Bước đầu thử nghiệm sản xuất fructooligosaccharides (fos) bởi chế phẩm pectinex ultra spl

ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) BỞI CHẾ PHẨM PECTINEX ULTRA SP-L CBHD: TS. HUỲNH NGỌC OANH SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN MSSV: 60601418 BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. HCM, tháng 01 năm 2011 ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến: Tiến Sĩ Huỳnh Ngọc Oanh – Bộ môn công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, hướng tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cán bộ phòng thí nghiệm 108, 117, 102 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài. iii TÓM TẮT Fructooligosaccharides (FOS) từ sucrose, chất ngọt thay thế mới với đặc tính năng lượng thấp, an toàn cho người bệnh tiểu đường, an toàn cho hệ tiêu hóa. Pectinex Ultra SP-L là chế phẩm enzyme có hoạt tính fructosyltransferase, xúc tác phản ứng tạo ra các fructooligosaccharide mạch ngắn. Chế phẩm enzyme được cố định trên gel alginate. Điều kiện tối ưu cho quá trình cố định được xác định là nồng độ alginate 3.5%, CaCl 2 5%, hiệu suất cố định enzyme đạt 57.79%. Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm CCD xác định được điều kiện tối ưu sản xuất FOS bằng enzyme cố định là nhiệt độ 55 o C, pH bằng 5.6, nồng độ sucrose ban đầu 58.76% (w/v), tốc độ lắc 159 rpm. Hỗn hợp sản phẩm bao gồm: sucrose (95mg/ml), glucose (218mg/ml), FOS (279.96mg/ml). ABTRACTS Fructooligosaccharides (FOS) from sucrose, new alternative sweeteners wih functional properties such as low calories, no cariogenicity, safety for diabetics. Pectinex Ultra SPL is commercial enzyme with fructosyltransferase activity, is able to catalyze the production of short chain fructooligosaccharide. It was immobilized by alginate gel entrapment. The optimum of immobilization is 3.5% alginate, 5% CaCl 2 , protein- enzyme immobilized yield 57.79%. Using Respones Surface Methodology with CCD predits the best tranfructosylating condition to produce FOS by immobilized enzyme: Temperature = 55 o C, pH = 5.6, initial sucrose concentrations = 58.76% (w/v), shaking speed at 159 rpm. A typical solution product consists of a mixture of sucrose (95mg/ml), glucose (218mg/ml), FOS (279.96mg/ml). iv MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu 1 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về FOS 3 2.1.1. Khái niệm FOS 3 2.1.2. Nguồn gốc FOS – Cấu tạo 4 2.1.3. Tính chất của FOS 5 2.1.4. Ảnh hưởng của FOS với sức khỏe con người 6 2.1.5 Tính an toàn, ứng dụng và tình hình sản xuất FOS trên thế giới 11 2.1.6. Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam 16 2.1.7. Một số nghiên cứu sản xuất FOS trên thế giới 17 2.2. Tổng quan về enzyme fructosyltransferase 21 2.2.1. Khái niệm chung về enzyme 21 2.2.2. Enyme fructosyltransferase 21 2.3. Enzyme cố định 23 2.3.1. Sơ lược về enzyme cố định 23 2.3.2. Phương pháp cố định enzyme 24 2.4. Vật liệu cố định enzyme 25 2.4.1. Phân loại chất mang 26 2.4.2. Khái quát về alginate. 26 2.4.3. Một số nghiên cứu sử dụng alginate làm chất mang cố định 31 CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1. Vật liệu và thiết bị 35 3.1.1. Vật liệu 35 3.1.2. Thiết bị 35 3.2. Phương pháp 35 3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 35 3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzymefructosyltranferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L bằng phương pháp DNS 37 3.2.3. Phương pháp tính toán. 38 3.3. Phương pháp phân tích phương sai, hồi qui 39 3.3.1. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 39 3.3.2. Phương pháp tính toán hồi quy và kiểm định ANOVA 42 3.3.3. Phân tích hồi quy đa tham số 44 3.4. Phương pháp tiến hành nghiên cứu 45 3.4.1. Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L tự do 45 3.4.2. Quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP-L 47 v 3.4.3. Phương pháp tối ưu bằng phương pháp đáp ưng bề mặt trên chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định 49 3.4.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase tự do của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL tự do. 50 3.4.5. Tối ưu hóa ảnh hưởng của 4 yếu tố: pH, nhiệt độ, nồng độ sucrose ban đầu, tốc độ lắc đến quá trình tổng hợp FOS bằng chế phẩm Pectinex Ultra SPL cố định. 51 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 4.1. Đường chuẩn 52 4.1.1. Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose 52 4.1.2. Đường chuẩn xác hàm lượng protein 53 4.2. Hoạt tính fructosyltransferase và hàm lượng protein trong chế phẩm Pectinex Ultra SPL tự do 53 4.2.1. Hàm lượng protein của chế phẩm Pectinex Ultra SPL 53 4.2.2. Hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SPL tự do 54 4.3. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L tự do 54 4.3.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính fructosyltransferase 54 4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase 56 4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất và thời gian phản ứng lên quá trình tổng hợp FOS 57 4.4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất 57 4.4.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo FOS của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng tự do 58 4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme: alginate và nồng độ CaCl 2 lên hoạt tính của enzyme sau quá trình cố định 59 4.5.1. Hiệu suất cố định protein bởi alginate 59 4.5.2. Hiệu suất cố định enzyme bởi alginate 60 4.5.3. Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định 64 4.6. Kết quả tối ưu ảnh hưởng của 4 yếu tố: pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất sucrose, và tốc độ lắc ảnh hưởng đến lượng glucose tổng hợp của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định 65 4.7. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo FOS của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng cố định 72 4.8. Kết quả phân tích HPLC mẫu FOS sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định 72 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 5.1 Kết luận 74 5.2 Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 81 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT FOS: Fructooligosaccharides GF : Sucrose GF 2 : 1-kestose GF 3 : nytose GF 4 :1F-fructofuranosylnytose RSM : Response Surface Mothodology – Phương pháp đáp ứng bề mặt CCD : Central Composite Design – Thiết kế đáp ứng tâm ANOVA: Analysis of Variance – Giải tích phương sai vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Công thức cấu tạo của FOS 4 Hình 2.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu 7 Hình 2.3: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu 7 Hình 2.4: Sự thay đổi nồng độ fructose trong máu 7 Hình 2.6: Sơ đồ quy trình sản xuất FOS liên tục và không liên tục 15 Hình 2.7: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng tự do 18 Hình 2.8: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng cố định trên chất mang Sepadbeads EC-EP5. 18 Hình 2.9: Cơ chế hoạt động của enzyme 21 Hình 2.10: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của fructosyltransferase 23 Hình 2.11: Enzyme trong hệ gel 24 Hình 2.12: Enzyme trong hệ sợi 25 Hình 2.13: Cấu tạo hóa học của alginate. 27 Hình 2.14: Cấu trúc phân tử của alginate 27 Hình 2.15: Đồ thị quan hệ giữa độ nhớt và nhiệt độ 28 Hình 2.16: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca2+. 30 Hình 2.17: Cấu trúc không gian mạng lưới gel alginate 30 Hình 2.18: Hạt giống nhân tạo cây địa lan 32 Hình 2.19: Đồ thị sự thay đổi hoạt tính enzyme cố định theo số lần tái sử dụng 33 Hình 2.20: Mối quan hệ giữa lượng đường khử và số lần sử dụng 34 Hình 3.1: Phản ứng của protein và Thuốc thử Bradford 36 Hình 3.2: Phương pháp xác định hoạt tính enzyme fructosyltransferase theo phương pháp định lượng đường khử DNS 46 viii Hình 3.3: Phương pháp cố định enzyme fructosyltransferase trên chất mang Alginate. 48 Hình 3.4: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 49 Hình 4.1: Đường chuẩn xác định hàm lượng glucose 52 Hình 4.2: Đường chuẩn xác định hàm lượng protein 53 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L tự do. 55 Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L tự do. 56 Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ Enzyme/Cơ chất đến khả năng tạo glucose do hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL tự do. 57 Hình 4.6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp FOS của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL tự do. 58 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong quá trình cố định protein lên chất mang ở nồng độ alginate 2.5% (trái) và alginate 3.0% (phải). 59 Hình 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ alginate trong quá trình cố định protein lên chất mang ở nồng độ alginate 3.5% (trái) và alginate 4.0% (phải). 60 Hình 4.9: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 2.5%(w/w). 61 Hình 4.10: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 3.0 %(w/w). 61 Hình 4.11: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 3.5%(w/w). 62 Hình 4.12: Hiệu suất cố định enzyme ở nồng độ alginate 4.0%(w/w). 62 Hình 4.13: Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định mang hoạt tính fructosyltransferase. 64 Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các bốn nhân tố pH, nhiệt độ, nồng độ cơ chất sucrose, và tốc độ lắc đến hàm lượng glucose tạo thành của chế phẩm enzyme cố định. 66 Hình 4.15: Bề mặt đáp ứng của hàm lượng glucose đối với bốn yếu tố: nồng độ sucrose ban đầu, pH, nhiệt độ và tốc độ lắc. (Nồng độ các yếu tố không có thể hiện trên đồ thị được giữ ở mức tâm) 71 Hình 4.16: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp FOS của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL cố định bởi alginate. 72 Hình 4.17: Sắc ký đồ của FOS và các đường thành phần khác trong sản phẩm thu nhận sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định 73 ix DANH MỤC BẢNG Hình 2.1 : Công thức cấu tạo của FOS 4 Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả 5 Bảng 2.2: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác 6 Bảng 2.3: Diễn biến tăng trưởng của ngành công nghiệp mía đường trên toàn quốc. 16 Bảng 2.4: Tỷ lệ chất mang và enzyme ảnh hưởng lên hoạt tính 20 Bảng 2.5: Lượng FOS hình thành theo thời gian phản ứng 20 Bảng 2.6: Một số ứng dụng của alginate 31 Bảng 2.7: Ảnh hưởng nồng độ alginate lên hiệu suất cố định. 33 Bảng 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên hiệu suất cố định. 33 Bảng 3.1 : Tỷ lệ pha loãng mẫu protein ban đầu. 36 Bảng 3.2 : Mẫu điều tra k mức 2 yếu tố không lặp 43 Bảng 3.3. Bảng phân tích ANOVA hai yếu tố không lặp 43 Bảng 3.4 : ANOVA phân tích hồi qui đa tham số. 44 Bảng 3.5: Bảng ANOVA kiểm định tương thích thực nghiệm của phương trình hồi quy 45 Bảng 4.1 : Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu glucose chuẩn. 52 Bảng 4.2 : Độ biến thiên mật độ quang theo mẫu protein chuẩn. 53 Bảng 4.3: Xác định hàm lượng protein trong mẫu chế phẩm Pectinex Ultra Sp-L tự do. 54 Bảng 4.4: Xác định hoạt tính fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L tự do. 54 Bảng 4.5 : Xác định hoạt tính fructosyltransferase theo ảnh hưởng của pH. 55 Bảng 4.6 : Xác định hoạt tính frucotsyltransferase theo ảnh hưởng của nhiệt độ 56 Bảng 4.7 : Hàm lượng glucose theo tỷ lệ enzyme/cơ chất. 57 x Bảng 4.8: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo FOS ở chế phẩm Pectinex Ultra SP- L dạng tự do. 58 Bảng 4.9: Phân tích ANOVA đối với 2 nhân tố : tỷ lệ enzyme: alginate và nồng độ CaCl 2 ảnh hưởng lên hiệu suất cố định enzyme. 63 Bảng 4.10 : Tương quan giữa giá trị dạng mã hóa và dạng tự nhiên của các yếu tố trong mô hình CCD khảo sát quá trình sản xuất FOS. 67 Bảng 4.12: Các điểm tối ưu trong mô hình CCD. 70 Bảng 4.13 Phương trình hồi quy của mục tiêu cần tối ưu. 70 Bảng 4.14 : Thành phần sản phẩm FOS và các đường thành phần sau khi phân tích HPLC. 73 [...]... đích xác định điều kiện tối ưu khi sản xuất FOS bằng chế phẩn Pectinex Ultra SPL cố định trên gel alginate bước đầu định hướng các nghiên cứu về sản xuất FOS bằng enzyme cố định sau này Hướng nghiên cứu tập trung vào hai mục tiêu chính: 1 Chương 1: Mở đầu + Xác định điều kiện cố định tối ưu của chế phẩm Pectinex Ultra SPL trên gel alginate + Xác định điều kiện tối ưu sản xuất FOS bằng enzyme cố định 1.3... trường hợp FOS sản xuất từ syrup đường lượng FOS 440mg/ml so với 385 và 215 mg/ml trên sucrose tinh khiết và mật rỉ đường Hình 2.7: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng tự do [17] Hình 2.8: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng cố định trên chất mang Sepadbeads EC-EP5 [17] 18 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1.7.2 Cố định Pectinex Ultra SP-L... fructosyltransferase của chế phẩm Pectinex Ultra SPL Tìm khoảng biến thiên cho mô hình quy hoạch thực nghiệm CCD + Nghiên cứu sự phụ thuộc quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SPL trên gel alginate bởi các yếu tố: nồng độ alginate sử dụng, tỷ lệ enzyme/alginate, nồng độ CaCl2 Tìm ra điều kiện cố định tối ưu + Nghiên cứu ảnh hưởng của bốn yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ sucrose ban đầu, tốc độ lắc đến... học để làm chủ công nghệ sinh học nói chung và chế biến thực phẩm nói riêng Vì vậy việc mở ra một ngành sản xuất mới sử dụng công nghệ hiện đại để tạo nên sản phẩm FOS với nhiều đặc tính ưu việt, có giá trị cao hơn đường kính về đặc tính chức năng, cung cấp cho thị trường trong nước và xuất khẩu, làm nguyên liệu cho các sản phẩm chức năng như bánh kẹo, thực phẩm cho người mắc bệnh tiểu đường, sữa và bột... thi 16 Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1.7 Một số nghiên cứu sản xuất FOS trên thế giới 2.1.7.1 Tổng hợp FOS từ nguồn nguyên liệu syrup đường và mật rỉ đường sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L [17] Phương pháp thực hiện: Quá trình cố định: Pectinex Ultra SPL (20ml) và Sepadbead EC-EP5 (8g) được trộn và ủ trong 24h tại nhiệt độ phòng với chế độ lắc đảo tròn Tỷ lệ protein/chất mang là khoảng 45mg protein... Tinh sạch Cô đặc Thanh trùng Sản phẩm Hình 2.6: Sơ đồ quy trình sản xuất FOS liên tục và không liên tục [35] Sử dụng enzyme GOD: Bằng cách này enzyme GOD có nhiệm vụ phân giải glucose thành acid gluconic Đây là loại enzyme được coi là có hiệu quả nhất trong việc chuyển hoá glucose trong sản xuất FOS cao độ (có thể đến 98%) Cũng như trong sản xuất FOS phổ thông, công nghệ sản xuất FOS tinh khiết có thể... sucrose từ 500-850g/l [35] Một số chất ức chế và xúc tác hoạt động chuyển hóa của fructosyltransferase cũng được nghiên cứu Ở loài cây Agave americana, fructosyltransferase được xúc tác bởi các ion Ca2+, Mg2+, Co và Li+ và bị ức chế bởi Ag+, Pb, Hg, Al3+ và Sn 22 Chương 2: Tổng quan tài liệu Trong khi đó, enzyme sản xuất bởi loài nấm sợi Aureobasidium sp bị ức chế bởi Hg, Cu và Pb [35] Fructosyltransferase... được sản xuất theo phương thức liên tục và không liên tục Trong phương thức sản xuất liên tục công nghệ cố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuất không liên tục thì sử dụng enzyme đã chiết tách Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất được liên tục, tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ… Nhưng tính ổn định... thế cho các chất ngọt truyền thống là một yêu cầu cấp thiết Bên cạnh đó công nghiệp thực phẩm chức năng đang ngày càng phát triển mạnh và mang lại giá trị kinh tế cao Việt Nam có nhiều tiềm năng phát triển công nghiệp sản xuất FOS với nguồn mía đường cung cấp nguyên liệu đầu vào cho sản xuất Từ thực trạng trên, sản xuất FOS công nghiệp là vấn đề hết sức cần thiết hiện nay, mang lại lợi ích về sức khỏe... cho thấy 530C và 5.6 là nhiệt độ, pH tối ưu nhất Giá trị pH gần với giá trị hoạt động của enzyme hòa tan, trong khi đó nhiệt độ thì cao hơn Sản xuất FOS: Thí nghiệm có lắc với enzyme cố định được thí nghiệm để sản xuất FOS theo mô hình lab-scale Lượng Pectinex ultra SP-L sử dụng 0.5g, thể tích cơ chất là 50 cm3 Điều kiện hoạt động là pH 5.6 và 530C Thời gian phản ứng là yếu tố được khảo sát Bảng 2.5: . THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT FRUCTOOLIGOSACCHARIDES (FOS) BỞI CHẾ PHẨM PECTINEX ULTRA SP-L CBHD: TS. HUỲNH. Nam có nhiều tiềm năng phát triển công nghiệp sản xuất FOS với nguồn mía đường cung cấp nguyên liệu đầu vào cho sản xuất. Từ thực trạng trên, sản xuất FOS công nghiệp là vấn đề hết sức cần thiết. 2.1.5 Tính an toàn, ứng dụng và tình hình sản xuất FOS trên thế giới 11 2.1.6. Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam 16 2.1.7. Một số nghiên cứu sản xuất FOS trên thế giới 17 2.2. Tổng quan