2.3.2.1. Phương pháp nhốt enzyme
Cĩ hai phương pháp nhốt enzyme:
Nhốt enzyme trong gel.
Nhốt enzyme trong hệ sợi.
Phương pháp nhốt enzyme trong gel
Phương pháp này dựa trên cơ sở tạo ra một màng bọc hay một polymer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của cả phản ứng cĩ thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngồi thơng qua màng bọc này và enzyme sẽ được giữ nguyên trong gel đĩ.
Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzyme đã được nghiên cứu kỹ và đã được áp dụng thành cơng ở nhiều nước như polyacrylamide, alginate, carrageeman, gelatin…
25
Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi.
Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi cĩ khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường là những sợi nhân tạo, cĩ độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các dung mơi hữu cơ hịa tan.
Nguyên liệu chủ yếu được sử dụng như là cellulose, cellulose acetate, polyvinyl alcohol and cellulose… trong đĩ cellulose acetate được sử dụng nhiều hơn cả.
Hình 2.12: Enzyme trong hệ sợi[1].
2.3.2.2. Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang
Tùy theo tính chất của chất mang, người ta thực hiện gắn enzyme vào chất mang theo những cơ chế sau:
Phương pháp hấp phụ
Phương pháp tạo liên kết ion
Phương pháp liên kết với kim loại
Phương pháp tạo liên kết đồng hĩa trị.
2.4. Vật liệu cố định enzyme
Những yêu cầu của một chất mang lý tưởng:
Đầu tiên là cần phải rẻ. Điều này cĩ liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình cơng nghệ.
Chất mang phải cĩ tính chất cơ lý bền vững, ổn định. Nhờ đĩ mà chất mang mới chịu được các điều kiện của mơi trường.
Về mặt hĩa học, chất mang phải bền vững, khơng tan trong mơi trường phải ứng. Chất mang khơng được làm mất hoạt tính enzyme. Chất mang khơng gây ra những phản ứng hấp phụ khơng đặc hiệu.
26
Chất mang phải cĩ tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn cơng của vi sinh vật.
Chất mang phải cĩ độ trương tốt, cĩ diện tích bề mặt tiếp xúc lớn.
Chất mang cĩ thể cĩ cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, cĩ thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng.
2.4.1. Phân loại chất mang
Tất cả các chất mang dùng trong cố định enzyme được chia làm hai nhĩm: chất mang polymer hữu cơ; chất mang vơ cơ.
Vật liệu vơ cơ
Đặc điểm: chất mang vơ cơ bền với các tác động bên ngồi, khơng bị vi sinh vật ăn mịn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khĩ khăn hơn.
Một số chất mang vơ cơ thơng dụng như: thủy tinh xốp, các oxit kim loại như oxid nhơm, oxit magie, silicagel…
Vật liệu hữu cơ
Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường cĩ các nhĩm hoạt động hĩa học như: – NH2, –COOH, –OH, –SH,… nên dễ kết gắn với enzyme nhưng độ bền với các tác động của mơi trường khơng cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn cơng.
Một số chất mang hữu cơ thơng dụng như: polypeptide, dẫn xuất của stirol, nilon, các dẫn xuất của cellulose, dextran, tinh bột, alginate, chitosan, agarose…
2.4.2. Khái quát về alginate.
“Alginate” là một thuật ngữ thường sử dụng cho muối của acid alginic, nhưng cũng cĩ thể dùng cho tất cả dẫn xuất của acid alginic và chính bản thân acid alginic. Acid alginic là một polysaccharide cĩ nhiều ở trong rong nâu, với các loại rong như: Ascophyllum; Fucus; Laminaria; Macrococystys; Sargassum… Alginate là một polymer được cấu tạo từ 2 monomer là: acid β-D-Mannuronic (M) và acid α- L-Guluronic (G), với các cầu nối là liên kết 1-4 glucoside, chúng chỉ khác nhau ở nhĩm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vịng pyranoza [14].
Alginate (E400 – E404) chủ yếu thu nhận từ trong tế bào và vách tế bào của tảo đỏ. Alginate cĩ nguồn gốc từ biển nên rất linh động và bền. Nghiên cứu đầu tiên
27
để chiết xuất alginate từ tảo được thực hiện bởi nhà hĩa học người Anh E.C Stanford vào cuối thế kỷ 19. Ngồi ra alginate cịn được tổng hợp từ Azotobacter, Pseudomonas.
Trong rong biển, acid alginic thường tồn tại dưới dạng muối alginate canxi, magie, sắt… Chúng tham gia vào cấu trúc thành và màng tế bào, là một copolymer mạch thẳng được tạo thành từ 2 gốc Uronat: G, M, chúng thường tồn tại ở dạng G- G-G-G…; M-M-M-M…; hay G-M-G-M… Như vậy alginate được xem là copolymer dạng khối, sự phân phối của thành phần M, G biến đổi nhiều theo lồi, do đĩ cĩ rất nhiều loại alginate và chúng cĩ tính chất khác nhau [14].
Hình 2.13: Cấu tạo hĩa học của alginate [14].
Cấu trúc phân tử:
Hình 2.14: Cấu trúc phân tử của alginate [14].
Alginates khơng sắp xếp theo trình tự ngẫu nhiên mà tuân theo một quy luật liên kết nhất định bao gồm các khối tương tự và xen kẽ (MMMMMM, GGGGGG
28
Alginate tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, từ dạng bột, hạt nhỏ, hạt lớn hay dạng sợi, cĩ màu sắc từ trắng sang vàng nâu.
2.4.2.1. Tính chất của alginate.
Vì alginate là một họ của các phân tử cĩ độ polymer hĩa, độ dài block, trình tự xắp xếp các block trong mạch khác nhau nên tính chất của alginate cũng biến thiên theo, cĩ 2 tính chất quan trong luơn được quan tâm đến là: độ nhớt và tính tạo gel.
a) Độ nhớt của dung dịch alginate [14]:
Alginate cĩ độ nhớt rất cao khi nĩ vẫn cịn thuộc về tế bào, khi được tách chiết độ nhớt giảm đáng kể. Độ nhớt phụ thuộc vào phương pháp tách chiết và cĩ
α-D-Mannuronic (M) hay khơng. Các đoạn mạch ngắn chứa những đoạn M sẽ khơng tham gia vào quá trình tạo gel, do đĩ nĩ dễ dàng thốt ra khỏi hạt gel, ở dạng acid hay muối kết hợp với kim loại hĩa trị 2 trở lên, sẽ tạo alginate khơng tan trong nước, nhưng lại cĩ khả năng hút nước và trương nở tạo thể gel. Khi kết hợp với ion kim loại hĩa trị 1 như Na+
, K+, NH4+… sẽ làm alginate tan trong nước tạo dung dịch cĩ độ nhớt cao.
Trong đĩ, những loại cĩ độ nhớt vào khoảng 200 ÷ 400 mPa.s là được sử dụng nhiều nhất. Khi nồng độ thay đổi, độ nhớt cũng thay đổi theo, ngồi ra độ nhớt cịn phụ thuộc vào:
Khối lượng phân tử: khối lượng phân tử càng cao, độ nhớt càng tăng. Các nhà sản xuất sẽ kiểm sốt khối lượng phân tử (DP) tương ứng với độ nhớt. Độ nhớt của alginate từ 10 ÷ 1000 mPa.s ứng với DP khoảng 100 – 1000 đơn vị.
Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt giảm tương ứng 2.5%
29
Thời gian bảo quản: khi ở dạng bột thành phẩm, alginate tiếp tục bị phân hủy, sau một thời gian bảo quản, chất lượng giảm đáng kể. Với alginate cĩ độ nhớt trung bình thì sau một năm bảo quản chất lượng giảm 45%. Ta cĩ thể cho vào một lượng nhỏ Ca2+
sao cho nĩ chưa đạt đến ngưỡng tạo gel để tăng thời gian bảo quản.
Phụ thuộc vào pH: khi pH = 5, nhĩm COO−bắt đầu bị proton hĩa, làm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi giảm, vì thế chúng sẽ xích lại gần nhau và tạo liên kết hydro, dẫn đến tăng độ nhớt. Nếu tiếp tục giảm pH xuống 3 ÷ 4 chúng sẽ tạo gel. Độ nhớt khơng bị ảnh hưởng ở khoảng pH 5 ÷ 11, nhưng khi pH = 11, alginate bị depolymer hĩa từ từ và làm giảm độ nhớt do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong mơi trường kiềm.
b) Tính chất tạo gel của alginate.
Một trong những tính chất quan trọng của alginate là khả năng tạo gel trong những điều kiện nhất định. Khi cho kết hợp với cation hĩa trị cao, thường dùng nhất là Ca2+, sẽ xuất hiện những vùng nối giữa các mạch trong phân tử alginate và tạo gel, gel sẽ được tạo thành ở nhiệt độ phịng hay nhiệt độ bất kỳ nhỏ hơn 1000C.
2.4.2.2. Cấu trúc hạt gel khi cố định enzyme
Theo phương pháp nhốt, tạo hạt alginate natri vào CaCl2, quá trình tạo gel diễn ra ngay khi alginate tiếp xúc với CaCl2. Khi chúng chuyển động và xắp xếp lại trong quá trình tạo gel, chúng kéo theo sự phân bố của enzyme [14].
2 Na(alginate) + Ca2+ --- > Ca(alginate)2 + 2 Na+
Chính lớp vỏ của mạng gel cũng như cấu trúc 3 chiều của mạng lưới, các mắt lưới đan chéo nhau, các enzyme sẽ khĩ thốt ra trong quá trình sử dụng. Theo cơ chế tạo gel, lớp gel bề mặt sẽ cĩ mật độ polymer cao hơn, do 2 hướng chuyển dịch: hạt gel co thể tích và phân tử alginate di chuyển từ trung tâm ra bên ngồi, điều này làm mật độ enzyme ở bề mặt lớn hơn ở trung tâm. Do enzyme tập trung ở bề mặt gel nên việc phân tử cơ chất khuếch tán vào tế bào cũng như khếch tán ra mơi trường sẽ nhanh hơn tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất [14].
30
Hình 2.16: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca2+ [14].
Hình 2.17: Cấu trúc khơng gian mạng lưới gel alginate [14].
2.4.2.3. Ứng dụng của alginate.
Alginate cĩ nhiều tính chất đặc trưng: tính tạo quánh, tạo gel, tính ổn định trong huyền phù… do đĩ nĩ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: làm chất độn, chất ổn định, chất nhũ hĩa, tạo gel… Trong đĩ ứng dụng nổi bậc là việc sử dụng alginate vào lĩnh vực cố định enzyme và tế bào. Chức năng chính của các alginate như ổn định nhiệt lạnh, thiết lập cấu trúc gel với sự cĩ mặt của các ion canxi, tạo gel ở nồng độ thấp so với gelatin.
Gel alginate cĩ khả năng chịu được nhiệt mà khơng tan chảy, mặc dù chúng cịn cĩ thể phân hủy. Sự tạo gel phụ thuộc vào liên kết ion (Mg 2 +
<<Ca 2 +
<Sr 2 +<Ba 2 +) với sự kiểm sốt của tổ hợp các cation quan trọng để tạo gel đồng nhất (ví dụ: bằng cách khuếch tán ion hoặc kiểm sốt sự axit hĩa của CaCO 3). Khi nồng độ G cao tạo gel mạnh với sự ổn định nhiệt tốt (ngoại trừ nếu cĩ trọng lượng phân tử phân tử thấp) nhưng dễ bị ngập nước, trong khi nồng độ M cao tạo độ đàn hồi yếu hơn nhiều gel với. Tuy nhiên ở mức thấp hoặc rất cao, Ca 2 +
nồng độ cao sẽ tạo được M alginate tạo gel cĩ cấu trúc chắc chắn hơn [14].
31
Độ hịa tan của alginate và khả năng giữ nước phụ thuộc vào pH (kết tủa dưới pH 3.5). Thơng thường alginate hấp thụ nước cao và cĩ thể hiển thị được sử dụng làm chất nhũ hố cĩ độ nhớt thấp. Alginate được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm như là những phần thức ăn vật nuơi.
Bảng 2.6: Một số ứng dụng của alginate [14].
Ngành Vai trị Sản phẩm ứng dụng
Thực phẩm Làm bền cấu trúc xốp Tạo cấu trúc gel Kem, chocolate, mứt… Bánh ngọt Mơi trường Kết hợp với ion kim loại nặng và Ca Loại nước cứng và ion kim loại nặng
Dược và y khoa
Tăng độ nhớt Thuốc dạng siro Màng bao thuốc tan
được Thuốc viên nang
Chất kết dính Thuốc viên nén Tạo phức với Ca trong
máu Thuốc cầm máu
2.4.3. Một số nghiên cứu sử dụng alginate làm chất mang cố định 2.4.3.1. Tạo hạt giống nhân tạo trên cây địa lan 2.4.3.1. Tạo hạt giống nhân tạo trên cây địa lan
Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt - Phân Viện Sinh học Đà Lạt đã tiến hành nhiều thí nghiệm tạo hạt nhân tạo trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau bằng cơng nghệ sinh học.
Hạt nhân tạo là một dạng mơ phỏng hạt tự nhiên. Hạt nhân tạo chứa phơi vơ tính được bọc trong lớp alginate cĩ chứa chất dinh dưỡng. Sau đĩ, các phơi vơ tính cĩ thể nảy mầm thành cây con hồn chỉnh. Việc sử dụng natri alginate làm vỏ bọc đã đạt được một số kết quả khả quan trên các đối tượng như : cần tây, hoa cẩm chướng, rau mùi, cây hồng. Tại Việt Nam, năm 1992, Viện Sinh học nhiệt đới cũng đã thực hiện việc sản xuất hạt nhân tạo trên đối tượng cây cà phê.
Hạt nhân tạo của cây địa lan Cymbidium spp. cũng được bọc bằng dung dịch natri alginate với nhiều nồng độ khác nhau. Tỷ lệ hạt sống sĩt của các hạt nhân tạo trong điều kiện in vitro là 100% và khả năng tái sinh cũng khá cao. Hạt nhân tạo khơng bị giảm khả năng sống sĩt sau khi được bảo quản một năm trong
32
mơi trường lỏng khơng chứa đường. Cây con được tạo ra từ những hạt nhân tạo này đều sống tốt sau 6 tháng ngồi nhà kính.
Hình 2.18: Hạt giống nhân tạo cây địa lan[8].
Kết quả cho thấy: Việc khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ alginate trong vỏ hạt, mơi trường nuơi cấy và giá thể khác nhau nên sự tái sinh cây in vitro của hạt nhân tạo từ nhiều nguồn nguyên liệu của cây địa lan cho thấy: phơi là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tạo hạt nhân tạo. Nồng độ alginate 30g/l trong dung dịch tạo vỏ hạt là nồng độ tối ưu giúp hạt cĩ tỷ lệ nảy mầm cao. Đồng thời, việc nuơi cấy hạt trên giá thể giúp mơi trường lỏng khuếch tán dinh dưỡng tốt (bơng gịn) tạo điều kiện thuận lợi cho sự tái sinh cây in vitro của hạt hơn là các giá thể rắn khác và mơi trường nuơi cấy cĩ nồng độ carbohydrate thấp phù hợp hơn cho sự tái sinh này. Ngồi ra, mơi trường lỏng bảo quản hạt cũng khơng cần lượng carbohydrate cao và nồng độ dinh dưỡng cũng cĩ thể được giảm cịn khoảng 1/2 - 1/5 so với mơi trường nuơi cấy.
2.4.3.2. Thủy phân saccharose bằng invertase cố định trên hạt canxi alginate [4]
Nghiên cứu đã cố định enzyme invertase trên alginate, sau đĩ so sánh tính chất của enzyme cố định và enzyme tự do.
Kết quả:
Ảnh hưởng nồng độ alginate lên hoạt tính của enzyme cố định:
Điều kiện thí nghiệm: nồng độ saccharose 5%, pH = 4.5 và nhiệt độ 550 C. Với nồng độ alginate 3.5% hiệu suất cố định protein-enzyme cao nhất.
33
Bảng 2.7: Ảnh hưởng nồng độ alginate lên hiệu suất cố định [4].
Nồng độ alginate 3.0 3.5 4.0 4.5 Hiệu suất cố định protein – enzyme (%) 55.27 64.27 55.36 53.35
Hoạt tính riêng (UI/mg protein enzyme)
2.18 3.51 3.25 1.49 2.06 3.72 3.27 1.64 2.03 3.64 3.34 1.24
Hoạt tính riêng trung binh
(UI/mg protein enzyme) 2.09 3.62 3.29 1.46 Hiệu suất hoạt tính riêng cố định (%) 22.59 39.14 35.57 15.78
Bảng 2.8: Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên hiệu suất cố định [4].
Nồng độ saccharose (%) 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính riêng
(UI/mg protein enzyme)
3.60 4.36 5.68 5.75 5.23 4.60 3.95 4.29 5.65 5.78 5.28 4.62 3.67 4.30 5.73 5.87 5.29 4.56
Hoạt tính riêng trung bình
(UI/mg protein enzyme) 3.74 4.32 5.69 5.80 5.27 4.59 Hiệu suất cố định (%) 32.92 38.03 50.09 51.06 46.39 40.40
Ảnh hưởng của cơ chất lên hoạt tính của enzyme cố định:
Điều kiện thí nghiệm: nồng độ saccharose 7%. pH = 4.5 và nhiệt độ 550C. Hiệu suất cố định hoạt tính riêng là enzyme cố định 3.5% đạt cao nhất 51.06% so với enzyme tự do cùng điều kiện thí nghiệm.
Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định:
Điều kiện thí nghiệm: nồng độ saccharose 7%, pH = 4,5 và nhiệt độ 550 C.
Hình 2.19: Đồ thị sự thay đổi hoạt tính enzyme cố định theo số lần tái sử dụng [4].
34
Khả năng thủy phân saccharose:
Hạt – Inver 3.5% được thí nghiệm với các điều kiện sau: 5g hạt, 8ml saccharose 7%, nhiệt độ 450
C, thời gian phân hủy là 12h/lần.
Hình 2.20: Mối quan hệ giữa lượng đường khử và số lần sử dụng [4].
Hiệu suất cố định protein enzyme đạt 64.27%, hiệu suất hoạt tính riêng cố định đạt 39.14% so sánh cũng điều kiện thí nghiệm với Inver tự do. Số lần tái sử dụng là 20 lần.
35
CHƯƠNG 3:
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và thiết bị 3.1.1. Vật liệu 3.1.1. Vật liệu
- Natri alginate của Kanto chemical Co, INC (Nhật).
- Enzyme Pectinex Ultra SP-L (Novoferm 14) của nhà phân phối Nam Giang, dạng lỏng Novozyme.
- Dung dịch albumin chuẩn nồng độ 1mg/ml. - Thuốc thử DNS - Thuốc thử Bradford - Đường sucrose … 3.1.2. Thiết bị - Bơm định lượng - Máy đo OD …