a. Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau cĩ hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trong dd acid, dạng proton hĩa của thuốc nhuộm Coomassie Blue cĩ màu da cam đỏ.Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhĩm kị nước và các nhĩm mang điện tích dương trên phân tử protein.Trong mơi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hĩa khơng xảy ra và cĩ màu xanh xuất hiện.
36
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu cĩ khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sĩng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp cĩ độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hình 3.1: Phản ứng của protein và Thuốc thử Bradford [24].
b. Tiến hành
Dựng đường chuẩn:
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết cĩ sẵn, thường là albumin của bị đã đơng khơ theo bảng 3.1 để cĩ được các dung dịch albumin chuẩn cĩ nồng độ protein từ 0 đến 1000 µg/ml.
Lấy 1,8 ml dung dịch protein cĩ nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác (gồm hai ống thử khơng và năm ống từ 1 đến 5). Thêm vào đĩ 0,6 ml dung dịch thuốc thử Bradford . Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Đem đo mật độ quang ở bước sĩng 595nm.
Bảng 3.1: Tỷ lệ pha lỗng mẫu protein ban đầu.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein (µg/ml) 0 200 400 600 800 1000
Dung dịch albumin 1mg/ml 0 2 4 6 8 10
37
Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml).
Xác định hàm lượng protein trong mẫu:
Lấy 1,8ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và khơ. Thêm vào đĩ 0,6 ml dung dịch thuốc thử Bradford. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Đem đo mật độ quang ở bước sĩng 595nm (lấy 3 ống nghiệm để lấy giá trị trung bình)
c. Tính tốn
Từ đường chuẩn xác định mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đĩ suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a (µg/ml).
Lượng protein (M) cĩ trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu được tính theo cơng thức: M = m n x 10 x a -3 mg protein/1(g hoặc ml) (1) với a: hàm lượng protein (mg/ml)
n: hệ số pha lỗng
m: khối lượng hoặc thể tích nguyên liệu lấy phân tích (g hoặc ml)