2.1.7.1.Tổng hợp FOS từ nguồn nguyên liệu syrup đường và mật rỉ đường sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L [17]
Phương pháp thực hiện:
Quá trình cố định: Pectinex Ultra SPL (20ml) và Sepadbead EC-EP5 (8g) được trộn và ủ trong 24h tại nhiệt độ phịng với chế độ lắc đảo trịn. Tỷ lệ protein/chất mang là khoảng 45mg protein trên 1g chất mang. Sau quá trình cố định rửa bằng dung dịch đệm natri acetate 50mM (pH = 5.6), bảo quản ở 4o
C. Hoạt tính: Hoạt tính được xác định bởi hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình phản ứng bằng phương pháp DNS.
Phản ứng tạo FOS: Chế phẩm Pectinex Ultra SPL tự do hoặc cố định thêm vào dung dịch đường syrup hoặc mật rỉ đường. Hỗn hợp phản ứng trong tủ ủ nhiệt ở 60oC lắc ở 200rpm.Tại các thời điểm khác nhau lấy 40µl được lấy ra từ hỗn hợp phản ứng, pha lỗng với 160µl nước cất, ủ trong 10 phút ở 90oC để bất hoạt enzyme. Sau đĩ mẫu ly tâm ở 6000rpm trong 5 phút sau đĩ phân tích HPLC.
Kết quả:
Tác động của pH và nhiệt độ: pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất FOS từ sucrose sử dụng FOS được xác định là 5.5 và 60o
C. Phản ứng được thực hiện trong 24h sau đĩ phân tích lượng FOS tạo thành bằng HPLC.
Phản ứng sản xuất FOS: Trong trường hợp syrup, hàm lượng FOS đạt đến 388mg/ml sau 30h (228mg/ml 1-kestose, 149 mg/ml nytose và 9 mg/ml 1F- fructofuranosylnytose). Tại thời điểm phản ứng FOS chiếm 56% dựa trên tổng carbonhydrate trong hỗn hợp. Đối với mật rỉ đường hàm lượng FOS tối đa là 235mg/ml (49.2% FOS) sau 65h (62mg/ml 1-kestose, 143 mg/ml nytose và 30 mg/ml 1F-fructofuranosylnytose). Sau 140h phản ứng tiến dần tới cân bằng với hàm lượng FOS dao động từ 49% và 42% ở syrup đường và mật rỉ đường.
Cố định fructosyltransferase trên Sepabeads EC-EP5: hoạt tính fructosyltransferase trong chế phẩm Pectinex Ultra SPL được cố định trên sepabeads EC-EP5, hàm lượng protein trong chế phẩm là 17.8mg/ml. Hoạt tính chuyển hĩa sucrose là 321U/ml hàm lượng protein cố định trên chất mang là
18
36mg/g và hoạt tính là 21U/g. Hình 2.7 và 2.8 thể hiện hàm lượng FOS so với tổng hàm lượng carbonhydrate trong mẫu. Phần trăm FOS cao nhất được xác định là 61% . Phần trăm FOS xác định trên mẫu syrup đường và mật rỉ đường là 53 và 37.5%. Điều này chỉ ra rằng trong trường hợp FOS sản xuất từ syrup đường lượng FOS 440mg/ml so với 385 và 215 mg/ml trên sucrose tinh khiết và mật rỉ đường.
Hình 2.7: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng tự do [17].
Hình 2.8: Thời gian phản ứng tạo sản phẩm của chế phẩm Pectinex Ultra SP-L dạng cố định trên chất mang Sepadbeads EC-EP5 [17].
19
2.1.7.2. Cố định Pectinex Ultra SP-L và ứng dụng trong sản xuất fructoligosaccharides [36]
Pectinex Ultra SP-L thương mại với hoạt tính chuyển đổi gốc fructosyl, là chất xúc tác trong phản ứng hình thành fructooligosaccharide mạch ngắn (FOS). Chế phẩm được cố định trên nhựa trao đổi ion bằng phương pháp liên kết. Tỷ lệ enzyme và cơ chất (16.7g dung dịch enzyme/g chất mang khơ) cũng như điều kiện cố định tốt nhất: nồng độ chất mang (0.125%) và thời gian cho sự kết dính liên kết là 15 phút. Yếu tố nhiệt độ và pH tối ưu của chất xúc tác pha rắn là 530
C và 5,6. Hoạt tính của enzyme cố định khơng giảm trong suốt 12 lần tái sử dụng.
Vật liệu:
Pectinex Ultra SP-L, sucrose, glucose và một số hĩa chất tái sử dụng. FOS mạch ngắn như 1-kestose và nystose. Chất cố định là chất trao đổi anion được hình thành từ polymer styrene-divinylbenzene với đường kính hạt 650-820 µm.
Phương pháp:
Hoạt tính của Pectinex Ultra SP-L được xác định theo phương pháp Hang and Woodams (1996). Điều kiện phản ứng là nồng độ ban đầu sucrose 2M, nhiệt độ 550
C, pH 5.6 và 2h ủ. Và Pectinex ultra SP-L cĩ hoạt tính fructosyl- transferase là 5.6 U cm-3. FOS được phân tích theo phương pháp HPLC. Phương pháp cố định: Chất trao đổi ion được thêm vào với 1 lượng enzyme và ủ ở nhiệt độ phịng trong vịng 24h. Tỷ lệ của dung dịch enzyme và cơ chất cố định sẽ được xác định sao cho hoạt tính cao nhất.
Kết quả:
Tỷ lệ enzyme và chất mang:
Sau khi hấp thụ enzyme lên trên các hạt, chúng được rửa với dung dịch đệm natri acetate pH 5.6, sau đĩ lọc và để khơ trong khơng khí. Để hình thành liên kết giữa chất mang và enzyme, mẫu khơ được xử lý bằng glutaraldehyde. Mẫu sẽ được ngâm trong dung dịch đệm natri acetate chứa glutaraldehyde. Thời gian xử lý (15-60 phút) và nồng độ áp dụng (0.062-0.50% (v/v)) được xác định để đạt được hoạt tính cao nhất. Thời gian và nồng độ tối ưu là 15 phút và 0.125% .Số lần tái sử dụng của enzyme cố định khoảng 12 lần.
20
Bảng 2.4: Tỷ lệ chất mang và enzyme ảnh hưởng lên hoạt tính [36].
Lượng enzyme (g)
Lượng chất
mang (g) Tỷ lệ(g/g) Hoạt tính (U/g chất khơ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8,0 0,3 26,7 12,8
7,5 0,3 25,0 11,8
5,0 0,3 16,7 14,8
4,0 0,3 13,3 11,5
3,8 0,3 12,5 8,5
Điều kiện hoạt động của FTF cố định:
Trước khi áp dụng enzyme cố định trong chuyển đổi sinh học, xác định hoạt tính cao nhất trên thơng số chuẩn, nhiệt độ và pH được khảo sát. Kết quả cho thấy 530
C và 5.6 là nhiệt độ, pH tối ưu nhất. Giá trị pH gần với giá trị hoạt động của enzyme hịa tan, trong khi đĩ nhiệt độ thì cao hơn.
Sản xuất FOS:
Thí nghiệm cĩ lắc với enzyme cố định được thí nghiệm để sản xuất FOS theo mơ hình lab-scale. Lượng Pectinex ultra SP-L sử dụng 0.5g, thể tích cơ chất là 50 cm3. Điều kiện hoạt động là pH 5.6 và 530C. Thời gian phản ứng là yếu tố được khảo sát.
Bảng 2.5: Lượng FOS hình thành theo thời gian phản ứng [36].
Thời gian phản ứng Hàm lượng FOS (g/l)
1 18,0 2 39,6 3 37,3 4 57,7 5 71,4 6 79,6 8 78,0
21