(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV 1 trên nấm men pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC MỞ ĐẦU Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên nghành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đinh Nho Thái TS Nguyễn Thị Hồng Loan Hà Nội, 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái, người thầy tận tình bảo, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm thí nghiệm viết luận văn Thầy khơng ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ làm quen từ nguyên tắc thao tác nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Trong q trình học tập nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ cán bộ, thành viên nhóm nghiên cứu mơn Di truyền học, Khoa Sinh học phịng protein tái tổ hợp, phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin cảm ơn thầy, cô giáo môn Di truyền học thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN giảng dạy bảo cho kiến thức kỹ cần thiết trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo đồng nghiệp Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, ủng hộ, tạo điều kiện cho thời gian học tập vừa qua Lời cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, người thân gia đình tơi chia sẻ, động viên hết lịng giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên: Đặng Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1.1.1 Lịch sử hình thành AIDS 1.1.2 Thực trạng nhiễm HIV-1 1.1.3 Cấu trúc hình thể hệ gen HIV-1 .5 1.1.4 Các thuốc điều trị HIV/AIDS .9 1.2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 12 1.2.1 Protease HIV-1 12 1.2.2 Chức protease HIV – 13 1.2.3 Sơ lƣợc nghiên cứu biểu protease HIV-1 giới 13 1.2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV-1 Việt Nam 16 1.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P PASTORIS 17 1.3.1 Đặc điểm P pastoris 18 1.3.2 Ƣu nhƣợc điểm hệ thống biểu P pastoris 19 1.3.3 Chủng nấm men P pastoris biểu protease HIV-1 20 1.3.4 Vector nhân dòng biểu P pastoris 21 1.3.5 Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris 22 1.3.6 Quá trình tiết protein ngoại bào P pastoris 22 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN LIỆU 24 2.1.1 Chủng vi sinh vật .24 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 kỹ thuật PCR .25 2.2.2 Điện di DNA gel agarose 27 2.2.3 Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: 28 2.2.4 Tách chiết định lƣợng DNA plasmid 30 2.2.5 Giải trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 31 2.2.6 Biến nạp vector vào nấm men phƣơng pháp xung điện 32 2.2.7 Điện di protein gel polyacyamide (SDS-PAGE) .33 2.2.8 Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) 34 2.2.9 Phƣơng pháp biểu thu nhận protein 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37 3.1 NHÂN DỊNG ĐOẠN GEN MÃ HĨA PROTEASE HIV-1 37 3.1.1 Nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 PCR 37 3.1.2 Tinh plasmid pPIC9 từ E coli 39 3.1.3 Cắt sản phẩm PCR cắt mở vòng plasmid enzym giới hạn 40 3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 phản ứng ligase 41 3.1.5 Kết giải trình tự xác định có mặt protease HIV-1 vector biểu pPIC9 42 3.2 TẠO DỊNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA PROTEASE HIV-1 TRÊN P PASTORIS 44 3.2.1 Tạo dòng nấm men P pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 44 3.2.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 P pastoris 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cấu trúc hạt virus HIV-1 Hình Cấu tạo hệ gen virus HIV-1 Hình Mơ hình cấu trúc bậc hai protease HIV-1 12 Hình Bản đồ vector biểu pPIC9 .21 Hình Cơ chế trao đổi chéo xảy locus HIS4 gen tế bào với vector biểu 22 Hình Kết nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 PCR .38 Hình Điện di sản phẩm tách chiết plasmid 39 Hình Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid sản phẩm PCR enzym giới hạn NotI EcoRI 40 Hình Điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α 42 Hình 10 So sánh trình tự cấu trúc Prot khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết 43 Hình 11 Sự hình thành khuẩn lạc P pastoris SMD1168 45 Hình 12 Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men 46 Hình 13 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris SMD1168 sau biểu mơi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………49 Hình 14 Điện di SDS-PAGE kiểm tra có mặt protease HIV-1 chủng tái tổ hợp SMD1168 50 Hình 15 Kết kiểm tra protein thẩm tách miễn dịch Western Blot 51 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Một số chủng P pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu protein tái tổ hợp 20 Bảng Các cặp mồi sử dụng phản ứng PCR .26 Bảng Thành phần phản ứng PCR .27 Bảng Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn 28 Bảng Thành phần gel tách gel cô SDS-PAGE 33 Bảng Khả sinh trƣởng dòng nấm men tái tổ hợp thông qua số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm lần 48 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy) AOX Alcohol oxidase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic ddNTP dideoxyribonucleotide – triphosphate E coli Escherichia coli HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency virus) HIS: Histidine KLPT Khối lƣợng phân tử kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani mRNA RNA thông tin (Messenger RNA) MM: Môi trƣờng Minimal Methanol P pastoris Pichia pastoris PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease Inlibitor) RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sunfat SDS-PAGE: phƣơng pháp điện di gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS) MỞ ĐẦU Virus gây suy giảm miễm dịch ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) nguyên nhân gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ngƣời (AIDS) Đây bệnh làm nhiều ngƣời chết lịch sử lồi ngƣời [49] Có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc HIV-2 ngun nhân ca nhiễm HIV tồn giới từ xuất [28] Để tồn phát triển, HIV-1 cần đến enzym quan trọng khơng thể thiếu chép, đóng gói hình thành virus hồn chỉnh là: enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase enzym protease Nếu ba enzym bị ức chế chu kì sống HIV bị ảnh hƣởng, hƣớng nghiên cứu tìm chất ức chế enzym để sản xuất thuốc điều trị cho bệnh nhân AIDS đƣợc nhiều nhà khoa học giới quan tâm Các điều trị theo hƣớng sử dụng chất ức chế enzym gọi liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28] Enzym protease HIV-1 (đƣợc gọi tắt protease HIV-1) đƣợc mã hố gen pol virus có chức cắt chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus tiếp tục lây nhiễm Nếu protease bị hoạt tính, HIV-1 khơng đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19] Tuy nhiên, HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus đƣợc tạo ngày tỷ lệ sai sót enzym reverse transcriptase 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến bệnh nhân nhiễm bệnh chí chƣa điều trị Ngày có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển thƣơng mại hóa nhƣng chƣa tìm đƣợc chất ức chế thực có hiệu Vì vậy, việc nghiên cứu tìm chất ức chế protease cách hiệu nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS Quá trình nghiên cứu nhằm tìm chất ức chế protease cần lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh protease HIV-1 cần thiết Cho đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 toàn giới Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu tế bào vật chủ đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu thƣờng thấp, khó phát Do đó, cần có nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan hiệu Phần lớn cơng trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 Escherichia coli (E coli), hệ thống biểu đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41] Tuy nhiên, E coli sinh vật nhân sơ thiếu quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất máy golgi nhƣ sinh vật nhân chuẩn (có chức cải biến protein sau tổng hợp) Nhiều protein sinh vật nhân chuẩn biểu E coli khơng tạo thành dạng protein hồn chỉnh có chức cải biến sau dịch mã không diễn Hạn chế đƣợc khắc phục cách sử dụng hệ thống biểu sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men động vật có vú Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ đặc điểm thể mơ hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn Nhiều protein tế bào nhân thực đƣợc sản xuất thành công hệ thống biểu nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) [10] Ngoài S cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P pastoris) bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu protein sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập tạo dòng P pastoris hệ thống biểu đáng tin cậy có tiềm E coli hay S cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27] Để tạo chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế nhân lên virus HIV-1, làm sở cho việc nghiên cứu tìm thuốc điều trị HIV/AIDS, với thuận lợi hệ thống biểu nấm men P pastoris so với E coli, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 nấm men P pastoris” với nội dung: - Nhân gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu - Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 nấm men P pastoris nhằm xác định xem có mặt gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hƣởng đến sinh trƣởng chủng nấm men SMD1168 Sản phẩm biến nạp sau đƣợc cấy trải môi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) ngày Nhiệt độ tăng sinh cho nấm men 30oC Kết khuẩn lạc nấm men mọc đều, có màu trắng tách biệt với (Hình 11) Hình 11 Sự hình thành khuẩn lạc P pastoris SMD1168 (11A) Sản phẩm biến nạp pPIC9 vào nấm men P pastoris SMD1168; (11B) Sản phẩm biến nạp pPIC9-Prot vào nấm men P pastoris SMD1168 Với có mặt gen HIS4 pPIC9 tế bào nấm men có mang vector có khả mọc môi trƣờng khuyết dƣỡng histidine Những khuẩn lạc mọc mơi trƣờng MD chứng tỏ chúng có chứa plasmid pPIC9 nên có khả tổng hợp histidine Cả hai đĩa nuôi cấy xuất khuẩn lạc trắng có mặt pPIC9 tế bào Nhƣ biến nạp thành công pPIC9 vector pPIC9-Prot vào tế bào chủng nấm men P pastoris SMD1168 Về lý thuyết plasmid đƣợc chuyển vào tế bào xảy sát nhập vào gen tế bào theo hai phƣơng thức chèn gen thay gen Để kiểm tra phƣơng thức sát nhập vector tái tổ hợp vào hệ gen nấm men, chiều vị trí chèn gen, chọn ngẫu nhiên đĩa nuôi cấy khuẩn lạc tiến 45 hành kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi số (bảng 2) Theo Kit biểu P pastoris hãng Invitrogen, sản phẩm PCR vector pPIC9 sử dụng cặp mồi 5’AOX1 cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp [29] Nhƣ vậy, với khuẩn lạc mang vector pPIC9-Prot, sản phẩm PCR cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 850 bp (500 bp trình tự vector + 356 bp trình tự gen mã hóa protease HIV-1) Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra gel agarose 0,8% (hình 12) Hình 12 Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men Giếng 1: Thang DNA 1kb; Giếng 2: Đối chứng âm với khuôn H20 Giếng 3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9 ; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9-Prot Kết hình 12 cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc nấm men P pastoris SMD1168 chứa vector tái tổ hợp pPIC9-Prot giếng số cho hai băng, băng gen AOX1 hệ gen nấm men kích thƣớc khoảng 2,2 kb băng cấu trúc pPIC9-Prot có kích thƣớc khoảng 850 bp nhƣ dự tính lý thuyết Trên giếng số sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa plasmid pPIC9 khơng mang gen mã hóa protease HIV-1, xuất hai băng với kích thƣớc tƣơng ứng 2,2 kb ( gen 46 AOX1 genome nấm men) 0,5 kb (trình tự promoter AOX1 bắt cặp với mồi AOX1 nằm plasmid pPIC9) Trong đó, đối chứng âm với khuôn H2O không cho băng DNA (giếng 2) Nhƣ vậy, chúng tơi tạo thành cơng dịng SMD1168 tái tổ hợp có kiểu hình Mus+ tiến hành bƣớc cảm ứng biểu protease HIV-1 3.2.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 P pastoris Các chủng nấm men P pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 pPIC9Prot đƣợc nuôi cấy song song môi trƣờng BMGY đến OD600 đạt khoảng -7 Sau đó, chủng SMD1168 đƣợc chuyển sang mơi trƣờng cảm ứng biểu MM có methanol 0,5%, methanol đƣợc thêm vào sau 24 Điều kiện nuôi lắc nhiệt độ 30oC, 100 tốc độ lắc 200 vòng/phút Để theo dõi trình sinh trƣởng chủng nấm men tái tổ hợp xem việc chứa gen mã hóa protease HIV-1 gen có làm ảnh hƣởng tới sức sống thể biến nạp hay không, tiến hành thu dịch môi trƣờng trƣớc lần thêm methanol đo phổ hấp phụ dịch nuôi cấy theo thời gian, bƣớc sóng 600 nm (Bảng 6) Kết thu đƣợc thể đƣờng cong sinh trƣởng (Hình 13) 47 Bảng Khả sinh trƣởng dịng nấm men tái tổ hợp thơng qua số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm lần 0h 24 h 48 h 72 h 96 h Lặp lại pPIC9 pPIC9-Prot Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình Lần Lần Lần Trung bình 1,02 1,01 0.92 0,98 2,12 3,59 3,20 2.97 5,81 6,84 5,20 5,95 6.92 8,75 6,52 7,40 7,50 8,98 8,50 8,33 1,02 1,09 0,97 1,02 2,14 3,60 2,55 2,76 6,12 6,84 4,66 5.87 7,25 8,75 6,48 7,49 7,80 8,96 8,32 8.37 Theo kết thu đƣợc (trên bảng hình 13), chủng đối chứng mang plasmid pPIC9 chủng có mang cấu trúc pPIC9-Prot có đƣờng cong sinh trƣởng tƣơng đối giống Chứng tỏ, có mặt gen mã hóa protease HIV-1 nhƣ plasmid pPIC9 không ảnh hƣởng tới trình sinh trƣởng chủng P pastoris tái tổ hợp 48 Hình 13 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris SMD1168 sau biểu môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian Đƣờng màu xanh sinh trƣởng P pastoris SMD1168 mang pPIC9 (pPIC9) Đƣờng màu đỏ sinh trƣởng P pastoris SMD1168 mang pPIC9-Prot (pPIC9-prot) Trong trình biểu hiện, protease HIV-1 đƣợc tiết môi trƣờng Nếu protease HIV-1 có hoạt tính tự cắt đầu N để giải phóng protein có axit amin mở đầu Prolin có kích thƣớc 108 axit amin (99 axit amin protease HIV-1 + axit amin trình tự HA đầu C) có KLPT khoảng 12 kDa Nhƣ vậy, băng protein pPIC9-Prot (giếng - hình 14) ghi nhận kết điện di SDS-PAGE protease HIV-1 Tuy nhiên, mẫu pPIC9 xuất băng có kích thƣớc gần giống với pPIC9-Prot (giếng 2- hình 14) 49 Hình 14 Điện di SDS-PAGE kiểm tra có mặt protease HIV-1 chủng tái tổ hợp SMD1168 (72h) Giếng 1: Thang protein; Giếng 2: Dịch môi trƣờng chủng P pastoris SMD1168 mang pPIC9; Giếng 3: Dịch môi trƣờng chủng P pastoris SMD1168 mang pPIC9+Prot Vì vậy, để kiểm tra khẳng định chắn băng protein có kích thƣớc khoảng 12 kDa chủng nấm men tái tổ hợp hình 14 protease HIV-1, chúng tơi tiến hành kiểm tra tiếp kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blotting Các mẫu đƣợc lấy với thể tích tƣơng đƣơng, tiến hành điện di, sau đƣợc lai với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 Kết màu (hình 15) cho thấy mẫu protein pPIC9-Prot (giếng số 3) xuất tín hiệu dƣơng tính vị trí tƣơng ứng với băng protein có KLPT khoảng 12 kDa nhƣ ghi nhận SDS-PAGE (Hình 14) Băng protein dƣơng tính chƣa đậm, chứng tỏ hàm lƣợng protease HIV-1 mẫu chƣa cao Điều q trình thí nghiệm, chúng tơi chƣa cô đặc dịch môi trƣờng để làm tăng nồng độ protein Trong đó, protein từ nấm men mang pPIC9 đối chứng không cho băng protein (giếng số - hình 15) Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tơi khẳng định biểu đƣợc protease HIV-1 vector pPIC9 nấm men P pastoris SMD1168 50 Hình 15 Kết kiểm tra protein thẩm tách miễn dịch Western Blot Giếng 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Giếng 2: Dịch môi trƣờng chủng P pastoris SMD1168 mang pPIC9 Giếng 3: Dịch môi trƣờng chủng P pastoris SMD1168 mang pPIC9-Prot Mặc dù kết phân tích SDS-PAGE cho thấy hàm lƣợng protease HIV-1 đƣợc biểu từ chủng SMD1168 chƣa cao dịch môi trƣờng sau cảm ứng cịn có số protein tạp Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho thấy chủng P pastoris SMD1168 tái tổ hợp có khả biểu protease HIV-1 dạng tan tiết vào môi trƣờng Kết phần khắc phục đƣợc số hạn chế nghiên cứu trƣớc tính tan protease HIV-1 Phần lớn nghiên cứu biểu protease HIV-1 trƣớc cho kết protease HIV-1 thƣờng khó tan thu đƣợc phân đoạn tủa tế bào, cụ thể giới kể tới nhƣ: Cheng tập thể (1990) [15], Leuthardt tập thể (1993) [31], gần Yanchunas tập thể (2005) [50] cho kết quả, protease HIV-1 đƣợc biểu dạng không tan thu đƣợc phân đoạn tủa tế bào Ở Việt Nam, năm 2012 Nguyễn Thị Hồng Loan tập thể công bố kết biểu protease HIV-1 E coli, thu đƣợc phân đoạn tủa tế bào dạng không tan 51 Kết này, phù hợp với nghiên cứu Rangwala tập thể công bố năm 1992 [41] protease HIV-1 biểu với lƣợng thấp dễ tan thu đƣợc dịch chiết tế bào Với kết thu đƣợc, bƣớc đầu khẳng định nghiên cứu biểu thành công protease HIV-1 chủng nấm men P pastoris SMD1168 dạng tan tiết vào dịch môi trƣờng Đây nghiên cứu biểu protease HIV-1 nấm men P pastoris Việt Nam 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trình thực đề tài, rút số kết luận sau: 1/ Đã nhân dịng thành cơng gen mã hóa protease HIV-1 vào vector pPIC9 2/ Bƣớc đầu biểu đƣợc gen mã hóa protease HIV-1 vector pPIC9-Prot nấm men P pastoris SMD1168, protease HIV-1 tiết môi trƣờng nuôi cấy dạng tan cho băng protein 12 kDa SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch KIẾN NGHỊ Đề tài chúng tơi tiếp tục phát triển theo hƣớng: 1/ Tối ƣu hóa điều kiện biểu protease HIV-1 P pastoris 2/ Tinh xác định hoạt tính protease HIV-1 biểu P pastoris 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Phan Trọng Hồng, Ngơ Văn Trƣờng, Lê Văn sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2007) “Tách dịng biểu gen mã hóa tiểu đơn vị p66 enzym phiên mã ngƣợc virus HIV-1”, Tạp chí khoa học Cơng nghệ Sinh học, 5, tr 463-470 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Hồng Loan (2012), Nhân dòng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV-1 Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu vùng gen preM-env virus Dengue typ nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 91-109 Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách Quang, (2013), “Đặc điểm phân bố subtyp HIV-1 Việt nam”, tạp chí Y-Dược học quân (số 5-2013) tr 33-40 Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng biểu gen p24 từ chủng HIV lƣu hành Việt Nam nghiên cứu phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể HIV huyết bệnh nhân”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6, tr 27-34 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Phƣơng Hoa, Lê Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “ Biểu protein GP41 virus HIV phân type CRF01_ AE E coli ứng dụng để phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân Western blot ELISA”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 9, tr 29-36 54 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh (2012), Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp HIV-1 ứng dụng để phát triển kit chẩn đốn HIV/AIDS, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 10 Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Kim Young-Ho, Đinh Duy Kháng, Đồng Văn Quyền (2007), "Tách dòng biểu gen mã hóa polymerase virus viêm gan B bề mặt tế bào Sacharomyces", Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(4), 419-424 II Tài liệu Tiếng Anh 11 Randy S., (2007), And The Band Played On, St Martin's Press, pp 227 12 Aurel Lupulescu, Maibach Howard I., (1990), Hormone and vitamins in cancer treatment, CRC PR INC, pp 131 - 133 13 Anson B.D., Weaver J.G., Ackerman M.J., Akinsete O., Henry K., January C.T., Badley A.D.(2005), “Blockade of HERG channels by HIV protease inhibitors”, Lancet 365: pp 682-686 14 Chen J., Liang Z., Wang W., Yi C., Zhang S., Zhang Q., (2014), "Revealing origin of decrease in potency of darunavir and amprenavir against HIV-2 relative to HIV-1 protease by molecular dynamics simulations", Sci Rep Nov 3;4:6872 doi: 10.1038/srep06872 15 Cheng Y.S.E., McGowan M.H., Kettner C.A., Schloss J.V., Erickson S., Yin F.H (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzym from inclusion bodies”, Gen, 87, pp 243-248 16 Cereghino L N., Geoffrey P., Sunga A J., Lin Cereghino J., and Cregg J M (2001), “Expression of foreign gens in the yeast P pastoris”, Gent End 23, pp 157-16 17 Cuba reports modest progress in HIV -1 (2013), Xinhua via NewsPoints Desk 18 Danley D.E., Geoghegan K.F., Scheld K.C., Lee S.E., Merson J.R., Hawrylik S.J., Rickett G.A., Atmnirati M.J and Hobart P.M (1989), “Crystallizable HIV-l protease derived from expression of the viral pol gen in Escherichia coli” Biochem Biophys Res Commun, 165, pp 1043-1050 55 19 Darke P.L., Leu C.T., Davis L.J., Heimbach J.C., Diehl R.E., Hill W.S., Dixon R.A.F and Siga I.S (1989), “Human immunodeficiency virus protease bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J Biol Chem, 264, pp 2307-2312 20 Dalgleish A.G., Beverley P.C., Clapham P.R., “The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus” Nature 1984, 312: 763-7 http://amedeo.com/lit.php?id=6096719 21 Ellis S B., Brust, P F., Koutz, P J., Waters, A F., Harpold, M M., and Gingeras, T R (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable gens from the yeast P pastoris”, Mol Cell Biol, 5, pp 1111-1121 22 Jahic M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O (2006), “Process technology for production and recovery of heterologous proteins with P pastoris”, Biotechnol Prog, 22, pp 1465–1473 23 Frank Bruce H., Heiney, Richard E., ( 1995) "Process for transformating a human insulin precursor to human insulin", US Patent 5457066 24 Greene W.C (2007), "A history of AIDS: looking back to see ahead", Eur J Immunol, 37, pp 94-102 25 Galli M., Ridolfo A.L., Adorni F., Gervasoni C., Ravasio L., Corsico L., Gianelli E., Piazza M., Vaccarezza M., d'Arminio Monforte A., Moroni M (2002), "Body habitus changes and metabolic alterations in protease inhibitor-naive HIV-1-infected patients treated with two nucleoside reverse transcriptase inhibitors", AIDS, 29, pp 21-31 26 Hare B.C., (2006), "Clinical Overview of HIV Disease", HIV Insite Knowledge Base Chapter- Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu 27 Higgins D.R and Cregg J.M., (1998), Pichia protocol, Methods in molecular biology, Humana Prees 28 Hoffmann C., Rockstroh J.K., Kamps B.S HIV medicine (2007), www HIV Medicine.com 56 29 Invitrogen, Pichia Expression Kit: A manual of Method for Expression of Recombinant Protein in P pastoris Catalog K1710-01 30 Laemmli U.K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227, pp 680-685 31 Leuthardt A., Roesel J.L.(1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-HIStidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 36, pp 275280 32 Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al (2013), “The Effect of?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp 311–317 33 Marx J.L (August 1982) "New disease baffles medical community" Science 217 (4560): 618–21 34 Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B., and Harvey L.M., (2005), “Heterologous protein production using the P pastoris expression system” Yeast, 22, pp 249–270 35 McCormac A C., et al., (1998) “A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation” Molecular Biotechnology 9:155-159 36 Miyeko Mana and David Marcey (2001), HIV-1 Protease, Clu Biology Department 37 Mike Romanos (1995), “Advances in the use of P pastoris for high level gen expression”, Current Opinion in Biotechnology, 6, pp 527-533 38 Oriol C., Ramon R., Jose Luis M., & Francisco V., (2006), “Monitoring and control of hetorologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters”, Bio Med central Operation strategies 57 39 Pichuantes S., Babe L M., Barr P l & Craik C S (1989), “Recombinant HIVl protease secreted by Saccharomyes cerevisiae correctly processes myristylated gag polyprotein”, Proteins: Struct Funct Gent 6, 324-337 40 Plantier, J.C (2009) ''A new human immunodeficiency virus derived from gorillas'', Nature Medicine, 2nd August 41 Rangwala S.H., Finn R.F., Smith C.E., Berberich S.A., Salsgiver W.J., Stallings W.C., Glover G.I., Olins P.O (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gen, 122, pp 263-269 42 Sanger F., Nicklen S and Coulson A.R (1977), “DNA sequencing with chain terminator inhibitors”, Proc Natl Acad Sci U S A 74, pp 5463-5467 43 Shedlock D.J., Daniel H., Andy Y.C., Christopher W.C., Karuppiah M., David B.W (2008), "HIV-1 viral gen and mitochondria apoptosis", Apoptosis, 13, pp 1088-1099 44 Siliciano J.D., Kajdas J., Finzi D., Quinn T.C., Chadwick K., Margolick J.B., Kovacs C., Gange S.J., Siliciano R.F (2003), "Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells", Nat Med, 9, pp 727-728 45 Seelmeier S., Schmidt H., Turk, V and Helm K.V.D (1988), "Human immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited by pepstatin A", Proc Natl Acad Sci U S A 85, pp 6612-6616 46 Taylor A., Brown P.D., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner E.W., Weigl D., Turon C.M and Katz L (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl Microbiol Biotechnol 37, pp 205-210 47 Tie Y (2006), Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease and drug-resistant mutants, Chemistry Dissertations, Department of Chemistry, Georgia State University, pp 48 Tie Y., Wang YF, Boross PI, Chiu TY, Ghosh AK, Tozser J, Louis J M., Harrison RW, Weber IT, (2012), Critical differences in HIV-1 and HIV-2 protease specificity for clinical inhibitors, Protein Sci Epub 2012 Jan 24 58 49 UNAIDS in Vietnam from www.unaids.org.vn 50 Yanchunas J., Langley D.R., Tao L., Rose R.E., Friborg J., Colonno R.J., Doyle M.L (2005), "Molecular basis for increased susceptibility of isolates with atazanavir resistance-conferring substitution I50L to other protease inhibitors", Antimicrob Agents Chemother, 49, pp 3825-3832 51 Zhang W., Bevins M.A., Plantz B.A., Smith L.A., Meagher M.M (2000), "Modelling Pichia pastoris growth on methanol and optimising the production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A" Biotechnol Bioeng 70: 1–8 52 Zhang W., Inan M., Meagher M M (2005), Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast P pastoris, Biotechnol Bioprocess Eng, 5, pp 275 – 28 53 http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html 54 http://www.anninhthudo.vn/506855.antd 55 http://www.diabetes.co.uk/diabetes-types.html 56 http://vietbao.vn/Bao-dong-ty-le-nhiem-HIV-AIDS-tren-the-gioi 59 ... VỀ PROTEASE HIV- 1 12 1. 2 .1 Protease HIV- 1 12 1. 2.2 Chức protease HIV – 13 1. 2.3 Sơ lƣợc nghiên cứu biểu protease HIV- 1 giới 13 1. 2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV- 1. .. dung: - Nhân gen mã hóa protease HIV- 1 vào vector biểu - Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV- 1 nấm men P pastoris CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1. 1 .1 Nguyên nhân... GS190 ARG4 GS200 HIS4ARG4 SMD 116 8 ∆PEP4:URA HIS4 ura3 SMD 116 5 HIS4 PRB1 SMD 116 3 PEP4 HIS4 PRB1 20 Chủng nấm men P pastoris SMD 116 8 đƣợc lựa chọn sử dụng biểu gen mã hóa protease HIV- 1 Ngồi gen