Nghiên cứu chiết alginate từ rong mơ sagassum oligocystum thu mẫu tại ninh thuận

36 3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl dùng xử lý rong đến hàm lượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 36 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm hượng và hoạt tính sinh học

LÊ THỊ QUỲNH NHƯ

NGHIÊN CỨU CHIẾT ALGINATE TỪ RONG MƠ SARGASSUM

OLIGOCYSTUM THU MẪU TẠI NINH THUẬN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (Ngành: Công nghệ thực phẩm)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

1) ThS Nguyễn Thị Mỹ Trang 2) Ts Đặng Xuân Cường

Nha Trang – Năm: 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này,

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: ThS Nguyễn Thị Mỹ Trang - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm và TS Đặng Xuân Cường - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn PGS TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, TS Thái Văn Đức - Trưởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ các phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Nha Trang, ngày…tháng…năm 2017

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Quỳnh Như

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT i

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG ix

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG MƠ SARGASSUM OLIGOCYSTUM 1

1.1.1 Giới thiệu về rong mơ Sargassum oligocystum 1

1.1.2 Phân bố 1

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của rong mơ 2

1.1.4 Ứng dụng của rong mơ 6

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ALGINATE 6

1.2.1 Nguồn gốc 6

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của alginate 7

1.2.3 Phân loại alginate 7

1.2.4 Tính chất alginate 9

1.2.5 Ứng dụng alginate 9

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13

1.3.1 Nghiên cứu trong nước 13

1.3.2 Nghiên cứu ngoài nước 13

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 14

1.4.1 Cơ sở của quá trình chiết 14

1.4.2 Các phương pháp chiết bằng dung môi 15

1.4.3 Một số phương pháp tách chiết khác 16

1.4.4 Phương pháp chiết khuếch tán làm giàu 17

1.4.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 18

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN LIỆU 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Phương pháp phân tích 20

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 34

2.3.1 Hóa chất 34

2.3.2 Thiết bị chủ yếu đã sử dụng 35

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 35

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH CHIẾT RÚT ALGINATE TỪ RONG MƠ S OLIGOCYSTUM THU MẪU TẠI NINH THUẬN 36

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl dùng xử lý rong đến hàm lượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 36 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm hượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 43

3.1.4 Ảnh hưởng của pH môi trường chiết đến hàm hượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 48

3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL chiết đến hàm hượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 52

3.1.4 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm hượng và hoạt tính sinh học của dịch chiết alginate 57

3.2 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CHIẾT RÚT ALGINATE TỪ RONG MƠ SARGASSUM OLIGOCYSTUM 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Cấu tạo của alginic acid 4

Hình 1 2: Đặc trưng cấu trúc của alginate 7

Hình 1 3: Công thức cấu tạo alginate Natri 8

Hình 1 4: Công thức cấu tạo alginate Canxi 8

Hình 1 5: Cấu tạo của alginate Propylen glycon 9

Hình 2 2.Sargassum oligocystum nghiền nhỏ 20

Hình 2 1 Sargassum oligocystum 20

Hình 2 3.Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu 24

Hình 2 4 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định nồng độ HCl dùng xử lý rong 26

Hình 2 5 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định nhiệt độ chiết 27

Hình 2 6 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định thời gian chiết 28

Hình 2 7 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định pH môi trường chiết 29

Hình 2 8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ DM/NL 30

Hình 2 9 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định số lần chiết 31

Hình 2 10 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết alginate từ rong mơ 32

Hình 3 1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl dùng xử lý rong đến hàm lượng alginate thu được 36

Hình 3 2 Ảnh hưởng của nồng độ HCl dùng xử lý rong đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginic acid 37

Hình 3 3: Ảnh hưởng của nồng độ HCl dùng xử lý rong đến hoạt tính khử sắt của dung dịch alginic acid 37

Hình 3 4: Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 38

Hình 3 5: Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 39 Hình 3 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm hượng alginate thu được 40 Hình 3 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginic acid 41 Hình 3 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginic acid 41 Hình 3 9 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 42 Hình 3 10 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính khử sắt của dịch chiết 43 Hình 3 11 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm hượng alginatethu được 44 Hình 3 12 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết alginic acid 45 Hình 3 13 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginic acid 45 Hình 3 14 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 47 Hình 3 15 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính khử sắt của dịch chiết 48 Hình 3 16 Ảnh hưởng pH của môi trường chiết đến hàm hượng alginate thu được 49 Hình 3 17: Ảnh hưởng của môi trường pH đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginic acid 49 Hình 3 18.Ảnh hưởng của môi trường pH đến hoạt tính khử sắt của dung dịch alginic acid 50

Hình 3 19 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 51 Hình 3 20 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính khử sắt của dịch chiết 52 Hình 3 21 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hàm hượng alginatethu được 53 Hình 3 22 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginic acid 53 Hình 3 23 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL đến hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginic acid 54 Hình 3 24 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 56 Hình 3 25 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính khử sắt của dịch chiết 57 Hình 3 26 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm hượng alginatethu được 58 Hình 3 27 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết alginic acid 59 Hình 3 28 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginic acid 59 Hình 3 29 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 60 Hình 3 30 Sự tương quan giữa hàm lượng alginate và hoạt tính khử sắt của dịch chiết 61

Hình 3 31 Sơ đồ quy trình chiết rút alginate từ rong mơ Sargassum oligocystum 62

Hình h 1 Đường chuẩn xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng 69 Hình h 2 Đường chuẩn xác định hoạt tính khử Fe 69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh 2 Bảng 1 2: Hàm lượng Manitol trong 2 loài rong ở vùng biển miền Trung Việt Nam 4

Bảng 2 1 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng 22 Bảng 2 2 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính khử Fe 23

Bảng b 1 Hàm lượng alginate của dịch chiết rong mơ S oligocystum xử lý ở nồng

oligocystum xử lý HCl ở nồng độ khác nhau 74

Bảng b 8.Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginate từ rong mơ S

oligocystum ở nhiệt độ chiết khác nhau 74

Bảng b 9.Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginate từ rong mơ S

oligocystum ở thời gian chiết khác nhau 75

Bảng b 10.Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginate từ rong mơ S

oligocystum với môi trường pH chiết khác nhau 75

Bảng b 11.Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginate từ rong mơ S

oligocystum với tỷ lệ DM/NL khác nhau 76

Bảng b 12.Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết alginate từ rong mơ S

oligocystum với số lần chiết khác nhau 76

Bảng b 13.Hoạt tính khử Fe của algiante chiết từ rong mơ S oligocystum xử lý HCl

nồng độ khác nhau 77

Bảng b 14.Hoạt tính khử Fe của algiante chiết từ rong mơ S oligocystum với nhiệt

độ chiết khác nhau 77

Bảng b 15.Hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginate từ rong mơ S oligocystum với

thời gian chiết khác nhau 78

Bảng b 16.Hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginate từ rong mơ S oligocystum với

môi trường pH chiết khác nhau 78

Bảng b 17.Hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginate từ rong mơ S oligocystum với

tỷ lệ DM/NL chiết khác nhau 79

Bảng b 18.Hoạt tính khử Fe của dịch chiết alginate từ rong mơ S oligocystum với

số lần chiết khác nhau 79

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là đất nước ở vùng nhiệt đới và có thềm lục địa rộng trên 1 triệu

km2, là điều kiện thuận lợi cho việc phát triển lĩnh vực nghiên cứu chế biến rong biển Biển Việt Nam khá phong phú về thành phần loài rong và có trữ lượng khai thác lớn Trong rong biển, rong mơ là đối tượng có giá trị cao do có chứa nhiều chất

có hoạt tính sinh học alginate, fucoidan, phlorotanin…

Alginate là một polysaccharide có khả năng tạo gel nên được ứng dụng làm phụ gia thực phẩm và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như dược phẩm, hóa dầu,… Mặt khác từ alginate, người ta có thể tạo ra oligoalginate có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như hoạt tính chống đông tự máu,… Hiện đã có một số công trình nghiên cứu về alginate ở rong mơ thu mẫu tại Nha Trang Tuy vậy, việc nghiên cứu đánh giá các chất sinh học có trong rong mơ Ninh Thuận trong đó có alginate vẫn chưa được quan tâm đúng mực Do vậy, được sự đồng ý của khoa

Công nghệ Thực phẩm, em được giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết alginate

từ rong mơ Sargassum oligocystum thu mẫu tại Ninh Thuận”

Mục đích nghiên cứu:

Đánh giá phương pháp chiết xuất khuếch tán làm giàu làm tăng khả năng thu nhận alginate

Nội dung nghiên cứu:

1) Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình chiết rút alginate từ rong mơ S oligocystum thu mẫu tại Ninh Thuận

2) Đề xuất quy trình chiết rút alginate từ rong mơ S oligocystum thu mẫu tại Ninh Thuận

Do bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học và kiến thức của bản thân còn rất hạn chế, nên báo cáo này chắc hẳn không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được các góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để bài báo cáo thêm hoàn chỉnh Em xin chân thành cám ơn

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về rong mơ Sargassum oligocystum

Rong mơ có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm

thấy trong nước ngọt không nhiều lắm [5] Rong S oligocystum có cấu tạo nhiều tế

bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, thân, lá Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng

Rong mơ S oligocystum có Tản hình sợi (cơ quan dinh dưỡng), dài 50-70cm

đến trên 2m Phiến mỏng dạng lá có hình bầu dục hẹp hay hình mũi giáo, dài 3-4cm mép lượn sóng hoặc có răng cưa nhỏ Phao hình cầu hay hình trái xoan, đường kính 4mm Đĩa bám dùng để dính vào vật bám như đá hay san hô… (không có chức năng hấp thụ nước và muối khoáng như rễ của các loài thực vật sống trên cạn) Khi khô rong có màu nâu và thường khó phân biệt các loài rong chi này [7]

Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ vị trí thẳng đứng trong môi trường biển Nếu nước cạn và rong khá dài thì phần trên của rong nằm trên mặt nước [5]

1.1.2 Phân bố

Rong mơ được phân bố dọc bờ biển nước ta, khu vực miền Trung và phía Nam, rong mơ tập trung chính tại các tỉnh: Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa thiên

Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh

Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu, Kiên Giang, cụ thể ở Bảng 1.1 sau:

Bảng 1 1: Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh [7]

Các địa danh Diện tích (m 2 ) Năng suất sinh lượng

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của rong mơ

1.1.3.1 Nước

Chiếm tỉ lệ lớn trong cây rong, khoảng 60-90%, có trường hợp lớn hơn khoảng 75-85% Nhìn chung xu hướng biến động hàm lượng nước trong rong là giảm dần theo thời gian sinh trưởng vì với cơ thể còn non sức sống càng mạnh thì quá trình trao đổi chất xảy ra liên tục, hàm lượng nước tích lũy phải nhiều và tất nhiên cơ thể già thì hàm lượng đó giảm đi [7]

1.1.3.2 Protein [7]

Là thành phần không thể thiếu được của các cơ thể sống, nhưng lại có tính đặc thù cao cho từng loài, từng cá thể của từng loài, từng cơ quan, mô của từng loại cá thể Protein trong rong có một số đặc tính cơ bản sau Hàm lượng protein biến động theo loài, thậm chí trong cùng một giống cũng có sự biến động, hàm lượng protein trong rong mơ là 5,0-20,5% trọng lượng khô của rong

- Hàm lượng rong biến động theo thời gian sinh trưởng: khi rong biển phát triển, quá trình tích lũy các chất chưa nhiều, hàm lượng protein còn rất thấp, sau đó tăng lên theo sự tăng thể tích và chiều dài của rong Trong thời kỳ phát triển mạnh nhất protein được tổng hợp với lượng khá cao, sau đó giảm dần và đến khi tế bào tàn lụi thì còn lại không đáng kể

- Hàm lượng protein biến đổi theo môi trường sống: điều kiện sống là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình tích lũy các chất trong rong Trong cùng một ngành rong nếu điều kiện sống khác nhau Môi trường giàu đạm tạo điều kiện cho rong có khả năng hấp thu lớn và hàm lượng protein sẽ cao

1.1.3.3 Glucid [7]

Là thành phần hóa học quan trọng bậc nhất mà các nhà khoa học rong biển quan tâm xem xét Tỉ lệ thành phần glucid trong các ngành rong rất khác nhau mang những đặt trưng rất riêng biệt Trong rong mơ, hàm lượng glucid đạt đến 73-74% trọng lượng khô của rong

Quan trọng trong rong mơ là đường Mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm

Mannitol có công thức tổng quát: HOCH2-(CHOH)4-CH2OH

Mantinol tan được trong alcol, dễ tan trong nước, có vị ngọt, hàm lượng từ 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống

Trong quá trình bảo quản rong khô, có hiện tượng xuất hiện các đốm trắng trên thân cây rong, đó là hỗn hợp muối và đường mannitol theo tỉ lệ: muối 60 - 80%, mannitol 20 - 40% Rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy

Hàm lượng Mannitol biến động theo thời gian sinh trưởng trong năm của rong

mơ rõ rệt, tăng dần từ tháng 1, tập trung cao vào mùa hè (tháng 4) rồi sau đó giảm

đi

Bảng 1 2: Hàm lượng Manitol trong 2 loài rong ở vùng biển miền Trung Việt

Nam [7]

- Là một polysaccarit tập trung ở giữa vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong mơ

- Hàm lượng alginic trong các loại rong mơ khoảng 2 - 4% so với rong tươi và

13 - 15% so với rong khô Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống Theo các tài liệu tổng kết của Miyake (1959) cho thấy hàm lượng alginic trong các loài rong mơ có ở các vùng biển Liên Xô cũ là 11-40%

- Sự tồn tại của alginic trong tế bào ở dạng gì còn nhiều quan điểm tranh cãi, nhưng số đông cho rằng alginic tồn tại ở dạng muối Canxi không tan và ở dạng keo

 Tính chất alginic và muối alginate

Hình 1 1: Cấu tạo của alginic acid

- Alginic là acid hữu cơ yếu, không màu, không mùi, không tan trong các dung môi hữu cơ và nước

- Khi ngâm vào nước thì alginic hút nước trương nở nó có thể hút được lượng nước từ 10 - 20 lần trọng lượng của nó

- Alginic thuộc polysaccarit chứa nhóm cacboxyl (-COOH) trong phân tử nên thường được gọi là alginic acid hay polysaccarit có tính acid

- Alginic hòa tan trong dung dịch kiềm hóa trị I và tạo dung dịch muối kiềm

có độ nhớt cao Chẳng hạn alginic hòa tan trong dung dịch Hydroxit Natri và tạo thành dung dịch alginate Natri có độ nhớt cao

- Khi cho acid mạnh tác dụng với muối kiềm thì alginic được tách ra kết tủa nổi lên bề mặt dung dịch

- Muối alginate hóa trị I: dễ hòa tan trong nước, tạo dung dịch keo nhớt, có độ dính, độ nhớt cao, khi làm lạnh không đông, khi khô trong suốt có tính đàn hồi

- Muối alginate hóa trị II: không tan trong nước, tùy theo kim loại mà có màu khác nhau Khi muối ẩm thì dẻo dễ uốn hình, khi khô rất cứng, rất khó thấm nước

1.1.3.4 Lipid

Hàm lượng lipid trong rong mơ không lớn lắm khoảng 1 - 3%, đặc điểm của lipid trong rong phần lớn là những lipid chưa no, vô hại, có sterol mà các ngành thực vật khác không thấy [7]

điều mới lạ như nguyên tố vi lượng tích lũy trong rong mơ có thể gấp hàng chục lần hay lớn hơn có trong nước biển Các nhà khoa học cũng chứng minh rằng alginate Natri-chất đặc trưng của rong mơ có tác dụng hấp thụ các chất phóng xạ Khi được

ăn vào cơ thể các chất này sẽ hấp thụ hết các chất phóng xạ rồi thải ra ngoài cơ thể Đặc điểm này làm cho rong mơ trở nên rất quý giá đối với những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng xạ trong các nhà máy điện nguyên tử hay viện vật lí hạt nhân

1.1.3.7 Sắc tố

Sắc tố trong rong mơ là diệp lục tố, diệp hoàng tố, sắc tố nâu, sắc tố đỏ, tùy theo tỉ lệ các loại sắc tố này mà rong thường có màu nâu - vàng nâu – nâu đậm – vàng lục Nhìn chung sắc tố trong rong nâu khá bền [7]

1.1.4 Ứng dụng của rong mơ [7]

Một số thành phần của rong mơ được sử dụng rộng rãi trong các ngành y dược, công nghiệp, nông nghiệp và thực phẩm.Chính vì những ứng dụng quan trọng của chúng mà rong mơ ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu Trong y học, rong mơ là nguyên liệu chính sản xuất keo alginate dùng để bao viên thuốc, đã được nghiên cứu làm huyết thanh nhân tạo, làm chỉ khâu vết mổ, chất sát trùng, thuốc cầm máu Rong mơ có chứa nhiều iod nên có thể ngừa và trị bệnh bướu

cổ Ngoài ra, dân gian còn sử dụng rong mơ để chữa ho, thủy thũng và một số bệnh ngoài da

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ALGINATE

1.2.1 Nguồn gốc

Alginate là loại polyme sinh học có nguồn gốc từ biển phong phú nhất thế giới, là loại polyme sinh học nhiều thứ hai sau cellulose Theo tài liệu, alginate được nhà hóa học người Anh E.C.C Stanford tìm ra năm 1881, là một polysaccarit có mặt trong rong nâu với hàm lượng cao nhất, lên đến 40% khối lượng chất khô Alginate nằm trong hệ thống gian bào ở dạng gel chứa các ion Natri, Canxi, Magie, Stronti

và Bari Chức năng chính của chúng được cho là bộ khung, tạo nên cả độ bền vững

lẫn độ mềm dẻo của mô rong [7]

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của alginate [7]

Alginate là tên gọi chung các muối của alginic acid Trong thuật ngữ phân tử, alginate là một họ của copolyme nhị phân không phân nhánh gồm các gốc β-Dmannuronic (M) và α-L-guluronic (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucozid Cấu trúc khác nhau phụ thuộc vào vị trí của các monome trong chuỗi mạch, tạo nên các đoạn homopolyme (MM hoặc GG) lẫn các heteropolyme (MG hoặc GM) Khối lượng phân tử của alginate thường trong khoảng 50 - 1000kDa [7]

a) Các monome của alginate

b) Cấu trúc chuỗi, cấu dạng ghế

c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginate

1.2.3 Phân loại alginate [7]

Phân loại: theo dạng muối

Hình 1 2: Đặc trưng cấu trúc của alginate

- Alginate Natri: Công thức phân tử: (C5H7O4COONa)n

- Alginate Kali (tương tự như alginate Na)

- Alginate Canxi: Công thức phân tử: [(C5H704COO)2Ca]n

- Alginate Magie: [(C5H704COO)2Mg]n

- Alginate Amoni: (C6H11NO6)n

- Ngoài ra còn có: alginate Propylen glycon

Công thức phân tử: C5H7O4COOCH2 – CH – CH3

OH

Hình 1 3: Công thức cấu tạo alginate Natri

Hình 1 4: Công thức cấu tạo alginate Canxi

1.2.4 Tính chất alginate [7]

Một số tính chất chung: Là polymer có tính chất acid yếu, không màu, không mùi, không tan trong các dung môi hữu cơ và nước Là chất có tính chất hút nước trương nở khi ngâm trong nước

Alginic hòa tan trong dung dịch kiềm hóa trị I và tạo dung dịch muối kiềm hóa trị I hòa tan trong nước và có độ nhớt cao Ví dụ: khi cho alginic hòa tan trong dung dịch NaHCO3 thì tạo thành dung dịch alginate Natri có độ nhớt cao và tan trong nước:

Alginic + NaHCO3->Alg-Na + H2O

Muối kiềm hóa trị II không tan trong nước

Tính chất của alginate với kim loại hóa trị II:

- Có độ chắc cao

- Có khả năng tạo màu tùy theo kim loại

- Không hòa tan trong nước

- Khi ẩm thì dẻo (Gel alginate), khi khô có độ cứng cao

- Khó thấm nước, tỷ trọng thấp

1.2.5 Ứng dụng alginate [7]

1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Hình 1 5: Cấu tạo của alginate Propylen glycon

Một hợp chất của alginic có tên là Lamizell là một muối kép của Natri và Canxi với một tỷ lệ nhất định Lamizell tạo ra được một độ nhớt đặc biệt và có khả năng kích thích ăn ngon miệng, do đó rất được quan tâm trong sản xuất thực phẩm Alginate Natri cũng được dùng trong một số thực phẩm để hạn chế tăng trọng

Ví dụ: 1 g alginate Natri chỉ cung cấp 1,4 Kcal

Trong sản xuất kem, alginic và muối của nó có thể dùng làm chất ổn định trong kem ly, làm cho kem mịn có mùi thơm, chịu nóng tốt, thời gian khuấy trộn lúc sản xuất ngắn

Cho vào sữa bò với nồng độ keo alginate Natri 0,1% sẽ chống được hiện tượng các chất không hòa tan kết tủa

Khi tinh chế rượu dùng alginate Natri 1% để làm trong, nếu còn gặp khó khăn cho thêm than xương và Canxi vào

Alginate còn dùng trong sản xuất bơ, bánh kẹo, fomat, nước giải khát cũng như các mặt hàng đông lạnh

Alginate Natri được dùng làm chất bảo vệ kem lạnh với những tác dụng như sau: Ngăn ngừa tạo ra các tinh thể đá băng Ức chế hoàn toàn sự tạo thành tinh thể của Lactose Nhũ hóa các cầu béo Làm bền bọt Tạo độ nhớt cho kem Tạo gel, có khả năng giữ nước cho kem Làm cho kem không bị tan chảy

Với những thực phẩm có độ acid cao không thể dùng alginate Natri được thì propylen – glycol alginate là chất thay thế rất tốt vì nó bền được cả trong vùng pH=0 – 3

1.2.5.2 Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Alginate Natri có độ nhớt cao, tính mao dẫn kém, khi khô trong suốt, bóng và

có tính đàn hồi tốt Vì thế người ta dùng hồ vải cho sợi bền và chịu được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt

Trong công nghiệp in hoa alginate Natri là chất tạo cho thuốc nhuộm có độ dính cao đáng kể, in hoa không nhòe và rõ ràng

Ngoài ra còn dùng làm vải không thấm nước

1.2.5.3 Ứng dụng trong công nghiệp giấy

Alginate hồ lên giấy làm cho giấy bóng, dai, không gẫy, mức độ khô nhanh, viết trơn, giấy hồ alginate Natri còn làm tăng tính chịu nóng, do đó còn làm nguyên liệu để chế giấy chống cháy

Ngoài ra alginate Natri còn làm chất kết dính trong mực in

1.2.5.4 Ứng dụng trong tơ nhân tạo

Dung dịch alginate Natri nếu phun qua những lỗ nhỏ vào muối kim loại hóa trị

II hay acid thì hình thành sợi tơ Qua nghiên cứu người ta thấy rằng tơ nhân tạo alginate tương đối bền

1.2.5.5 Ứng dụng trong y học và dược học

Trong Y học alginate được dùng làm chất trị bệnh nhiễm phóng xạ vì khi người bệnh ăn alginate Natri thì nó kết hợp với Stronti rồi thải ra ngoài Hiệu suất chữa bệnh khá cao

Alginate Natri làm tăng hiệu quả chữa bệnh của penicillin vì khi có mặt alginate Natri sẽ làm cho penicillin tồn tại lâu hơn trong máu

Trong công nghệ bào chế thuốc, alginate Natri được sử dụng làm chất ổn định, nhũ tương hóa hay chất tạo đặc cho dung dịch, làm vỏ bọc thuốc, làm chất phụ gia chế các loại thức ăn kiêng

Trong nha khoa dùng alginic thay thạch cao để làm khuôn răng, nó giữ được hình răng chính xác

1.2.5.6 Trong công nghệ mỹ phẩm

Cho alginate vào hỗn hợp nước và mỡ, nó sẽ làm nước và mỡ trộn đều một cách ổn định Ví dụ: kem đánh răng gồm glycerin xà phòng, bột mùi … được trộn thành dạng nhũ tương ổn định

Alginate là chất làm nền cho phấn, sáp, nước hoa, xà phòng, giữ mùi thơm cho nước hoa xà phòng (PGA)

Làm vecni và xi, không cần đánh bóng vì cho alginate Natri vào dung dịch amoniac, khi amoniac bay hơi sẽ để lại trên nền một lớp màng bảo vệ có độ bóng cao

Alginate còn được sử dụng làm chất mang tốt trong kỹ thuật cố định tế bào, hiện nay alginate còn được làm môi trường cố định enzyme

Dùng làm chất khử tinh thể: Cho alginate vào dung dịch tạo kết tủa nó sẽ làm chất kết tủa giảm kích thước, alginate được dùng trong điện giải kim loại, sản xuất thạch cao xi măng và nhiều loại sơn

Dùng làm chất kết từ và chất kết dính trong công nghiệp sản xuất giấy hoa dán tường, gỗ tổng hợp Khi trộn với Gelatin, Alginate làm giảm điểm nóng chảy của Gelatin nên nó được dùng làm phim ảnh, kết hợp với các ion kim loại cho các sản phẩm có độ bền cao Kết hợp với cellulose tạo các chất cách điện, với propylen-glycol tạo các loại sơn, chất giữ mùi

Dùng làm chất thuộc da

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy alginate được chiết tách từ rong mơ, hoàn toàn có khả năng thay thế CMC (Cacboxyl – Metyl – Cellulose), làm phụ gia cho xi măng ở các giếng khoan dầu mỏ

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Nghiên cứu trong nước

Việc nghiên cứu tách chiết alginate ở nước ta thực hiện đầu tiên vào năm 1961 dùng để hồ sợi Năm 1966, bộ môn Chế Biến trường Đại Học Nha Trang đã tách chiết alginate từ rong mơ vùng biển Hải Phòng và đã ứng dụng vào việc in hoa trên vải [5]

Sau nhiều công trình nghiên cứu, vào năm 1978, thạc sĩ Nguyễn Huy Thục đã nghiên cứu xây dựng phương pháp sản xuất alginate Natri bán cơ giới năng suất 10 tấn/năm tại xí nghiệp chế biến Hạ Long, Hải Phòng Đây là nơi có cơ sở sản xuất alginate Natri lớn nhất nước ta Tiếc rằng sau đó với nhiều lí do, phân xưởng phải ngừng sản xuất Quy trình sản xuất alginate Natri đã được đúc kết trong hội nghị alginate Natri tại Ủy ban Khoa Học Kỹ thuật Nhà nước vào tháng 11 năm 1981 Trong báo cáo này, quy trình sản xuất với các thông số kỹ thuật cũng như định mức tiêu hao nguyên liệu đã được đúc kết Sau đó vào năm 1982, Trần Văn Ân, trong luận án PTS đã đẩy việc nghiên cứu sâu hơn trong việc cải tiến các quy trình tách chiết alginate

Hoàng Cường và cộng sự (1980), Lâm Ngọc Trâm, Ngô Đăng Nghĩa và cộng sự(1991, 1995) đã nghiên cứu thành phần hóa học, thử tách chiết mannitol cũng như nghiên cứu cấu trúc của alginic từ rong mơ[5]

Trần Văn Thi và cộng sự (2012) đã nghiên cứu và phân lập laminarin, alginate

và fucoidan trong một số loại rong nâu tại Thừa Thiên Huế Kết quả cho thấy rằng,

S henslowianum chứa hàm lượng fucoidan 5,36-5,44%, S polycystum dao động từ

8,36-8,43%[4]

1.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Thoudamvà cộng sự (2011) cũng nghiên cứu sử dụng các dung môi khác nhau

để tách chiết một số chất có hoạt tính sinh học từ rong mơ S muticum, bao gồm

alkaloids, anthraquinones, carbohydrates, flavonoids, glycosides, saponins, steroids, phenols, terpenoids và tannins [17]

Kelman và cộng sự cũng đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa củacác loài tảo biển ở Hawaii vào năm 2012 Nghiên cứu này đã xác định được hoạt tính chống oxy hóa tổng của các chất chiết xuất từ hữu cơ của 37 mẫu tảo bao gồm 30 loài của tảo Hawaii từ 27 giống khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các loài tảo phụ thuộc theo loài [11]

Lone và cộng sự (2016) đã nghiên cứu chất xơ alginate từ rong nâu Alginate

- một polyme tự hoại anion tự nhiên thu được từ tảo nâu đã được sử dụng cho nhiều ứng dụng y sinh học Các sợi tự nhiên bao gồm các polysaccharide, đã được sử dụng do tính tương thích sinh học của chúng, không độc và hoạt tính sinh học tiềm

ẩn ở bề mặt vết thương Nhiều sản phẩm băng vết thương thương mại như băng keo giữ, băng bó vết thương, chất hấp thụ, gạc, vải lụa và miếng băng vết thương được làm từ các polyme tự nhiên và các dẫn xuất của chúng, được sản xuất từ sợi xenlulo được dệt Nghiên cứu này đã được thực hiện để trích alginate từ tảo nâu Sargassum

sp thu được từ huyện Kanyakumari ở Tamil Nadu Khoảng 350 g chất xơ alginate thu được từ 500g tảo tươi [15]

Mushollaeni và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đặc tính hoá lý của alginate Natri Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu đặc điểm hóa lý của alginate Natri thu được từ

S crassifolium, S polycystum, Padina sp và S echinocarpum, phát triển trên bờ

biển san hô của Gunung Kidul Yogyakarta Indonesia Kết quả cho thấy trung bình năng suất đạt từ 16,93-30,50% Các đặc tính hóa học, đó là, nước, tro, Pb và Hg là 12,50-13,43%, 18,20-8,59%, 0,083 ± 0,01 đến 0,36 ± 0,04 ppm và 0,002 ± 0,01 đến 0,3 ± 0,05 ppm Các tính chất vật lý như độ nhớt và độ nhẹ là 25-39 cps và 46,2- 52,3 (màu vàng nâu nhạt) [15]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

1.4.1 Cơ sở của quá trình chiết [9], [10]

Chiết là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đã tách biệt, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng Quá trình chiết gồm hai giai đoạn, giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu,

sau đó thấm sâu vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào Giai đoạn 2: giai đoạn tiếp tục hòa tan các hợp chất trong các ống mao dẫn của nguyên liệu nhờvào dung môi

đã thấm sâu vào các lớp bên trong

Phương pháp tách chiết là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết Một phương pháp tách chiết thích hợp chỉ có thể được hoạch định một khi đã biết rõ thành phần của các chất cần trích ly Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp tách chiết chung áp dụng cho tất cả hợp chất thiên nhiên

1.4.2 Các phương pháp chiết bằng dung môi [9]

Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất tan trong một pha lỏng vào trong một pha lỏng khác không hòa tan với nó, nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Bên cạnh đó việc chiết thành cao dịch thô là vô cùng quan trọng vì khi đó giữ lại được hoạt chất tốt hơn và dễ dàng cho những công đoạn sau

1.4.2.1 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt

Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới Tuy vậy, ta không thực hiện liên tục mà mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới

và tiếp tục quá trình trích ly

1.4.2.2 Chiết bằng phương pháp ngâm dầm

Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả gì hơn so với phương pháp ngấm kiệt Ngâm nguyên liệu vào trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy Rót dung môi

phủ lớp mẫu, để ở điều kiện nhiệt độ theo yêu cầu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên Sau một thời gian dung môi trong bình được đổ ra

và rót dung môi mới vào

1.4.2.3 Chiết hồi lưu

Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp chiết truyền thống Sự đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ, cơ

sở của phương pháp này là sự tách các chất có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng

Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất Sự chiết suất tự động liên tục nên nhanh chóng Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu nên chỉ thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

1.4.2.4 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi

có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình chứa có mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng

tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng ete dầu hỏa hoặc ether ethylic để trích ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước

1.4.3 Một số phương pháp tách chiết khác

1.4.3.1 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) được xem như là một phương pháp chiết hữu hiệu để thay thế các phương pháp thông thường sử dụng dung môi hữu cơ (King và cộng sự, 2002) [12] Phương pháp SFE xảy ra nhanh chóng, tự động, có chọn lọc, không gây cháy nổ và tránh việc sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc hại [14]

Siêu chất lỏng dễ dàng tách các chất cần thiết do dung môi thay đổi thuộc tính nhanh chóng chỉ với các biến đổi áp lực nhẹ [10] Chất lỏng siêu tới hạn (SCFs) đang ngày càng thay thế dung môi hữu cơ như n-hexane, dichloromethane, chloroform và những dung môi khác thường sử dụng trong chiết công nghiệp, lọc,

vì quy định và sức ép môi trường về các hợp chất hữu cơ và khí thải

1.4.3.2 Chiết sử dụng sóng siêu âm

Đây là kỹ thuật chiết thay thế rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả Sóng siêu âm thường được sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic

từ thực vật, quá trình chiết các hợp chất phenol từ Folium eucommiae có sử dụng sóng siêu âm thu được hiệu quả cao hơn so với khi chiết bằng cách gia nhiệt hoặc

bổ sung enzyme hỗ trợ chiết tách (Bar, 1987) [8] Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi làm tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết [10]

1.4.4 Phương pháp chiết khuếch tán làm giàu

Nguyên tắc: Quá trình chiết là quá trình sử dụng dung môi để chất tan khuếch tán từ nguyên liệu chứa ra dung dịch Để tăng tốc độ khuếch tán người ta phải khuấy nhẹ, xay nhỏ nguyên liệu hoặc sử dụng kỹ thuật “khuếch tán làm giàu” Bản chất: đây là phương pháp chiết liên tục, dịch chiết sau khi chiết được sử dụng làm dung môi mới lần lần chiết tiếp theo

 Ưu điểm của phương pháp:

- Tiết kiệm được lượng dung môi sử dụng

- Chiết kiệt được hoạt chất

- Khả năng chiết có hiệu quả cao hơn

- Thiết bị, dụng cụ đơn giản, dễ sử dụng

 Nhược điểm:

- Thời gian chiết dài

1.4.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

1.4.5.1 Dung môi chiết

Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng tách chiết không giống nhau [1], [9] Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt [1]

Độ phân cực của dung môi: Dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan những chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

Độ nhớt và sức căng bề mặt: Độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết

1.4.5.2 Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên [17] Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất [1] Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong các trường hợp sau:

- Đối với hợp chất kém bền nhiệt độ cao: Nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như vitamine, glycoside, alkaloid

- Đối với tạp: Khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy khi nhiệt độtăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

- Đối với dung môi dễ bay có nhiệt độ sôi thấp: Khi tăng nhiệt độ thì dung môi

dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

- Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: Khi nhiệt độ tăng,

độ tan của chúng lại giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựa chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết)

1.4.5.3 Thời gian chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp, nhựa, keo) [1] Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết phù hợp

PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là rong mơ S olygocystum (hình 2.1)

thu nhận tại vùng biển Ninh Thuận Rong sau khi thu nhận được rửa sạch bằng nước biển sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, ngâm để loại muối theo phương pháp của PGS TS Vũ Ngọc Bội và sấy khô bằng kỹ thuật sấy lạnh kết hợp với bức

xạ hồng ngoại ở nhiệt độ sấy 500C, tốc độ gió 2m/s trong thời gian khoảng 3,5 giờ đến độ ẩm <18% thì thu rong khô, nghiền nhỏ (hình 2.2) và đóng gói bằng bao bì

PE, bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân tích

2.2.1.1 Phương pháp định lượng alginate

+ Xác định tổng lượng alginate thô: Bằng phương pháp sấy khô và cân khối lượng sau sấy

+ Định lượng hàm lượng alginate: Hàm lượng alginate trong rong mơ được xác định theo phương pháp của Haug và cộng sự (1968) như sau:

Rong nâu được xử lý với dung dịch Na2CO3 3% trong 1 giờ ở nhiệt độ 70oC,

tỷ lệ rong khô/dung dịch Na2CO3 là 1/25 (w/v) Dịch chiết được lọc thô bằng túi vải

Hình 2 1.Sargassum oligocystum nghiền nhỏ Hình 2 2 Sargassum oligocystum

sau đó được ly tâm (10.000 vòng/phút trong 30 phút) và bã rong tiếp tục xử lý lần hai dưới điều kiện tương tự Nhập chung các dịch chiết và kết tủa acid alginic bằng dung dịch HCl 10% đến pH=1,8 Thu kết tủa acid alginic rồi tiếp tục trung hòa về pH=7-7,5 bằng dung dịch Na2CO310% có khuấy đảo Tiến hành thẩm tách 72 giờ bằng nước cất, cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không Sau đó, kết tủa alginate bằng EtOH 96% với thể tích gấp 4 lần thể tích dịch chiết Sau đó để kết tủa trong lạnh cho lắng kết tủa 4 giờ Sấy giấy lọc ở 70oC và để ở bình hút ẩm rồi cân đến khối lượng không đổi Lọc kết tủa bằng giấy lọc và rửa tủa Tiếp tục sấy chân không giấy lọc và kết tủa ở 50oC trong 2,5 giờ thu được alginate Hàm lượng alginate được xác định theo phương pháp cân khối lượng và được tính như sau:

Trong đó: A: khối lượng rong khô (g); B: khối lượng giấy lọc (g); C: khối lượng của giấy lọc và kết tủa alginate (g)

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

+ Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA): Được xác định theo phương pháp của

Prieto và cộng sự, (1999) [2]: lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước cất và thêm 3 ml dung dịch bao gồm: H2SO4 0,6M, sodium phosphate 28mM và ammonium molybdate 4mM Hỗn hợp được nâng nhiệt lên 950C, giữ ổn định trong thời gian 90 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 695nm với chất chuẩn là acid ascorbic

* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng

Sử dụng chất chuẩn là acid ascobic 0,1% (theo Prieto và cộng sự, 1999) [2] Hút lần lượt vào 13 ống nghiệm 0 (ống đối chứng), 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90, 100, 110, 120 microlit dịch acid ascobic 0,1% trong đó có ống đầu tiên là ống đối chứng, sau đó định mức cho đủ 1000 microlit thể tích bằng nước cất vào lần lượt các ống nghiệm trên, thêm 3 ml hỗn hợp dung dịch (A) gồm: H2SO4 0,6M, sodium phosphate 28 mM và amonium molybdate 4 mM Tiếp đó, giữ 90 phút ở

nhiệt độ 95oC và đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 695 nm Đường chuẩn phải có hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) lớn hơn hoặc bằng 0,99

Bảng 2 1 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng Hút vào

+ Hoạt tính khử Fe (RP): Được xác định theo Zhu và cộng sự, (2002) [3]: bổ

sung 0,5ml đệm phosphate pH 7,2 và 0,2 ml K3[Fe(CN)6] 1% vào 500µl dịch mẫu Giữ hỗn hợp 20 phút ở 500C Sau đó thêm vào 500µl CCl3COOH 10%, 300µl nước cất và 80µl FeCl3 0,1% Lắc đều và đo ở bước sóng 655 nm với chất chuẩn là FeSO4

* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính khử sắt

Sử dụng chất chuẩn là FeSO4 0,1% (theo Zhu và cộng sự, 2002) [3]

Hút lần lượt vào 13 ống nghiệm 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,

120 microlit dung dịch FeSO4 0,1% trong đó ống đầu tiên là ống đối chứng, thêm vào 0,5 mililit đệm phosphate pH 7,2 và 0,2 mililit K3[Fe(CN)6] 1% sau đó giữ ở

50oC trong vòng 20 phút Tiếp đó thêm vào 0,5 ml CCl3COOH 10%, thêm vào lần

lượt microlit nước cất và 80 microlit FeCl3 0,1% Lắc đều và đo ở bước sóng 655

K 3 [Fe(CN) 6 ] 1% (ml)

CCl 3 COOH 10% (ml)

Nước cất (µl) FeCl 3

2.2.1.3 Phương pháp định lượng một số thành phần khác

- Định lượng carbohydrate: Xác định hàm lượng carbohydratetheo AOAC

(1990)

- Định lượng hàm lượng Pb: Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 7602:2007 Thực phẩm [18]

- Xác định độ ẩm: Theo phương pháp AOAC (1932) [19]

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.2.1 Phương pháp tiếp cận các nội dung nghiên cứu:

Trên cơ sở tham khảo các đề tài nghiên cứu trước đây, em dự kiến cách tiếp

cận các nội dung nghiên cứu chiết rút alginate từ rong mơ Sargassum olygocystum

như hình 2.3

* Giải thích sơ đồ:

+ Rong mơ khô: Rong mơ tươi được thumẫu tại vùng biển Ninh Thuận Sau

khi thu mẫu, rong được rửa sạch bằng nước biển và vận chuyển về phòng thí

Rong mơ khô

Chiết Lọc Dịch chiết

Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình chiết alginate (nhiệt

độ, thời gian, pH và tỷ lệ DM/NL, sốlần chiết)

Xác định hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt

nghiệm của khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang để tiến hành nghiên cứu Tại phòng this nghiệm, rong tươi được ngâm loại muối, sau đó sấy khô bằng kỹ thuật sấy lạnh đến độ ẩm <18% Rong khô được nghiền nhỏ rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không và sử dụng làm nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu

+ Nghiền rong: Dùng máy nghiền để nghiền nhỏ để làm tăng diện tích tiếp

xúc giữa rong với dung môi, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất trong rong khuếch tán và hòa tan trong dung môi Rong sau khi được nghiền nhỏ được lấy mẫu để xác định độ ẩm

+ Chiết alginate: Hàm lượng alginate bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong

quá trình chiết như: nhiệt độ, thời gian, pH, tỷ lệ DM/NL và số lần chiết Do đó, tại công đoạn chiết này sẽ tiến hành bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên đến hàm lượng alginate thu được để tìm môi trường chiết thích hợp cho quá trình chiết alginate

+ Lọc: Dịch chiết được lọc qua giấy lọc để thu dịch alginate và loại bỏ những

tạp chất không tan như cặn và bã rong Dịch chiết thu được sẽ được sử dụng để thu nhận alginate và xác định hàm lượng alginate, hoạt tính chống oxy hóa

2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết rút alginate

*Xác định nồng độ HCl xử lý rong

33%

Xác định hàm lượng, hoạt tính alginate

Dịch chiết Lọc

Giải thích: Cân chính xác cho vào 3 bình tam giác (250 ml) mỗi bình 5g

Ngâm HCl với nồng độ khác nhau (31, 32, 33%) Sau 24 giờ, xả dung dịch HCl vào bồn chứa Chiết bã rong đã xử lý bằng Na2CO3 ở cùng nồng độ, nhiệt độ và thời gian chiết 6 giờ Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 1, lọc lấy dịch Dịch chiết sử dụng làm dung môi chiết lần 2 tương tự như lần 1 (khuếch tán) Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 2, lọc lấy dịch đem xác định hàm lượng và hoạt tính sinh học của

Chọn nhiệt độ chiết chiết thích hợp

Hình 2 5 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định nhiệt độ chiết

Giải thích: Cân chính xác cho vào 5 bình tam giác (250 ml) mỗi bình 5g

Chiết bằng Na2CO3 ở cùng nồng độ Nhiệt độ chiết khác nhau: 60, 65, 70, 75,

80oCvà thời gian chiết 6 giờ Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 1, lọc lấy dịch Dịch chiết sử dụng làm dung môi chiết lần 2 tương tự như lần 1 (khuếch tán) Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 2, lọc lấy dịch đem xác định hàm lượng và hoạt tính sinh học của alginate Chọn nhiệt độ chiết alginate thích hợp

* Xác định thời gian chiết

Rong mơ khô, nghiền nhỏ

210

phút

240 phút

Chiết

Lọc

Dịch chiết

Xác định hàm lượng, hoạt tính alginate

Chọn nhiệt độ chiết thích hợp

270 phút

300 phút

330 phút

360 phút

Hình 2 6 Sơ đồ bố trí thí nghiêm xác định thời gian chiết

Giải thích: Cân chính xác cho vào 6 bình tam giác (250 ml) mỗi bình 5g

Chiết bằng dung môi Na2CO3 ở cùng môi trường pH và nhiệt độ, thời gian chiết khác nhau: 210, 240, 270, 300, 330, 360 phút Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 1, lọc lấy dịch Dịch chiết sử dụng làm dung môi chiết lần 2 tương tự như lần 1(khuếch tán) Sau khi kết thúc quá trình chiết lần 2, lọc lấy dịch đem xác định hàm lượng và hoạt tính sinh học của alginate Chọn thời gian chiết alginate thích hợp

* Xác định pH môi trường chiết

Rong mơ khô, nghiền nhỏ

Chiết

Lọc

Dịch chiết

Xác định hàm lượng , hoạt tính alginate