- Điều kiện cố định tối ưu cho quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SPL bởi chất mang alginate được bố trí theo thí nghiệm sau:
- Thực hiện quá trình cố định ở nồng độ alginate 3.0, 3.5 và 4.0 % (w/v), ở nồng độ CaCl2 3%, 4%, và 5 % (w/w) ở các tỷ lệ enzyme: alginate = 1: 1, 1: 2, 1: 3, và 2: 3.
- Sau quá trình cố định xác định hiệu suất cố định protein, hiệu suất cố định enzyme và khả năng ổn định của enzyme cố định qua quá trình tái sử dụng từ đĩ lựa chọn điều kiện thích hợp nhất cho quá trình cố định chế phẩm Pectinex Ultra SP-L bởi alginate từ đĩ ứng dụng vào điều kiện tổng hợp FOS.
48
Hình 3.3: Phương pháp cố định enzyme fructosyltransferase trên chất mang alginate.
Alginate
Dung dịch alginate
Enzyme : alginate
Tạo hạt trong CaCl2 H2O Tỷ lệ 1:1 ,1:2, 2:3 ,và 1: 3 Enzyme cố định Ủ hỗn hợp 1h Nồng độ 3%, 4%, và 5%
49
3.4.3. Phương pháp tối ưu bằng phương pháp đáp ưng bề mặt trên chế phẩm Pectinex Ultra SP-L cố định
Hình 3.4: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm.
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất
Tiến hành thí nghiệm trên cơ chất
sucrose: Xác định các điều kiện cĩ hoạt tính fructosyl
cao nhất Chọn tâm và khoảng biến thiên cho mơ hình
quy hoạch thực nghiệm( RSM)
Thực hiện tối ưu trên mơ hình cấu trúc tâm CCD
Xác định vùng tối ưu, các nhân tố ảnh hưởng đến vùng tối ưu, tính tốn hồi quy
Tối ưu hĩa các điều kiện theo mơ hình cấu trúc tâm CCD
Thí nghiệm, kiểm tra lại điều kiện tối ưu
Lựa chọn điều kiện tối ưu phù hợp nhất với thực nghiệm
Xác định điều kiện sản xuất FOS
phù hợp Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình cố định
chế phẩm Pectinex Ultra SP-L Tiến hành
50
Tồn bộ quá trình thí nghiệm nhằm hai mục tiêu chính: chọn lựa điều kiện cố định enzyme fructosyltransferase trên alginate để cĩ được hoạt tính ổn định và điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp đường FOS bằng enzyme fructosyltransferase cố định trong các điều kiện phản ứng chịu tác động của nhiệt độ, pH, nồng độ sucrose ban đầu và điều kiện lắc đảo.
3.4.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme/cơ chất ảnh hưởng đến hoạt tính fructosyltransferase tự do của chế phẩm Pectinex Ultra S-PL tự do.
Khi xác định điều kiện tối thích của một yếu tố cần giữ cố định các yếu tố khác và chỉ thay đổi các giá trị của yếu tố cần xác định trong khoảng giá trị đĩ xác định.
Thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu được tiến hành ở các điều kiện như sau: điều kiện nồng độ cơ chế sucrose: 60%(w/v) (V= 10ml). Các mẫu được ủ trong bể ủ nhiệt cĩ nhiệt độ thay đổi từ 35 – 65o
C với khoảng biến thiên nhiệt độ 5oC. pH được hiệu chỉnh bởi dung dịch đệm pH 5.5 (V= 1ml) để hiệu chỉnh và ổn định pH trong quá trình phản ứng. Tỷ lệ enzyme/cơ chất (v/v) bằng 0.02 (Venzyme = 0.2ml). Thời gian phản ứng 60 phút. Sau thời gian phan ứng đun sơi mẫu để bất hoạt enzyme trong 5 phút. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tự do của enzyme.
Thí nghiệm xác định pH tối ưu được tiến hành ở các điều kiện như trên nhưng giữ cố định nhiệt độ ở 55o
C pH của dung dịch đêm acetate được hiểu chỉnh thay đổi từ pH = 4 – 7 với bước nhảy là 0.5.
Thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/cơ chất tối thích được tiến hành theo các thí nghiệm như trên, nhưng cố định pH 5.5. Tỷ lệ enzyme thay đổi từ 0.0025, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 (V eznyme = 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ml). Và được tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện nồng độ cơ chế sucrose : 60%(w/v) (V= 10ml). Các mẫu được ủ trong bể ủ nhiệt cĩ nhiệt độ thay đổi từ 55o
C với khoảng biến thiên ( bước nhảy) nhiệt độ 5oC. pH được hiệu chỉnh bởi dung dịch đệm pH 5.5 (V= 1ml) để hiệu chỉnh và ổn định pH trong quá trình phản ứng. Tỷ lệ enzyme/cơ chất (v/v) = 0.02 (Venzyme = 0.2ml). Thời gian phản ứng 60 phút. Sau thời gian phan ứng đun sơi mẫu để bất hoạt enzyme trong 5 phút.
51