Thông tin tài liệu
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ MINH TUẤN MỘT SỐ YẾU TỐ ĐÁNH GIÁ TIÊN LƯỢNG ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN VIRUS C CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ========= LÊ MINH TUẤN MỘT SỐ YẾU TỐ ĐÁNH GIÁ TIÊN LƯỢNG ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN VIRUS C Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Ngọc Ánh Cho đề tài: “Nghiên cứu vai trò kiểu gen IL28B số yếu tố tiên lượng điều trị viêm gan virus C mạn tính theo phác đồ chuẩn ” Chuyên ngành : Nội tiêu hóa Mã số : 62720143 CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Đặc điểm gen IL28B 2.Các phương pháp sinh học phân tử để xác định đa hình thái đơn KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm virus viêm gan siêu vi C mạn tính (HCV) nguyên nhân gây ung thư gan ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), chiếm tỷ lệ 3% Tổ chức Y tế giới ước tính có khoảng 180 triệu người 350.000 người tử vong năm bệnh gan liên quan đến viêm gan C [1], [2] Theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới, HCV tìm thấy tồn giới với số quốc gia có tỷ lệ nhiễm virus cao tới 5% cao Ở Ấn Độ có 12,5 triệu người bị nhiễm HCV [2] Virus viêm gan C lây lan chủ yếu qua tiếp xúc với máu chế phẩm máu, liên quan đến việc sử dụng ma túy tĩnh mạch, thiết bị y tế tiệt trùng truyền máu không cách [3] Vi-rút viêm gan C vi rút nhỏ (55–65 nm), bao bọc, chuỗi RNA thuộc họ Flaviviridae Bộ gen bao gồm khung đọc mở có chiều dài 9600 nucleotide Khung đọc mở dịch để tạo polyprotein đơn, sau xử lý tiếp để tạo 10 protein chức Trên sở tính không đồng di truyền, virus viêm gan C phân loại thành kiểu gen phân số phụ chia thành nhiều phân nhóm kiểu gen [4] Mơ hình phân bố kiểu gen HCV bệnh nhân viêm gan mãn tính cho thấy Ấn Độ; genotype chủng chủ yếu theo sau genotype [5], [6] Nghiên cứu cho thấy genotype 1; genotype b có khả phát triển kháng thuốc virus có tỷ lệ điều trị cao HCV genotype a [7] Các nghiên cứu cho thấy bệnh nhân có genotype 1b có nhiều khả phát triển bệnh nghiêm trọng bệnh viêm gan C mãn tính so với kiểu gen khác [7] Ngoài ra, nghiên cứu quan sát thấy bệnh nhân bị nhiễm kiểu gen có xu hướng tiến triển ung thư biểu mô tế bào gan cao so với kiểu gen khác [7] Tuy nhiên, số nghiên cứu báo cáo rằng, nhiễm HCV genotype có liên quan đến tiến triển xơ hóa nhanh mức độ cao tăng áp lực tĩnh mạch cửa[8] Nhưng nay, tỷ lệ mắc HCC tăng lên bệnh nhân xơ gan bị nhiễm kiểu gen chưa ghi nhận Liệu pháp tiêu chuẩn cho viêm gan C mãn tính (CHC) bao gồm interferon pegylated (Peg-IFN) ribavirin, báo cáo thuốc không dung nạp tốt [9] Điều trị tiêu chuẩn nhiễm virus viêm gan C mạn tính (HCV) interferon pegylated (PEG-IFN) kết hợp với ribavirin Hầu hết bệnh nhân điều trị PEG-IFN đạt đáp ứng virus kéo dài (SVR) Tuy nhiên, yếu tố di truyền vật chủ đóng vai trị quan trọng việc đạt đáp ứng virus điều trị nhiễm HCV đối bệnh nhân Trong nghiên cứu đa hình IL28B (rs8099917 rs12979860) phân tích mối liên quan chúng với đáp ứng virus với điều trị PEG-IFN alpha xác định Nghiên cứu đa hình thái đơn (SNPs) liên quan đến điều trị HCV mạn tính: IL-28 phát vào năm 2002 Zymogenetics sử dụng q trình sàng lọc di truyền tồn hệ gen người phân tích giải mã Khi gen tìm thấy, người ta tiến hành quét lần thứ hai để tìm kiếm loại cytokine Cả hai IL-28 IL-29 tìm thấy người sử dụng kiểu phân tích IL-28 đặt gần IL-29 nhiễm sắc thể 19 người Hai đồng dạng IL-28 (IL-28A IL-28B) tương đồng tới 96% Sự khác biệt chức hai loại chưa biết rõ Một đa hình đơn nucleotide (SNP) gần gen IL28B có khả dự đốn đáp ứng điều trị viêm gan C interferon ribavirin SNP xác định liên quan đến điều trị HCV mạn tính gồm SNP rs8099917 rs12979860 3 Đặc điểm gen IL28B Vị trí gen NST Chiều dài kb Gồm exon Mã hoá phân tử mRNA dài Protein IL28B có chức 2.Các phương pháp sinh học phân tử để xác định đa hình thái đơn - Kỹ thuật PCR Nguyên tắc phản ứng PCR dựa vào hoạt tính DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu bốn loại nucleotid Phản ứng địi hỏi có mặt mồi xi mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu trình tự DNA khn Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba bước sau: - Bước 1: giai đoạn biến tính (denaturation) Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm (nhiệt độ nóng chảy) phân tử, thường 94oC - 95oC vòng 30 giây - phút - Bước 2: giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn, dao động khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây - phút - Bước 3: giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC DNA polymerase polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác trình tổng hợp tốt Thời gian phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút 4 Sau chu kỳ chuỗi đôi DNA tạo thành tiếp tục dùng để làm phân tử DNA để tổng hợp DNA chu kỳ Sản phẩm cuối phản ứng PCR đoạn DNA chuỗi đơi có chiều dài khoảng cách hai đoạn gen mồi, hai đầu tận sản phẩm xác định đầu tận 5’ hai đoạn gen mồi - Kỹ thuật PCR-RFLPKỹ thuật PCR-RFLP dựa sở kỹ thuật PCR cổ điển Sau kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR đặc hiệu tinh xử lý với enzyme cắt giới hạn lựa chọn nhằm tạo phân đoạn DNA nhỏ Sau điện di gel agarose polyacylamide, số lượng chiều dài đoạn DNA giúp phát trường hợp đột biến - Kỹ thuật giải trình tự gen Đoạn DNA cần giải trình tự sử dụng trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) vị trí gắn mồi Hỗn hợp deoxy- dideoxynucleotid sử dụng phản ứng với nồng độ cho dideoxynucleotid gắn vào vị trí mà deoxynucleotid thường gắn đoạn DNA tổng hợp Sự gắn dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn trình kéo dài đoạn DNA tổng hợp, kết tạo hỗn hợp sợi DNA có kích thước khác Nucleotid tận sợi DNA xác định cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt phản ứng chứa loại dideoxynucleotid(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) phản ứng hỗn hợp loại dideoxynucleotid đánh dấu chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác Kết hỗn hợp sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn phân tách điện di gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt sợi đơn DNA nucleotid Trình tự nucleotide xác định tương ứng với trình tự vạch gel ứng với loại dideoxynucleotid Sau đó, trình tự gen mẫu nghiên cứu đối chiếu với trình tự gen ngân hàng gen giới (GenBank) phân tích để xác định vùng điểm đột biến Các nghiên cứu đa hình SNP rs8099917 rs12979860 Vai trò kiểu gen IL28B rs12979860, rs8099917 việc đạt đáp ứng điều trị viêm gan virus C mạn Interferon Ribavirin nghiên cứu ghi nhận thời gian gần Các đa hình di truyền gần gen interleukin 28B có liên quan đến đáp ứng điều trị virus viêm gan C (HCV) vai trị đa hình đơn interleukin 28B (rs12979860, rs8099917) quần thể nhiễm HCV genotype nghiên cứu đánh giá 400 bệnh nhân huyết seromeactive viêm gan C từ nhóm dân số khác Đông Đông Bắc Ấn Độ đánh giá để phân tích kiểu gen bệnh nhân 83 bệnh nhân nhiễm HCV genotype điều trị interferon-ribavirin pegylated Việc xác định kiểu gen virut thực cách sử dụng kỹ thuật mã ngược transcriptase-PCR đảo ngược theo sau phương pháp giải trình tự gen Xác định kiểu gen interleukin 28B thực cách sử dụng phân tích đa hình đơn nucleotide sử dụng kỹ thuật PCR-realtime Bệnh nhân kiểu gen CC rs12979860 có liên quan đáng kể với đáp ứng virus bền vững quần thể nhiễm HCV genotype Ở bệnh nhân đạt đáp ứng virus nhanh alen thuận lợi CC / TT tìm thấy rs12979860, rs8099917 chiếm ưu thế, tỷ lệ hai alen tương ứng 77%, 73,2%; bệnh nhân HCV tái phát, alen CT, TG tìm thấy chiếm ưu Ngoài ra, kiểu gen CC rs12979860 tìm thấy có liên quan đến đáp ứng virus kéo dài bệnh nhân có tải lượng virus cao (OR = 6,75, 0,05
Ngày đăng: 28/10/2020, 08:07
Xem thêm:
