.1: Độ bi ế n thiên m ậ t độ quang theo m ẫ u glucose chu ẩ n

Hình 4.1: Đồ th ị đườ ng chu ẩ n xác đị nh hàm l ượ ng glucose

Phương trình hồi quy của đường chuẩn đường glucose:

Trong đó: X1 : nồng độ glucose mẫu cần đo [mg/ml]

Hoạt tính fructosyltransferase ban đầu của chế phẩm Pectinex Ultra SP–L được tiến hành theo mục 3.2.1.3, tính toán hoạt tính fructosyltransferase ban đầu theo công thức (5) mục 3.2.2

B ả ng 4.2: Ho ạ t tính fructosyltransferase c ủ a ch ế ph ẩ m Pectinex Ultra SP–L t ự do

Thể tích enzyme (ml) ∆OD Hệ số pha loãng ( lần)

Hàm lượng đường khử (mg/ml)

4.1.2 Đường chuẩn xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford

B ả ng 4.3: Độ bi ế n thiên m ậ t độ quang theo m ẫ u protein chu ẩ n

Hình 4.2: Đồ th ị đườ ng chu ẩ n xác đị nh hàm l ượ ng protein

Phương trình hồi quy của đường chuẩn protein :

Trong đú: X2 : hàm lượng protein trong mẫu cần đo [àg/ml]

Pha loãng mẫu enzyme tự do ban đầu 50 lần Sau đó xác định hàm lượng protein trong mẫu pha loãng dựa vào đường chuẩn xác định hàm lượng protein

B ả ng 4.4: Hàm l ượ ng protein trong m ẫ u ch ế ph ẩ m Pectinex Ultra Sp–L t ự do

Thể tích enzyme (ml) Hệ số pha loãng ∆ OD Hàm lượng protein

Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme tự do đạt 116,26 (UI/mg), hoạt tính riêng thể hiện độ tinh sạch của enzyme.

Tối ưu hóa quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP–L trên chất mang

Mục tiêu của phần khảo sát này là tìm điều kiện cố định tốt nhất cho enzyme cố định hoạt động hiệu quả nhất và đạt hoạt tính cao Ưu điểm của phương pháp quy hoạch thực nghiệm–mô hình hóa tối ưu hóa so với phương pháp khảo sát đơn biến là cho chúng tôi thấy được tổng quan sự ảnh hưởng của các yếu tố, các yếu tố nào có ảnh hưởng và không có ảnh hưởng, sự ảnh hưởng đó thể hiện ở phương trình hồi quy Ngoài ra, phương trình hồi quy còn cho chúng tôi biết sự kết hợp của hai yếu tố sẽ như thế nào, tác động tiêu cực hay tích cực (tác động âm hay tác động dương)

Các thông số được cố định:

+ Nồng độ cơ chất sucrose ban đầu 40 (%) (w/v) (pH =5,42, đo sau khi pha dung dịch cơ chất), không chỉnh pH

+ Lượng cơ chất phản ứng 10 (ml) + Thời gian phản ứng 30 (phút) + Nhiệt độ phản ứng 55,00 ( o C)

B ả ng 4.5: K ế t qu ả thí nghi ệ m kh ả o sát đ i ề u ki ệ n c ố đị nh theo mô hình hóa t ố i ư u hóa 3 y ế u t ố

Tiến hành thực nghiệm như mục 3.2.3.2 chúng tôi thu được kết quả ở bảng 4.5 Sau đó chúng tôi nhập số liệu ở bảng trên vào phần mềm Design–Expert 7.0 để xử lý và phân tích xem kết quả của mô hình có tương thích với thực nghiệm

50 hay không, đồng thời chương trình cũng tính toán để cho ra phương trình hồi quy bậc 2 (mặt đáp ứng) thể hiện sự ảnh hưởng của từng yếu tố và tổ hợp các yếu tố, trong đó yếu tố nào phù hợp hay không phù hợp đều được kiểm định Ở đây hàm mục tiêu là “Hiệu suất cố định enzyme”, vì các điều kiện cố định thay đổi theo từng phản ứng nên chúng tôi quy về hiệu suất tính trên enzyme tự do

Ngoài ra chương trình còn có phần dự đoán (Solutions) để đưa ra các kết quả tối ưu

Phần dưới đây (ảnh chụp từ máy tính của phần mềm Design–Expert 7.0) là kết quả của chương trình đã tính toán

51 Ả nh 4.1: K ế t qu ả phân tích tính toán ANOVA b ằ ng ph ầ n m ề m

Design–Expert 7.0 (T ố i ư u đ i ề u ki ệ n c ố đị nh)

52 Ả nh 4.2: K ế t qu ả phân tích tính toán ph ươ ng trình h ồ i quy b ằ ng ph ầ n m ề m

Design–Expert 7.0 (T ố i ư u đ i ề u ki ệ n c ố đị nh)

A: Alginate B: Enzyme/Alginate Ả nh 4.3: M ặ t đ áp ứ ng b ậ c 2 th ể hi ệ n s ự t ổ h ợ p 2 y ế u t ố : t ỉ l ệ Enzyme/Alginate – Alginate

A: Alginate C: CaCl2 Ả nh 4.4: M ặ t đ áp ứ ng b ậ c 2 th ể hi ệ n s ự t ổ h ợ p 2 y ế u t ố : CaCl 2 – Alginate

B: Enzyme/Alginate C: CaCl2 Ả nh 4.5: M ặ t đ áp ứ ng b ậ c 2 th ể hi ệ n s ự t ổ h ợ p 2 y ế u t ố :

CaCl 2 – t ỉ l ệ Enzyme/Alginate Ả nh 4.6: Ch ươ ng trình tính toán và đư a ra d ự đ oán các đ i ể m t ố i ư u đ i ề u ki ệ n c ố đị nh

Kết quả phân tích ANOVA cho biết “Model là significant” và “Lack of Fit là not significant” cho thấy mô hình phù hợp với thực nghiệm và R 2 bằng 0,8031

(ảnh 4.1) Đồng thời cho biết hệ số trước biến B, A 2 là các hệ số hồi quy trong phương trình hồi quy bậc 2 (mặt đáp ứng bậc 2) có ý nghĩa (ảnh 4.1)

Phương trình hồi quy dạng code, biến mã hóa:

Hiệu suất cố định enzyme (%) = +11,55 +0,25*A +1,34*B –0.066*C

Phương trình hồi quy dạng biến tự nhiên:

Hiệu suất cố định enzyme = –280,27307 +164,59167*Alginate

+5,80000*(Alginate)*(Enzyme/Alginate) +1,26000*(Alginate)*(CaCl2) –0,38000*(Enzyme/Alginate)*(CaCl2) –24,71002*(Alginate) 2 –10,28504*(Enzyme/Alginate) 2

–0,4854*(CaCl2) 2 Theo kết quả phân tích ANOVA thì cho biết hệ số trước biến B (tỉ lệ enzyme/alginate thay đổi theo bậc 1) và hệ số trước biến A 2 (là nồng độ alginate thay đổi theo bậc 2) là có ý nghĩa Từ phương trình hồi quy chúng tôi nhận thấy 2 biến này có ảnh hưởng nhiều nhất đến hoạt tính của enzyme cố định, thể hiện ở hệ số hồi quy trước nó Bên cạnh đó thì nồng độ CaCl2 (biến C) không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính vì những hệ số trước biến có liên quan tới CaCl2 như:

C, B*C, A*C, C 2 ở phương trình hồi quy trên đều không có ý nghĩa

+ Hệ số hồi quy trước biến B là +1,34 có ý nghĩa: nếu tăng tỉ lệ enzyme/alginate lên thì hoạt tính enzyme cố định sẽ tăng (ảnh hưởng dương)

+ Còn hệ số hồi quy trước biến A 2 là –1,54 có ý nghĩa: nếu tăng nồng độ alginate thì hoạt tính enzyme cố định sẽ giảm (ảnh hưởng âm)

Từ các phân tích ANOVA và phương trình hồi quy ở trên thì chương trình tính toán và đưa ra các phương án tối ưu nhất (ảnh 4.6), chúng tôi chọn 5 phương án mà chương trình dự đoán để tiến hành thực nghiệm so sánh và lựa chọn phương án tối ưu nhất

B ả ng 4.6: Các ph ươ ng án t ố i ư u ch ươ ng trình d ự đ oán và k ế t qu ả kh ả o sát th ự c nghi ệ m

HS cđ enzyme (%) Tiên đoán bằng phần mềm

HS cđ enzyme (%) Thực nghiệm

HS cđ protein (%) Thực nghiệm

Kiểm tra bằng thực nghiệm cho chúng tôi kết quả là phương án 5 tối ưu nhất (bảng 4.6).

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm enzyme tự do

chế phẩm enzyme tự do Ở phần này chúng tôi sử dụng phương pháp khảo sát đơn biến để tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính fructosyltransferase của enzyme tự do Khảo sát đơn biến là chỉ khảo sát 1 yếu tố duy nhất trong cùng một thời điểm, các yếu tố còn lại được cố định

4.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme tự do

Nhiệt độ được khảo sát trong khoảng từ 45,00 ( o C) đến 75,00 ( o C),

+ Nồng độ cơ chất sucrose ban đầu 40 (%) (w/v) (pH = 5,42, đo sau khi pha dung dịch cơ chất), không chỉnh pH

+ Lượng cơ chất phản ứng 10 (ml) + Thời gian phản ứng 30 (phút)

Hình 4.3: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự ả nh h ưở ng c ủ a nhi ệ t độ đế n ho ạ t tính c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme t ự do

Kết quả khảo sát cho chúng tôi thấy khi nhiệt độ càng tăng thì hoạt tính của enzyme tự do càng tăng và đạt tối ưu ở 60 ( o C), sau đó nếu tăng nhiệt lên nữa thì hoạt tính bắt đầu giảm (phụ lục 6) Kết quả này phù hợp với kết quả của Iraj ghazi, Lucía Fernández–arrojo, Aranzazu Gomez de Segura, Miguel Alcalde, Francisco j Plou, Antonio Ballesteros (2006) nhiệt độ tối ưu là 60 ( o C), thấp hơn Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) nhiệt độ tối ưu là 65 ( o C), cao hơn Zs.Csanádi, Cs Sisak (2006) nhiệt độ tối ưu là 53 ( o C)

4.3.2 Ảnh hưởng của pH đến chế phẩm enzyme tự do pH được khảo sát trong khoảng từ 4,50 đến 7,50, bước nhảy 0,50

+ Nồng độ cơ chất sucrose ban đầu 40 (%) (w/v) (pH = 5,42, đo sau khi pha dung dịch cơ chất)

Hình 4.4: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự ả nh h ưở ng c ủ a pH đế n ho ạ t tính c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme t ự do

Kết quả khảo sát cho chúng tôi thấy khi ở pH từ 6,00 đến 7,50 thì hoạt tính thấp hơn so với khi ở pH từ 4,50 đến 5,50 Quá trình khảo sát cho kết quả ở pH 5,50 thì hoạt tính cao nhất (phụ lục 15) Kết quả này phù hợp với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) chọn pH tối ưu từ 5,5÷6,5, Iraj ghazi, Lucía Fernández–arrojo, Aranzazu Gomez de Segura, Miguel Alcalde, Francisco j Plou, Antonio Ballesteros (2006) chọn pH tối ưu là 5,5, Zs Csanádi, Cs Sisak

(2006) chọn pH tối ưu là 5,6

4.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất sucrose ban đầu đến chế phẩm enzyme tự do

Nồng độ được khảo sát trong khoảng từ 40 (%) (w/v) đến 70 (%) (w/v), khoảng bước nhảy là 5 (%)

+ Lượng cơ chất phản ứng 10 (ml) + Thời gian phản ứng 30 (phút) + Nhiệt độ phản ứng 55,00 ( o C) + pH 5,50

Hình 4.5: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự ả nh h ưở ng c ủ a n ồ ng độ c ơ ch ấ t sucrose ban đầ u đế n ho ạ t tính c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme t ự do

Kết quả khảo sát nồng độ cơ chất cho chúng tôi thấy là khi tăng nồng độ cơ chất thì hoạt tính tăng theo và tối ưu ở nồng độ sucrose 50 (%), sau đó nếu tăng nồng độ sucrose lên nữa thì hoạt tính giảm (phụ lục 8) Kết quả này thấp hơn kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) tối ưu ở nồng độ sucrose 60 (%).

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm enzyme cố định

chế phẩm enzyme cố định

Sau khi có các thông số tối ưu cho điều kiện cố định thì chúng tôi tạo enzyme cố định theo các thông số đó và tiến hành các bước khảo sát tiếp theo

4.4.1 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm enzyme cố định pH và nhiệt độ là hai yếu tố rất quan trọng đối với enzyme nói chung, nó ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc của enzyme, khả năng tương tác của enzyme với cơ chất, khả năng hoạt động của enzyme

4.4.1.1 Bước đầu sử dụng quy hoạch thực nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Ở phần này chúng tôi dùng quy hoạch thực nghiệm để tiến hành tìm điều kiện tối ưu cho quá trình phản ứng Tiến hành thực nghiệm như mục 3.2.3.3 chúng tôi thu được kết quả như bảng 4.7

+ Nồng độ cơ chất sucrose ban đầu 40 (%) (w/v) (pH =5,42, đo sau khi pha dung dịch cơ chất)

B ả ng 4.7: K ế t qu ả thí nghi ệ m kh ả o sát đ i ề u ki ệ n ph ả n ứ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh theo mô hình hóa t ố i ư u hóa 2 y ế u t ố

Tổng HT enzyme cđ (UI)

Sau đó chúng tôi cũng tiến hành xử lý số liệu ở bảng 4.7 bằng phần mềm Design–Expert 7.0 Vì điều kiện cố định là giống nhau (điều kiện cố định đã được tối ưu ở mục 4.2) nên chúng tôi chọn hàm mục tiêu là “Tổng hoạt tính enzyme cố định”

Kết quả phân tích ANOVA cho biết “Model là not significant” và “Lack of Fit là significant” cho thấy mô hình không phù hợp với thực nghiệm (ảnh 4.7)

61 Ả nh 4.7: K ế t qu ả phân tích tính toán ANOVA b ằ ng ph ầ n m ề m

Design–Expert 7.0 (T ố i ư u đ i ề u ki ệ n ph ả n ứ ng)

Kết quả phân tích không phù hợp với thực nghiệm chứng tỏ mô hình có vấn đề hoặc là kết quả thực nghiệm có sự sai lệch Chúng tôi tiến hành rà soát lại và nhận thấy pH chính là nguyên nhân, theo kết quả trình bày phần kế tiếp

4.4.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của chế phẩm enzyme cố định

Trong quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến enzyme cố định, chúng tôi nhận thấy:

+ Ở pH kiềm (đệm phosphate pH 9) thì làm hạt enzyme cố định sau phản ứng xuất hiện nhiều đường “gân” xung quanh bề mặt hạt enzyme cố định Khi dùng tay bóp nhẹ thì hạt enzyme cố định bị vỡ, cấu trúc hạt enzyme bị “bở” không còn chắc nữa (ảnh 4.8) Trong khi đó, đối với hạt enzyme phản ứng trong dung dịch không chỉnh pH thì bề mặt hạt enzyme sau phản ứng vẫn trơn láng như ban đầu (sau quá trình cố định) và khi dùng tay bóp thì hạt không bị vỡ, hạt vẫn còn rất chắc

+ Ở pH acid (đệm acetate pH 4) thì hạt gel vẫn giữ nguyên cấu trúc, nhưng vẫn không tốt như ban đầu, tuy nhiên có điều đáng chú ý là hàm lượng đường khử trong mẫu trắng không có enzyme (chỉ chỉnh pH) lại cao hơn nhiều lần so với mẫu trắng không có chỉnh pH (bảng 4.8), điều này chứng tỏ ở pH acid dưới tác dụng của nhiệt độ cao thì sucrose bị thủy phân thành đường khử, như vậy lượng cơ chất sẽ bị giảm đi mà không phải là do phản ứng tạo FOS, dẫn đến lãng phí cơ chất và tạo các phản ứng phụ khác ảnh hưởng đến phản ứng tạo FOS

+ Còn đối với cơ chất không chỉnh pH (chỉ đo pH sau khi pha, pH

= 5,42) thì hoàn toàn không thấy hiện tượng trên

B ả ng 4.8: So sánh s ự th ủ y phân sucrose khi ch ỉ nh pH acid và không ch ỉ nh pH pH OD o

OD t (mẫu trắng không enzyme)

Hàm lượng đường khử trong 10ml dung dịch cơ chất sau phản ứng (mg)

63 Ả nh 4.8: S ự ả nh h ưở ng c ủ a pH ki ề m lên c ấ u trúc c ủ a h ạ t enzyme c ố đị nh A: Thử độ bền của hạt enzyme sau phản ứng (không chỉnh pH của cơ chất)

C: Hạt enzyme sau phản ứng (không chỉnh pH của cơ chất)

B: Thử độ bền của hạt enzyme sau phản ứng (chỉnh pH của cơ chất bằng đệm phosphate pH 9)

D: Hạt enzyme sau phản ứng (chỉnh pH của cơ chất bằng đệm phosphate pH 9)

Từ kết quả phân tích ANOVA cho thấy mô hình không phù hợp với thực nghiệm và sự ảnh hưởng của pH đối với độ bền cấu trúc hạt enzyme cố định và cơ chất, chúng tôi quyết định loại yếu tố pH ra (không chỉnh pH cơ chất) và sử dụng phương pháp khảo sát đơn biến đối với các yếu còn lại để giải bài toán khảo sát tối ưu

Kết quả này cho chúng tôi thấy rằng ngoài sự ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme cố định thì các yếu tố này còn ảnh hưởng tới chất mang, cụ thể trong nghiên cứu này là yếu tố pH

4.4.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm enzyme cố định

Nhiệt độ là một trong những yếu tố rất quan trọng đối với hoạt động của enzyme nói chung, ở phần khảo sát này chủ yếu xác định khoảng nhiệt độ tối ưu và khuynh hướng hoạt động của enzyme cố định khi tăng nhiệt độ

Nhiệt độ được khảo sát trong khoảng từ 45,00 ( o C) đến 75,00 ( o C)

B ả ng 4.9: K ế t qu ả t ố i ư u kh ả o sát nhi ệ t độ ph ả n ứ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

STT Nhiệt độ ( o C) HT enzyme cđ (UI/g) Tổng HT enzyme cđ (UI)

Hình 4.6: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự ả nh h ưở ng c ủ a nhi ệ t độ đế n ho ạ t tính c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

Kết quả khảo sát cho chúng tôi thấy sự ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme tự do (hình 4.3) và cố định (hình 4.6) khoảng nhiệt độ từ 45 ( o C) đến 60 ( o C) là tương đương nhau

Nhưng trong khoảng nhiệt độ từ 65 ( o C) đến 75 ( o C) thì sự ảnh hưởng của nhiệt độ lại khác nhau hoàn toàn, cụ thể:

+ Đối với hoạt tính của enzyme tự do thì bắt đầu giảm dần ở sau 65 ( o C) và giảm mạnh hơn nếu tăng nhiệt độ phản ứng đến 75 ( o C) (hình 4.3)

+ Còn với enzyme cố định thì chúng tôi không thấy hiện tượng bị mất hoạt tính ở sau 65 ( o C) như enzyme tự do Khi nhiệt độ càng tăng thì hoạt tính của enzyme cố định càng tăng và thậm chí ở 75 ( o C) vẫn tăng (hình 4.6), không thấy hiện tượng bị mất hoạt tính, điều này chứng tỏ chất mang có tác dụng bảo vệ enzyme ở điều kiện nhiệt độ cao

Theo các kết quả và phân tích ở phần khảo sát nhiệt độ enzyme cố định và tự do, chúng tôi chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng của enzyme cố định không thể chỉ dựa vào hoạt tính của enzyme cố định (chọn nhiệt độ mà ở đó hoạt tính enzyme cố định cao nhất) mà phải còn tùy thuộc vào nhiệt độ mất hoạt tính của enzyme tự do Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng của enzyme cố định là 60 ( o C) vì sau 60 ( o C) thì enzyme tự do bắt đầu mất hoạt tính (hình 4.3) Kết quả phù hợp với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) và Iraj ghazi, Lucía Fernández–arrojo, Aranzazu Gomez de Segura, Miguel Alcalde, Francisco j Plou, Antonio Ballesteros (2006) chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 60 ( o C), cao hơn kết quả của Zs Csanádi, Cs Sisak (2006) chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 53 ( o C)

4.4.2 Ảnh hưởng của vận tốc lắc đến khả năng hoạt động của chế phẩm enzyme cố định

Mục tiêu của phần này là khảo sát xem ở môi trường lắc có làm tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất và enzyme cố định hay không, thông qua sự thay đổi của hoạt tính

Khảo sát vận tốc từ 50 (vòng/phút) đến 150 (vòng/phút), khoảng bước nhảy

+ Nồng độ cơ chất sucrose ban đầu 40 (%) (w/v) (pH =5,42, đo sau khi pha dung dịch cơ chất), không chỉnh pH

B ả ng 4.10: K ế t qu ả t ố i ư u kh ả o sát v ậ n t ố c l ắ c c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

Hình 4.7: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự ả nh h ưở ng c ủ a v ậ n t ố c l ắ c đế n kh ả n ă ng ho ạ t độ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy vận tốc lắc ảnh hưởng mạnh đến khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme cố định, khi vận tốc lắc càng tăng thì hoạt tính càng tăng và đạt cực đại ở vận tốc 90 (vòng/phút), sau đó nếu tăng vận tốc lắc nữa thì hoạt tính bị giảm (hình 4.7), do khi đó thì môi trường lắc quá mạnh làm cơ chất chưa tiếp xúc và khuếch tán vào hạt enzyme cố định

Sản xuất FOS

Sau khi có các điều kiện tối ưu về nhiệt độ, nồng độ cơ chất, thì yếu tố quyết định để nâng cao hàm lượng FOS trong dung dịch cũng như tận dụng triệt để cơ chất sucrose, phụ thuộc rất nhiều vào thời gian phản ứng sản xuất FOS đối với cả enzyme tự do và enzyme cố định

Hàm lượng FOS tương ứng với hàm lượng đường khử trong dung dịch phản ứng, hàm lượng đường khử càng lớn thì FOS càng nhiều

4.5.1 Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme tự do

Bước đầu sử dụng enzyme tự do để sản xuất, mục đích là sử dụng kết quả để đối chứng với enzyme cố định và có cái nhìn tổng quan về quá trình sản xuất theo quy mô phòng thí nghiệm

B ả ng 4.12: K ế t qu ả kh ả o sát th ờ i gian ph ả n ứ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme t ự do

Hàm lượng đường khử (mg/ml) của mẫu Etd

+ Lượng cơ chất phản ứng 100 (ml) + Lượng enzyme phản ứng: 1(ml) enzyme tự do + Nhiệt độ phản ứng 60,00 ( o C)

Hình 4.9: Đồ th ị bi ể u di ễ n hàm l ượ ng đườ ng kh ử sinh ra theo th ờ i gian ph ả n ứ ng đố i v ớ i ch ế ph ẩ m enzyme t ự do

Theo kết quả khảo sát cho chúng tôi thấy khi kéo dài thời gian phản ứng thì hàm lượng đường khử sinh ra càng nhiều, hàm lượng đường khử đạt 164,17 (mg/ml) ở 12 (h) và sau đó trở đi thì lượng FOS sinh ra bắt đầu ổn định (hình 4.9) Thời gian ngắn hơn khi so với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan

(2004) thời gian phản ứng là 24 (h)

Sau khi có kết quả của quá trình sản xuất sử dụng enzyme tự do thì chúng tôi tiếp tục tiến hành cho enzyme cố định Quá trình sản xuất FOS bởi enzyme cố định được ứng dụng trong 2 hệ thống: hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ thống phản ứng dạng cột

4.5.2 Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định trong hệ thống phản ứng dạng lắc

Enzyme cố định và cơ chất được cho vào erlen, phản ứng trong bể lắc ổn nhiệt Sau một khoảng thời gian xác định, chúng tôi lấy mẫu và xác định hoạt tính Quá trình sản xuất theo quy mô phòng thí nghiệm

+ Lượng cơ chất phản ứng 100 (ml) + Lượng enzyme phản ứng: 3,0 (g) enzyme cố định + Nhiệt độ phản ứng 60,00 ( o C)

+ Vận tốc lắc 90 (vòng/phút)

Hình 4.10: Đồ th ị bi ể u di ễ n hàm l ượ ng đườ ng kh ử sinh ra theo th ờ i gian trong h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng l ắ c

B ả ng 4.13: K ế t qu ả kh ả o sát th ờ i gian ph ả n ứ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh trong h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng l ắ c

Hàm lượng đường khử (mg/ml) của mẫu Ecđ

Tương tự như enzyme tự do khi kéo dài thời gian phản ứng trong hệ thống phản ứng dạng lắc thì hàm lượng đường khử sinh ra càng nhiều, hàm lượng đường khử đạt cực đại ở 17 (h) (149,110 mg/ml) và sau 17 (h) thì phản ứng đạt cân bằng, hàm lượng đường khử chỉ dao động lên xuống xung quanh điểm cực đại (hình 4.10) Thời gian ngắn hơn khi so với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) thời gian phản ứng là 24 (h)

4.5.3 Sản xuất FOS sử dụng chế phẩm enzyme cố định trong hệ thống phản ứng dạng cột

Bước đầu ứng dụng enzyme cố định vào trong hệ thống phản ứng dạng cột để sản xuất Quá trình sản xuất theo quy mô phòng thí nghiệm

Hệ thống gồm: cột, bể điều nhiệt và bơm định lượng

+ Thông số cột: đường kính: 6,00 (mm), chiều dài: 200,00 (mm), dạng ống lồng ống

+ Thông số bơm: vận tốc bơm: 4 (vòng/phút) Các thông số được cố định:

+ Lượng cơ chất phản ứng 100 (ml) + Lượng enzyme phản ứng: 3,0 (g) enzyme cố định + Nhiệt độ phản ứng 60,00 ( o C)

+ Vận tốc bơm: 4 (vòng/phút)

Nguyên tắc hoạt động: enzyme được nhồi trong cột, cơ chất được bơm từ dưới lên, cột được điều chỉnh nhiệt độ bằng bể ổn nhiệt, sản phẩm được lấy ra ở đầu trên của cột và cho tuần hoàn lại

74 Ả nh 4.9: H ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng c ộ t (1): Bơm định lượng, (2): Cơ chất, (3): Cột, (4): Sản phẩm

B ả ng 4.14: K ế t qu ả kh ả o sát th ờ i gian ph ả n ứ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh trong h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng c ộ t

Hàm lượng đường khử (mg/ml) của mẫu Ecđ

Hình 4.11: Đồ th ị bi ể u di ễ n hàm l ượ ng đườ ng kh ử sinh ra theo th ờ i gian trong h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng c ộ t

Quá trình khảo sát thời gian phản ứng sản xuất FOS trong hệ thống phản ứng dạng cột chỉ khảo sát từ 14 (h) trở đi (tham khảo số liệu phần sản xuất FOS của enzyme cố định trong hệ thống phản ứng dạng lắc và enzyme tự do để chọn thời gian bắt đầu lấy mẫu) Kết quả hàm lượng đường khử (166,271 mg/ml) đạt cực đại ở 20 (h) và sau đó phản ứng cân bằng (hình 4.11) Thời gian ngắn hơn khi so với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) thời gian phản ứng là 24 (h)

4.5.4 So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ thống phản ứng dạng cột

Hiện tượng cân bằng phản ứng đối với cả enzyme cố định và enzyme tự do có thể do nồng độ sản phẩm cao quá, xung quanh enzyme chỉ có sản phẩm, khả năng cơ chất tiếp xúc với enzyme giảm nên phản ứng đạt cân bằng

B ả ng 4.15: So sánh hiệu quả sản xuất FOS giữa hệ thống phản ứng dạng lắc và hệ thống phản ứng dạng cột

Hệ thống phản ứng dạng lắc

Hệ thống phản ứng dạng cột Hàm lượng đường (mg/ml) của mẫu Ecđ

Hàm lượng đường (mg/ml) của mẫu Ecđ

Hình 4.12: Đồ th ị bi ể u di ễ n hàm l ượ ng đườ ng kh ử sinh ra theo th ờ i gian trong h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng c ộ t và h ệ th ố ng ph ả n ứ ng d ạ ng l ắ c

Kết quả sản xuất FOS trong hệ thống phản ứng dạng lắc đạt cân bằng ở 17 (h), còn hệ thống phản ứng dạng cột thì lượng đường khử sau 17 (h) vẫn còn tăng cho đến 20 (h) mới đạt cân bằng (hình 4.12) Khả năng hoạt động của enzyme cố định trong hệ thống phản ứng dạng cột cao hơn khi so với hệ thống phản ứng dạng lắc có thể do:

+ Hệ thống phản ứng dạng cột: cơ chất được định hướng và chủ động tiếp xúc với enzyme cố định dưới tác động của bơm, áp lực của bơm giúp cơ chất di chuyển vào chất mang và đẩy sản phẩm thoát ra khỏi enzyme cố định Đồng thời môi trường phản ứng ổn định, không có sự xáo trộn đột ngột

+ Hệ thống phản ứng dạng lắc: cơ chất không được định hướng, cơ chất tiếp xúc với enzyme nhờ vào sự khuếch tán do lắc đảo Sản phẩm cũng tương tự như cơ chất, sản phẩm trong hạt enzyme cố định chỉ thoát ra ngoài nhờ vào sự khuếch tán do lắc và sự chênh lệch nồng độ Ngoài ra môi trường phản ứng dạng lắc thì không ổn định luôn luôn chuyển động

Khi so sánh với enzyme tự do về khả năng sản xuất FOS thông qua lượng đường khử hình thành ở cả 2 hệ thống thì khá cao, cụ thể:

+ Hệ thống phản ứng dạng lắc ở 17 (h) đạt 84,66 (%) + Hệ thống phản ứng dạng cột ở 20 (h) đạt 90,72 (%)

Kết quả phân tích Sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

Mẫu sản phẩm của quá trình sản xuất FOS sử dụng enzyme tự do và enzyme cố định (phản ứng trong hệ thống phản ứng dạng cột) được đem phân tích HPLC ở phòng quản lý chất lượng công ty NANOGEN Biopharmaceutical Ltd

Các thông số chạy HPLC:

+ Cột C 18 kích thước: 4,6(mm) x 250(mm) + Đầu dò: RI

+ Thể tớch tiờm: 100 (àl) + Nhiệt độ chạy cột: 25 ( o C)

+ mp (pha động) : ACN:H2O + Vận tốc bơm: 0,7 (ml/phút) + Mẫu chuẩn:

– Glucose độ tinh sạch ≥ 98 (%) nồng độ 2 (mg/ml) – Merck

– số lô: K40346774 939 – Sucrose độ tinh sạch ≥ 98 (%) nồng độ 2,22 (mg/ml) –

Merck – số lô: K40992287 038 – 1–Kestose độ tinh sạch ≥ 98 (%) nồng độ 2 (mg/ml) –

Sigma – số lô: BCBC4900, CAS 470–69–9, 72555 + Mẫu sản phẩm pha loãng 50 lần

Kết quả phân tích HPLC của mẫu trắng, mẫu chuẩn chạy riêng, mẫu chuẩn chạy chung:

+ Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu nước cất, xem phụ lục 16 + Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu chuẩn glucose, xem phụ lục 17 + Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu chuẩn sucrose, xem phụ lục 18 + Phổ sắc kí lỏng cao áp của mẫu chuẩn 1–kestose, xem phụ lục 19 + Phổ sắc kí lỏng cao áp của 3 mẫu chuẩn glucose, sucrose, 1–kestose – chạy lần 1, xem phụ lục 20

+ Phổ sắc kí lỏng cao áp của 3 mẫu chuẩn glucose, sucrose, 1–kestose – chạy lần 2, xem phụ lục 21

Kết quả phân tích HPLC của mẫu thu được khi sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP–L chuyển hóa sucrose đạt như sau:

Hình 4.13: Ph ổ s ắ c kí l ỏ ng cao áp c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme t ự do s ả n xu ấ t - ch ạ y l ầ n 1

Hình 4.14: Ph ổ s ắ c kí l ỏ ng cao áp c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme t ự do s ả n xu ấ t - ch ạ y l ầ n 2

Hình 4.15: Ph ổ s ắ c kí l ỏ ng cao áp c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh s ả n xu ấ t - ch ạ y l ầ n 1

Hình 4.16: Ph ổ s ắ c kí l ỏ ng cao áp c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh s ả n xu ấ t - ch ạ y l ầ n 2

Từ các kết quả chạy HPLC của mẫu chuẩn và mẫu FOS chúng tôi có thể tính toán được nồng độ các chất có trong sản phẩm một cách chính xác (lấy kết quả trung bình của 2 lần chạy trước khi tính)

B ả ng 4.16: K ế t qu ả tính toán phân tích HPLC c ủ a m ẫ u chu ẩ n

Diện tích peak (trung bình của 2 lần chạy)

Hàm lượng phần trăm (%) (trung bình của 2 lần chạy)

B ả ng 4.17: K ế t qu ả tính toán phân tích HPLC c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme t ự do s ả n xu ấ t

Hàm lượng (mg/ml) (đã tính so với chuẩn và quy về độ pha loãng ban đầu)

B ả ng 4.18: K ế t qu ả tính toán phân tích HPLC c ủ a m ẫ u FOS s ử d ụ ng ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh s ả n xu ấ t

Hàm lượng (mg/ml) (đã tính so với chuẩn và quy về độ pha loãng ban đầu)

Hình 4.17: Đồ th ị so sánh t ỉ l ệ (%) các lo ạ i đườ ng trong m ẫ u FOS

Theo kết quả phân tích ở trên chúng tôi thấy tổng hàm lượng FOS trong mẫu sản xuất sử dụng enzyme tự do đạt 53,49 (%), trong đó hàm lượng 1– kestose là 192,621 (mg/ml) chiếm 40,13 (%), còn lại 13,36 (%) là nystose và fructofuranosylnystose (do không có chất chuẩn nên không biết chính xác hàm lượng) Còn đối với mẫu FOS của enzyme cố định thì tổng hàm lượng FOS đạt 47,87 (%), trong đó hàm lượng 1–kestose là 196,04 (mg/ml) chiếm 37,06 (%), còn lại 10,81 (%) là nystose và fructofuranosylnystose Khả năng sản xuất FOS của enzyme cố định khi so với enzyme tự do là khá cao, lên đến 89,49 (%)

Kết quả phù hợp với kết quả của Iraj ghazi, Lucía Fernández–arrojo, Aranzazu Gomez de Segura, Miguel Alcalde, Francisco j Plou, Antonio Ballesteros (2006) sau 140 (h) phản ứng tiến dần tới cân bằng với hàm lượng FOS dao động từ 49 (%) và 42 (%) ở syrup đường và mật rỉ đường Thấp hơn kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) tổng hàm lượng fructooligosaccharide là 57 (%) sau 24 (h) phản ứng.

Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm enzyme cố định

Sau mỗi lần sản xuất thì enzyme cố định được giữ lại để cho các mẻ sản xuất sau tiếp tục sử dụng, mục đích của quá trình khảo sát này là xem khả năng của enzyme cố định có thể hoạt động được bao nhiêu lần dưới thời gian phản ứng khá dài, 17 (h) đối với hệ thống phản ứng dạng lắc và 20 (h) đối với hệ thống phản ứng dạng cột

Các thông số phản ứng như lượng enzyme cố định phản ứng, nhiêt độ phản ứng… cũng giống như quá trình sản xuất FOS

Theo kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định chúng tôi thấy: enzyme cố định trong hệ thống phản ứng dạng cột thì khả năng tái sử dụng cao hơn nhiều lần so với hệ thống phản ứng dạng lắc, lý do hệ thống phản ứng dạng cột hiệu quả hơn đã được trình bài ở mục 4.5.4 Đối với hệ thống phản ứng dạng lắc thì ở lần tái sử dụng thứ 4 hoạt tính chỉ còn 48,77 (%), trong khí đó đối với hệ thống phản ứng dạng cột thì ở lần tái sử dụng thứ 11 hoạt tính còn mới giảm xuống 49,93 (%) (bảng 4.19)

B ả ng 4.19: K ế t qu ả kh ả o sát kh ả n ă ng tái s ử d ụ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

Hiệu suất hoạt tính so với ban đầu (%)

Hệ thống phản ứng dạng lắc Hệ thồng phản ứng dạng cột

Hình 4.18: Đồ th ị bi ể u di ễ n kh ả n ă ng tái s ử d ụ ng c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh

Kết quả cao hơn của Zs Csanádi, Cs Sisak (2006) tái sử dụng enzyme cố định được 12 lần (điều kiện tái sử dụng: nhiệt độ 55 o C, pH 5,6, thời gian phản ứng 120 phút) và Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) tái sử dụng enzyme cố định được 20 lần (điều kiện tái sử dụng: nhiệt độ 60 o C, pH 5,5÷6,5, thời gian phản ứng 60 phút).

Khảo sát điều kiện bảo quản của chế phẩm enzyme cố định

Enzyme sau quá trình cố định được bảo quản dưới 2 dạng:

+ Dạng khô, nhiệt độ từ 2 ( o C) – 6 ( o C) trong ngăn mát tủ lạnh

+ Và dạng trong dung dịch CaCl2 3,75 (%), nhiệt độ từ 2 ( o C) – 6 ( o C) trong ngăn mát tủ lạnh

Các thông số điều kiện tối ưu cho quá trình cố định được thực hiện như mục 4.2 Các thông số phản ứng và xác định hoạt tính được thực hiện theo mục 3.2.1.3

B ả ng 4.20: K ế t qu ả kh ả o sát quá trình b ả o qu ả n ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh ở d ạ ng khô

Ngày phản ứng sau khi cđ (ngày)

HS HT so với ban đầu (%)

B ả ng 4.21: K ế t qu ả kh ả o sát quá trình b ả o qu ả n ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh ở d ạ ng ướ t trong dung d ị ch CaCl 2 3,75 (%)

Ngày phản ứng sau khi cđ (ngày)

HS HT so với ban đầu (%)

Hình 4.19: Đồ th ị bi ể u di ễ n s ự thay đổ i ho ạ t tính c ủ a ch ế ph ẩ m enzyme c ố đị nh theo th ờ i gian trong 2 đ i ề u ki ệ n b ả o qu ả n

Từ các kết quả khảo sát chúng tôi thấy enzyme cố định bảo quản khô tốt hơn nhiều lần so với enzyme cố định bảo quản trong dung dịch CaCl2 Sau 30 ngày mà hoạt tính enzyme cố định vẫn còn 84,95 (%) so với ban đầu, trong khi đó thì enzyme cố định bảo quản trong dung dịch CaCl2 chỉ còn 57,19 (%) Chúng tôi chọn điều kiện bảo quản khô (nhiệt độ từ 2 ( o C) – 6 ( o C) trong ngăn mát tủ lạnh) làm điều kiện bảo quản cho enzyme cố định Kết quả cao hơn khi so với kết quả của Aziz Tanriseven, Yakup Aslan (2004) bảo quản enzyme cố định trong 20 ngày

Tiêu đề	Nghiên cứu sản xuất fructooligosaccharide (FOS) bởi enzyme PectinEX Ultra SP–L cố định trên alginate
Tác giả	Huỳnh Duy Tân
Người hướng dẫn	TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Trường học	Đại học Quốc Gia Tp. HCM
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Luận Văn Thạc Sĩ
Năm xuất bản	2012
Thành phố	Tp. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	130
Dung lượng	2,86 MB