Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với các yếu tố tiên lượng, định hướng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ VŨ ĐÌNH QUANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG, ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Vũ Đình Quang NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG, ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2019 TS BS Phùng Tuyết Lan LỜI CAM ĐOAN Tơi là: Vũ Đình Quang, nghiên cứu sinh khóa 2013-2018, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Phùng Tuyết Lan Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm cam kết Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019 NGƯỜI CAM ĐOAN VŨ ĐÌNH QUANG LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS BS Phùng Tuyết Lan, hai người thầy khoa học tận tâm hướng dẫn, bảo, động viên suốt năm thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất bệnh nhân gia đình bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu Chính đau đớn, mát em động lực thơi thúc tơi hồn thiện nghiên cứu này, cho em cho bệnh nhân sau em Tôi xin cảm ơn tất đồng nghiệp khoa Di truyền Sinh học Phân tử, nhà thứ hai tôi, bên lúc vui, lúc buồn, thành cơng hay thất bại Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo, cô giáo cán nghiên cứu Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu khuôn khổ đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn đến anh chị, bạn bè đồng nghiệp bệnh viện Nhi Trung ương bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec đạt sản phẩm khoa học ngày hôm Tôi xin cảm ơn người bạn thân thiết bên Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn tới gia đình mình, tới bố, tới người mẹ khuất, tới người bạn đời yêu thương hai với lo lắng, chăm sóc, sẻ chia tình u lớn lao dành cho Hà Nội, ngày 04 tháng 03 năm 2019 Vũ Đình Quang MỤC LỤC MỞ ĐẦU .11 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1 Khái quát u nguyên bào thần kinh 15 1.1.1 Tỷ lệ mắc .15 1.1.2 Nguyên nhân hình thành khối u nguyên bào thần kinh .15 1.1.3 Phôi thai học u nguyên bào thần kinh 16 1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh 18 1.2 Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng u nguyên bào thần kinh 20 1.2.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh 20 1.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh u nguyên bào thần kinh .26 1.3 Các đặc điểm di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 27 1.3.1 Biến đổi số lượng nhiễm sắc thể 27 1.3.2 Biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể 28 1.3.3 Khuếch đại gen MYCN .30 1.3.4 Sự biến đổi biểu gen bệnh u nguyên bào thần kinh 36 1.3.5 U nguyên bào thần kinh di truyền .39 1.3.6 Mơ hình biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 40 1.4 Các kỹ thuật di truyền sử dụng để phát biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 43 1.4.1 Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ 43 1.4.2 Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối .46 1.4.3 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen 49 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh u NBTK Việt Nam 52 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .55 2.1 Đối tượng nghiên cứu 55 2.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .55 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 55 2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 55 2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân .56 2.1.5 Cỡ mẫu: .56 2.1.6 Thiết kế nghiên cứu .57 2.2 Phương pháp nghiên cứu .57 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu bệnh phẩm 57 2.2.2 Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ 58 2.2.3 Kỹ thuật tách chiết DNA .60 2.2.4 Kỹ thuật MLPA 61 2.2.5 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen 63 2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu .64 2.3.1 Nghiên cứu số biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 64 2.3.2 Nghiên cứu mối liên quan số biến đổi di truyền với số biểu lâm sàng, cận lâm sàng điều trị bệnh nhân 65 2.4 Xử lý số liệu 65 2.5 Đạo đức nghiên cứu .65 2.6 Sơ đồ nghiên cứu 67 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .69 3.1 Phát số bất thường di truyền bệnh nhân nhi mắc u nguyên bào thần kinh 69 3.1.1 Xác định trạng thái khuếch đại gen MYCN kỹ thuật FISH .69 3.1.2 Xác định số biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể kỹ thuật MLPA CGH 76 3.1.3 Quy trình xét nghiệm biến đổi di truyền bệnh nhân u NBTK .93 3.2 Xác định mối liên quan biến đổi di truyền với số yếu tố tiên lượng định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh 95 3.2.1 Mối liên quan trạng thái gen MYCN với tuổi chẩn đoán 95 3.2.2 Mối liên quan trạng thái gen MYCN với giới tính 98 3.2.3 Mối liên quan trạng thái gen MYCN với giai đoạn bệnh 99 3.2.4 Mối liên quan trạng thái gen MYCN với số VMA/HVA 103 3.2.5 Mối liên quan trạng thái gen MYCN với số LDH 107 3.2.6 Mối quan hệ trạng thái gen MYCN với trạng thái biệt hóa tế bào 109 3.2.7 Mối quan hệ trạng thái gen MYCN với tiên lượng mô bệnh học 111 3.2.8 Ý nghĩa biến đổi di truyền với điều trị 114 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 121 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN PL01 PHỤ LỤC KẾT QUẢ MLPA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN PL10 PHỤ LỤC KẾT QUẢ TÁCH DNA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN PL15 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt BDNF BH CGH CNV DM EFS FISH HSR HVA INRGSS INSS LDH LTS Chữ viết tắt MIBG MKI MLPA NBTK NCA NGF NST PCR SCA Trk VMA DANH MỤC BẢNG Bảng Tên Trang Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INRGSS 22 Bảng 1.2 Bảng phân loại nhóm nguy u NBTK 23 Bảng 1.3 Bảng phân nhóm điều trị bệnh nhân nguy khơng cao Bảng 1.4 Các đoạn hệ gen khối u NBTK 41 Bảng 3.1 Phân bố trạng thái gen MYCN nghiên cứu .72 Bảng 3.2 Phân bố dạng khuếch đại gen MYCN nghiên cứu Bảng 3.3 So sánh kết nghiên cứu tỷ lệ khuếch đại gen MYCN 25 72 nghiên cứu với số nghiên cứu công bố 73 Bảng 3.4 Kết phân tích 10 mẫu kỹ thuật MLPA 77 Bảng 3.5 Kết lai so sánh hệ gen bệnh nhân u NBTK 85 Bảng 3.6 Số lượng dạng biến đổi số lượng nhiễm sắc thể tìm 89 Bảng 3.7 Số lượng dạng biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể tìm 90 Bảng 3.8 So sánh kết phát CNV nhiễm sắc thể số 17 kỹ thuật MLPA CGH 92 Bảng 3.9 Phân bố bệnh nhân theo tuổi 95 Bảng 3.10 Phân bố trạng thái gen MYCN theo nhóm tuổi 97 Bảng 3.11 Phân bố trạng thái gen MYCN theo giới tính 99 Bảng 3.12 So sánh kết nghiên cứu phân bố theo đoạn giai đoạn bệnh nghiên cứu với số nghiên cứu công bố 101 Bảng 3.13 Kết HVA niệu 103 Bảng 3.13 Kết VMA niệu .104 Bảng 3.15 Kết số LDH huyết 107 Bảng 3.16 Kết phân tích biệt hố tế bào .109 TT Họ tên bệnh nhân 101 Trương Nguyễn Hoài A 102 Hoàng Thị Kiều T 103 Hoàng Gia B 104 Nguyễn Hải P 105 Nguyễn Khôi N 106 Trương Đức T 107 Lê Minh P 108 Nguyễn Linh C 109 Lê Anh H 110 Đặng Thế N 111 Nguyễn Đức A 112 Nguyễn Hoàng Anh Q 113 Lê Thị Bảo T 114 Phạm Thị Thu H 115 Lê Thành A 116 Vũ Quang M PL TT Họ tên bệnh nhân 117 Nguyễn Lê Trường G 118 Lê Phương A 119 Trịnh Minh K 120 Đỗ Cao ngọc Á 121 Bùi Minh T 122 Nguyễn Mai A 123 Nguyễn Thị H 124 Vũ Bảo A 125 Bùi Thị Mai Phương T 126 Tạ Mai H 127 Vũ Văn T 128 Nguyễn Đỗ Xuân T 129 Trịnh Thị Khánh H 130 Tô Thế C 131 Trần Minh H 132 Nguyễn Tuấn H PL TT Họ tên bệnh nhân 133 Lê Quý Đ 134 Nguyễn Văn L 135 Vi Anh K 136 Hà Bảo L 137 Nguyễn Văn Q 138 Nguyễn Đức H 139 Trần Khánh L 140 Lê Gia H 141 Trần Khánh L PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS BS Phùng Tuyết Lan PL PHỤ LỤC KẾT QUẢ MLPA CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN Tỷ lệ 2p Vị trí đánh dấu đầu dị Phụ lục 2.1 Kết MLPA bệnh nhân NB151005 Hình ảnh kết MLPA bệnh nhân NB151005 phát thấy vị trí đánh dấu dao động xung quanh giá trị bình thường, khơng có xuất vị trí tăng hay giảm tín hiệu nhiễm sắc thể số 17, Do vậy, kết MLPA bệnh nhân không phát biến đổi có ý nghĩa lâm sàng nhiễm sắc thể nói PL 10 Tỷ lệ 2p Vị trí đánh dấu đầu dị Phụ lục 2.2 Kết MLPA bệnh nhân NB151103 Hình ảnh kết MLPA bệnh nhân NB151103 phát thấy vị trí đánh dấu dao động xung quanh giá trị bình thường, khơng có xuất vị trí tăng hay giảm tín hiệu nhiễm sắc thể số 17, Do vậy, kết MLPA bệnh nhân khơng phát biến đổi có ý nghĩa lâm sàng nhiễm sắc thể nói PL 11 Tỷ lệ 2p Vị trí đánh dấu đầu dò Phụ lục 2.3 Kết MLPA bệnh nhân NB151108 Hình ảnh kết MLPA bệnh nhân NB151108 phát thấy vị trí đánh dấu dao động xung quanh giá trị bình thường, khơng có xuất vị trí tăng hay giảm tín hiệu nhiễm sắc thể số 17, Do vậy, kết MLPA bệnh nhân không phát biến đổi có ý nghĩa lâm sàng nhiễm sắc thể nói PL 12 Tỷ lệ 2p Vị trí đánh dấu đầu dị Phụ lục 2.4 Kết MLPA bệnh nhân NB160102 Hình ảnh kết MLPA bệnh nhân NB160102 phát thấy vị trí đánh dấu dao động xung quanh giá trị bình thường, khơng có xuất vị trí tăng hay giảm tín hiệu nhiễm sắc thể số 17, Do vậy, kết MLPA bệnh nhân không phát biến đổi có ý nghĩa lâm sàng nhiễm sắc thể nói PL 13 Tỷ lệ 2p Vị trí đánh dấu đầu dò Phụ lục 2.5 Kết MLPA bệnh nhân NB161005 Hình ảnh kết MLPA bệnh nhân NB161005 phát thấy vị trí đánh dấu dao động xung quanh giá trị bình thường, khơng có xuất vị trí tăng hay giảm tín hiệu nhiễm sắc thể số 17, Do vậy, kết MLPA bệnh nhân khơng phát biến đổi có ý nghĩa lâm sàng nhiễm sắc thể nói PL 14 PHỤ LỤC KẾT QUẢ TÁCH DNA TỔNG SỐ CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN STT Họ tên Nguyễn Hồng P Nguyễn Đức T Nguyễn Hồng Q Nguyễn Hoàng M Nguyễn Anh Đ Nguyễn Vinh H Vũ Bảo A Tạ Mai H Trương Nguyễn Hoài A 10 Hoàng Thị Kiều T 11 Trịnh Minh K 12 Nguyễn Mai A 13 Nguyễn Tuấn H 14 Nguyễn Đức H PL 15 PL 15 ... bào thần kinh Xác định mối liên quan biến đổi di truyền với số y? ?u tố tiên lượng định hướng đi? ?u trị u nguyên bào thần kinh Nội dung nghiên c? ?u luận án - Nghiên c? ?u số biến đổi di truyền bệnh u. .. đổi di truyền mối liên quan với y? ?u tố tiên lượng, định hướng đi? ?u trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh? ?? tiến hành với mục ti? ?u sau: Phát số biến đổi di truyền bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào. .. 1.3.5 U nguyên bào thần kinh di truyền .39 1.3.6 Mô hình biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần kinh 40 1.4 Các kỹ thuật di truyền sử dụng để phát biến đổi di truyền bệnh u nguyên bào thần