ĐẶC điểm DỊCH tễ học lâm SÀNG và GIÁ TRỊ của PCR đa mồi TRONG CHẨN đoán VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG có NHIỄM HAEMOPHILUS INFLUENZAE ở TRẺ EM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -* - NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC LÂM SÀNG VÀ GIÁ TRỊ CỦA PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG CÓ NHIỄM HAEMOPHILUS INFLUENZAE Ở TRẺ EM Chuyên ngành : Nhi khoa Mã số : LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II NGƯỜI HƯỚNG DẪN: GS.TS Lê Thanh Hải Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè, quan gia đình Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: GS TS Lê Thanh Hải, Giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương, Phó Trưởng Bộ mơn Nhi Trường Đại học Y Hà Nội Thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình học tập cho tơi nhiều ý kiến q báu tồn q trình thực để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn trân trọng tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Y Hà Nội; Ban Giám đốc, Trung tâm hô hấp, Trung tâm Quốc tế S, khoa Nghiên cứu Sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm, Khoa vi sinh phòng ban Bệnh viện Bệnh Nhi Trung ương; thầy cô Bộ môn Nhi Trường Đại học Y Hà Nội, tạo điều kiện cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu Với tất lịng kính trọng, xin cảm ơn Thầy Cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đóng góp ý kiến q báu để tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp động viên, cổ vũ, giúp đỡ tơi nhiều q trình học tập Tơi xin dành tất tình cảm u q biết ơn tới người thân gia đình tơi, người hết lịng tơi sống học tập Hà Nội , Ngày 10 tháng năm 2020 Nguyễn Thị Thu Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Thu Hằng, học viên lớp Chuyên khoa II khóa 32, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Nhi khoa, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Lê Thanh Hải Công trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2020 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Thu Hằng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BC: BCLP: BCTT: ELISA: Bạch cầu Bạch cầu lympho Bạch cầu trung tính Enzyme Linked Immunosorbent Assay Hb: IgA: IgG: IgM: NKQ: PCR: (Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Enzym) Hemoglobin (Huyết sắc tố) Immunoglobulin A Immunoglobulin G Immunoglobulin M Nội khí quản Polymerase Chain Reaction (Kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen) Ct: RLLN: SHH: SLBC: SLHC: UNICEF: Chu kỳ ngưỡng ( cycle threshold) Rút lõm lồng ngực Suy hô hấp Số lượng bạch cầu Số lượng hồng cầu The United Nations Children's Fund VP: WHO: HI: (Quỹ Nhi đồng Liên hiệp quốc) Viêm phổi World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) Haemophilus influenza VPMPTCĐ: Viêm phổi mắc phải cộng đồng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐỊNH NGHĨA: 3 1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA VIÊM PHỔI 1.2.1 Các đường vào phổi vi sinh vật 3 1.2.2 Cơ chế bảo vệ máy hô hấp 1.2.3 Bệnh sinh 1.3 DỊCH TỄ VIÊM PHỔI TRẺ EM 1.4 CĂN NGUYÊN VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE GÂY VIÊM PHỔI TRẺ EM 1.4.1 Đặc điểm vi sinh vật học: 1.4.2 Khả gây bệnh người: 1.4.3 Chẩn đốn vi khuẩn học: 1.4.4 Phịng bệnh điều trị: 1.5 CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG Ở TRẺ EM 1.6 TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG 1.6.1 Giai đoạn khởi phát 10 1.6.2 Giai đoạn toàn phát 10 10 1.7 TRIỆU CHỨNG CẬN LÂM SÀNG 11 1.8 REAL-TIME PCR ĐA MỒI 12 1.9 CÁC NGHIÊN CỨU HIỆN NAY LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 14 1.9.1 Nghiên cứu nước: 14 1.9.2 Nghiên cứu giới: 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: 16 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 18 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 18 2.1.5 Thời gian nghiên cứu 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 18 18 16 2.2.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu nghiên cứu 18 2.2.3 Quy trình nghiên cứu 19 2.2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 2.2.5 Các số nghiên cứu tiêu chuẩn đánh giá số nghiên cứu 21 2.3 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 28 2.4 TỔ CHỨC THỰC HIỆN 28 2.4.1 Kỹ thuật thu thập thông tin 28 2.4.2 Khống chế sai số 28 2.4.3 Đạo đức nghiên cứu Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 30 3.1 Các thông tin chung đối tượng nghiên cứu 3.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng CAP 30 31 3.3 Căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi cộng đồng kỹ thuật real – time PCR đa mồi 34 Chương BÀN LUẬN 37 4.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhi VPMPTCĐ 37 4.2 Giá trị kỹ thuật real-time PCR đa mồi chẩn đoán VPMPTCĐ nhiễm H Influenzae KẾT LUẬN 40 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 30 Bảng 3.2 Phân bố tuổi bệnh nhân nghiên cứu 30 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân theo tuổi thai sinh 30 Bảng 3.4 Phân bố bệnh nhân theo cách sinh 31 Bảng 3.5 Phân bố bệnh nhân theo cân nặng sinh 31 Bảng 3.6 Đặc điểm lý vào viện bệnh nhân Bảng 3.7 Đặc điểm điều trị trước đến viện bệnh nhân Bảng 3.8 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng nhập viện 31 32 32 Bảng 3.9 Đặc điểm triệu chứng thực thể phổi theo nhóm nghiên cứu 32 Bảng 3.10 Đặc điểm triệu chứng ngồi phổi theo nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.12 Đặc điểm biến đổi huyết học theo nhóm nghiên cứu34 Bảng 3.13 Tỷ lệ dương tính với loại vi khuẩn kỹ thuật real-time PCR đa mồi 34 Bảng 3.14 Kết nuôi cấy dịch tỵ hầu 35 Bảng 3.15 Giá trị Ct xét nghiệm PCR đa mồi 35 Bảng 3.16 Phân tích đa biến mối liên quan cấy dịch tỵ hầu số đặc điểm bệnh nhân 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi (VP) bệnh phổ biến trẻ em với tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao đặc biệt trẻ tuổi Hàng năm tồn giới có khoảng triệu trẻ em tử vong VP Căn nguyên gây VP trẻ em vi rút, vi khuẩn vi sinh vật khác Việc phát sớm nguyên gây viêm phổi cộng đồng (VPCĐ) cần thiết để sử dụng kháng sinh phù hợp Điều giúp cải thiện tình trạng sử dụng kháng sinh khơng hạn chế gia tăng đề kháng kháng sinh vi khuẩn cộng đồng Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu nước Haemophilus Influenzae Streptocucus Pneumonia hai nguyên phổ biến gây VPCĐ trẻ em Các phương pháp phát nguyên gây bệnh dùng phổ biến nuôi cấy Realtime PCR Kỹ thuật nuôi cấy coi tiêu chuẩn vàng xác định vi khuẩn gây bệnh đòi hỏi thời gian thường từ 3-5 ngày tìm thấy 20-30% nguyên gây bệnh Trong đó, kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy độ đặc hiệu cao hơn, đồng thời có giá trị sàng lọc sớm rút ngắn thời gian phát nguyên gây viêm phổi Tuy nhiên, kĩ thuật PCR định tính, chưa nêu ngưỡng phát Haemophilus influenzae, để định hướng cho bác sỹ lâm sàng điều trị sớm trước có kết cấy vi khuẩn Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu: "Đặc điểm dịch tễ học lâm sàng giá trị PCR đa mồi chẩn đoán Viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em'' nhằm mục tiêu: - Mô tả số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương - Nhận xét giá trị Real-time PCR đa mồi chẩn đốn viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐỊNH NGHĨA: Viêm phổi tình trạng tổn thương viêm nhu mô phổi bao gồm viêm phế nang, túi phế nang, tổ chức liên kết kẽ viêm tiểu phế quản tận Viêm phổi lan toả hai bên phổi tập trung thuỳ phổi Viêm phổi cộng đồng định nghĩa viêm phổi mắc phải bệnh nhân sống bệnh viện khơng sử dụng phương tiện chăm sóc dài ngày Theo hướng dẫn y tế viêm phổi cộng đồng viêm phổi cộng đồng 48 nằm viện Viêm phổi bệnh viện: viêm phổi xuất sau 48 kể từ nhập viện mà trước khơng có triệu chứng hơ hấp hay nhiễm trùng khơng có tổn thương hay tiến triển X quang ngực trước 48 nhập viện 3,4 1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA VIÊM PHỔI 1.2.1 Các đường vào phổi vi sinh vật  Đường hơ hấp : Do hít phải mơi trường khơng khí: từ hạt nước bọt (chứa vi sinh vật) người mang mầm bệnh hắt hơi, ho từ hạt bụi có chứa vi khuẩn Do hít phải vi khuẩn từ ổ nhiễm đường hô hấp trên: viêm nhiễm vùng tai mũi họng, viêm lợi, viêm xoang…  Đường máu: vi sinh vật theo đường máu từ ổ nhiễm trùng ban đầu tới phổi  Đường cận phổi: abcès tạng lân cận gan, da vùng thành ngực 1.2.2 Cơ chế bảo vệ máy hô hấp - Cơ chế học: 12 Lê Huy Chính Bài giảng vi sinh Nhà xuất y học; 2007 13 S Flasche, Takahashi Early indication for a reduced burden of radiologically corfimed pneumonia in children following the introduction of routine vaccination against Haemophilus influenzae type b in Nha Trang, VietNam Vaccine 2014;32(51) 14 W.J Chen, Moulton, L.H., Saha, S.K Estimation of the herd protection of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine against radiologically confirmed pneumonia in children under years old in Dhaka, Bangladesh Vaccine 2014;32(8):944-948 15 Fuchs S.C Victora C.G Risk factors for Pneumonia Among Children in a Brazilian Metropolitan Area Pediatrics 1994;93:977-985 16 Mathews KH Jackson S, Pulanic D Rick factors for severe acute lower respiratory tract infections in children: a systematic review and metaanalysis Croat Med J 2013;54:110-121 17 Phạm Hùng Vân PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học; 2009 18 Phạm Hùng Vân Tác nhân vi sinh vật gây viêm phổi cộng đồng phải nhập viện 2017 19 Đào Thị Mỹ Hà Viêm phổi cộng đồng viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế tác nhân vi sinh vật phát real – time PCR đờm Chuyên đề hội hơ hấp Thành phố Thành phố Hồ Chí Minh 2019 20 Tạ Thị Diệu Ngân Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng nguyên viêm phổi mắc phải cộng đồng, Luận án tiến sỹ Đại học y Hà Nội; 2016 21 Phùng Thị Bich Thủy Ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán nguyên gây nhiễm trùng huyết trẻ em bệnh viện Nhi trung ương Tạp chí y học thực hành 2015:23-32 22 Oliver GO et al Quantitative Detection of Streptococcus pneumoniae in Nasopharyngeal Secretions by Real-Time PCR J Clin Microbiol 2001;39(9):3129–3134 23 Jae Kyoung K Joowon P Evaluation of Seeplex Pneumobacter Multiplex PCR Kit for the Detection of Respiratory Bacterial Pathgens in Pediatric Patients Korean J Lab Med 2009;29 24 Mary PES A review of the role of Haemophilus influenza in community-acquired pneumonia Pneumonia 2015;29:26-43 25 WHO Revised WHO classification and treatment of childhood pneumonia at health facilities 2013 26 Nguyễn Thị Ngọc Điệp Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng viêm phổi vi khuẩn tính nhạy cảm với kháng sinh số loại vi khuẩn gây viêm phổi trẻ em từ tháng đến tuổi khoa Nhi Bệnh v iện Việt Nam – Thụy Điển ng Bí In: Hội nghị khoa học Nhi khoa toàn quốc 2018.; 2018 27 Alan E Gross, Trevor C Van Schooneveld, Keith M Olsen, et al Epidemiology and Predictors of Multidrug-Resistant CommunityAcquired and Health Care-Associated Pneumonia Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2014;58(9):5262 28 Nguyễn Thành Nhôm Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng yếu tố liên quan đến viêm phổi nặng trẻ em từ tháng đến tuổi Bệnh viện Đa khoa tỉnh Vĩnh Long, In: Kỷ yếu đề tài NCKH Bệnh viên Đa khoa Vĩnh Long; 2015 29 Tie-Gang Zhang, Ai-Hua Li, Min Lyu, Meng Chen, Fang Huang, Jiang Wu Detection of respiratory viral and bacterial pathogens causing pediatric community-acquired pneumonia in Beijing using real-time PCR Chronic Diseases and Translational Medicine 2015;1(2):110-116 30 Tạ Thị Diệu Ngân Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng nguyên viêm phổi mắc phải cộng đồng In: Luận án tiến sỹ Đại học y Hà Nội; 2016 31 Vũ Mạnh Linh, Phan Thu Phương Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng Việt Nam Tạp chí Y học dự phịng.4:164 32 Nguyễn Thanh Hồi Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng vi khuẩn học viêm phổi cộng đồng vi khuẩn hiếu khí điều trị khoa Hô hấp, Bệnh viện Bạch Mai Đại học Y Hà Nội 33 Jong G.M General principles and diagnostic approach In W.B Saunders company.2000:915- 928 34 D R Murdoch Nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pneumonia In Vol 36: Clin Infect Dis; 2003 35 Wen C Chiang, Oon H Teoh, Chia Y Chong, Anne Goh, Jenny P L Tang, Oh M Chay Epidemiology, clinical characteristics and antimicrobial resistance patterns of community-acquired pneumonia in 1702 hospitalized children in Singapore Respirology 2007;12(2):254-261 36 Đỗ Thị Thanh Xuân Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng điều trị viêm phổi vi khuẩn kháng kháng sinh trẻ em, Đại học Y Hà Nội; 2000 37 Guma M K Abdeldaim, Kristoffer Strålin, Jens Korsgaard, Jonas Blomberg, Christina Welinder-Olsson, Björn Herrmann Multiplex quantitative PCR for detection of lower respiratory tract infection and meningitis caused by Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and 2010;10(1):310 Neisseria meningitidis BMC Microbiology 38 Miyuki Morozumi, Eiichi Nakayama, Satoshi Iwata, et al Simultaneous Detection of Pathogens in Clinical Samples from Patients with Community-Acquired Pneumonia by Real-Time PCR with Pathogen-Specific Molecular Beacon Probes Journal of Clinical Microbiology 2006;44(4):1440 39 Guma M K Abdeldaim, Kristoffer Strålin, Leif A Kirsebom, Per Olcén, Jonas Blomberg, Björn Herrmann Detection of Haemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patients by quantitative real-time polymerase chain reaction Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2009;64(4):366-373 40 K Strålin, J Korsgaard, P Olcén Evaluation of a multiplex PCR for bacterial pathogens applied to bronchoalveolar lavage European Respiratory Journal 2006;28(3):568 PHỤ LỤC 1: MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu giá trị PCR đa mồi chẩn đoán VPCĐ HI Mã số nghiên cứu: …………… Năm……… Số thứ tự:… … I Hành chính: Họ tên bệnh nhân: ………………………………………………… Ngày sinh … /……/…… Nam [ ] Ngày vào viện: … /……/…… Ra viện vì: Khỏi [ ] Đỡ: Nữ [ ] Ngày viện: … /……/…… [ ] Tử vong [ ] Xin [ ] Mã số bệnh án: ………………………………………………………… Địa ………………………………………………………………… Nông thôn [ ] Thành Thị [ ] Miền Núi [ ] Số điện thoại liên lạc: ………………………………………… Họ tên bố:…………… Nghề nghiệp……… TĐVH:… Tuổi: K rõ: [ ] Họ tên mẹ: …………… Nghề nghiệp:………TĐVH:… Tuổi:…K rõ: [ ] II Tiền sử sản khoa: Con thứ: …… Tuổi thai sinh: Đủ tháng [ ] Thiếu tháng [ ] ……Tuần Già tháng [ ] ……Tuần [ ] Đẻ huy Cách sinh: Đẻ thường [ ] Mổ đẻ [ ] Cân nặng sinh: …… g III Tiền sử nuôi dưỡng: Bú mẹ: Sữa mẹ [ ] Nơi nuôi dưỡng: Hỗn hợp Trại trẻ [ ] Bệnh viện IV Tiền sử bệnh trước đến viện Bị bệnh ngày thứ:…… Lí khám bệnh: [ ] Nhà trẻ [ ] Nuôi [ ] [ ] nhà [ ] Sốt [ ] Ho [ ] Suy hơ hấp [ ] Khị khè [ ] Khác [ ] Điều trị trước đến viện a.Kháng sinh Có [ ] Khơng [ ] Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày b.Cocticoit Có [ ] Khơng [ ] Thời gian: ………ngày c Thuốc khác:……………………………………………………………… d.Tiền sử dị ứng thuốc: Có [ ] Khơng [ ] e Nếu có loại gì:………………………………………………………… Tiền sử NKHHC: …….lần V Triệu chứng lâm sàng lúc nhập viện: 5.1 Toàn trạng: a Chiều cao: …….cm b Cân nặng: …… kg c Nhiệt độ: ,…0C d Mạch: …… lần/phút e SpO2: …… % f F thở: … lần/phút 5.2.Triệu chứng Có Không Sốt Chảy mũi Ho [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Khó thở Bú Tiêu chảy Ban da Bỏ bú Không uống Kích thích quấy khóc Co giật Rút lõm lồng ngực Tím tái Thở rên [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] 5.3.Triệu chứng phổi: 5.3.1 Ran phổi: Có [ ] Vị trí: Phải [ ] Trái Loại ran: Rít [ ] Có [ ] 5.3.2.Khị khè: [ ] Ẩm [ ] Không[ ]  5.3.2 Hai bên [ ] Ngáy [ ] Nổ [ ] Không[ ]  5.3.3 Vị trí: Phải [ ] Trái [ ] 5.3.3.Hội chứng đơng đặc phổi Có 5.3.4.Hội chứng tràn dịch màng phổi Có Hai bên [ ] [ ] Không[ ]  5.3.4 [ ] Không[ ]  5.3.5 5.3.5.Triệu chứng khác phổi:……………………………………………………… 5.4.Cơ quan khác Tim mạch B.thường [ ] Không BT [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Tiêu hoá Miệng họng Triệu chứng Tim Bẩm Sinh [ ] Gan to [ ] Lách to [ ] Nấm miệng [ ] Khe hở hàm [ ] Da [ ] Cơ, xương Thần kinh [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Hạch [ ] [ ] Các quan khác [ ] [ ] VI Triệu chứng cận lâm sàng lúc nhập viện: Da xanh [ ] Da vàng [ ] Xuất huyết da [ ] ………………………… Não bé [ ] Dị tật não khác [ ] Hạch to [ ] ………………………… 6.1.Huyết học: Bạch cầu:…………/mm3 Tiểu cầu: …… 103/mm3 TT………… % LP ……% MN……… % EO… % Hb: ……… … g/dl 6.2 Pcr đa mồi loại vi khuẩn: CRP:………… mg/l - Hi: - Phế cầu: - Mycoplasma: - Chlamedia.pneumonia: - Ho gà: - Legenela: Chỉ số CT: 6.3 Cấy dịch tỵ hầu: Âm Tính [ ] Dương tính [ ] Khơng làm [ ] Loại vi khuẩn gì:………………(1 E.coli, K Pneu, C.albican, P aeruginose, Streptococus group F, Enterobater, H Influenza, S.pneumonia, 9.Stenotrophomonas Ma, 10 P aeruginose, 11 Burkholderia cepacia ; 12 Khác…………………………… Nồng độ vi khuẩn: 6.5 XQ lồng ngực: Có [ ] Khơng[ ] Tổn thương phổi kẽ Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Đơng đặc phế nang Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Khơng [ ] Hình ảnh kính mờ Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tổn thương dạng nốt Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tràn dịch màng phổi Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tổn thương đám mờ vùng rốn phổi: Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Khơng [ ] Khác:…………………… Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] VII Theo dõi triệu chứng trình điều trị: 7.1.Thời gian nằm viện: ……… ngày Nằm hồi sức: Có: [ ] Khơng [ ] 7.2 Thở oxy: Số ngày nằm:…………………… Có: [ ] Khơng [ ] 7.3 Thời gian điều trị khỏi bệnh:…….ngày 7.4 Các tác dụng phụ hay gặp:…………………………………………………… IX Hình ảnh X quang trình điều trị 9.1 Hình ảnh X quang sau điều trị ngày Nặng lên [ ] Đỡ [ ] Không thay đổi [ ] Hết tổn thương [ ] 9.3 Hình ảnh X quang sau điều trị 10 ngày Nặng lên [ ] Đỡ [ ] Không thay đổi [ ] Hết tổn thương [ ] X: Liệu trình điều trị: 10.1 Kháng sinh: Có [ ] Không [ ] Số loại kháng sinh:…… loại Loại 1:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… Loại 2:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… Loại 3:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… ( 1.Cefuroxim 750mg, 2.Cefotaxim 1g, 3.Ceftriaxon1g 4.Cefoferazone + Sulbactam 1g, 5.Immipennem 500mg 6.Ceftazidim 1g, 7.Cefepim1g, 8.Meropenem 500mg 9.Piperacilline 4, g 10.Loại khác…………………………………… ) 10.2 Tăng miễn dịch: Có [ ] 10.3 Liệu pháp oxy Có [ ] Khơng [ ] Khơng [ ] Tổng thời gian sử dụng Oxy: …… ngày 10.4 Kết điều trị: Đỡ [ ] Tử vong [ ] Khỏi [ ] Xin [ ] Ngày….tháng… năm 20… Bác sĩ Nguyễn Thị Thu Hằng PHỤ LỤC 2: QQuy trình xét nghiệm real time PCR u Đây xét nghiệm Realtime PCR đa mồi cho phép khuyếch đại phát đồng thời axit nucleic mục tiêu vi khuẩn Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP), Bordetella pertussis (BP), Bordetella parapertussis (BPP), Streptococcus pneumoniae (SP), Haemophilus influenzae (HI) mẫu bệnh phẩm đường hô hấp bệnh nhân Trang thiết bị vật liệu  Găng tay SHPT không bột tan (latex or nitrile)  Pipet hút tự động thể tích 10ul, 20ul, 100 ul, 200 ul  Pipet nhựa vô trùng dùng lần ml  Ống ly tâm vô trùng 1.5 mL  Hệ thống tách chiết Magna Pure LC 2.0 hóa chất, vật tư tiêu hao kèm  Máy ly tâm nhanh (Spin)  Máy Vortex mixer  Hệ thống Real-time PCR CFX96TM (Bio-Rad)  Strips chạy Realtime PCR ống 0.2 mL (màu trắng đục, Bio-Rad)  Nắp Strips chạy Realtime PCR ống 0.2 mL (Bio-Rad)  Plate chạy Realtime PCR (Bio-Rad)  Tủ an tồn sinh học cấp II Quy trình thực 2.1Thu thập, lưu trữ vận chuyển mẫu Thu thập mẫu Sử dụng bệnh phẩm dịch tỵ hầu nội khí quản, lấy vào ống vơ trùng falcon 15ml Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm chuyển tới khoa xét nghiệm sớm hành chính, bảo quản tủ 4ºC khoa lâm sàng chờ chuyển tới khoa xét nghiệm Thời gian chờ khơng q 48 Quy trình tách chiết mẫu bệnh phẩm Tiền xử lý mẫu bệnh phẩm Lưu ý: Quá trình xử lý mẫu phải thực tủ an toàn sinh học tránh tượng lây nhiễm chéo đảm bảo an toàn cho môi trường cán xử lý mẫu - Các mẫu cấp mã, đánh số lưu vào ống ly tâm vô trùng 1,5 ml 3.2.2 Quy trình tách chiết bệnh phẩm hệ thống tách chiết tự động tự động MagNA Pure 2.0 (Roche) Hệ thống trang bị cánh tay robot xử lý 32 mẫu bệnh phẩm khác lần chạy Hệ thống tách chiết dựa công nghệ bi từ kết hợp với sử dụng hóa chất tinh cao đảm bảo việc tách chiết cho vật chất di truyền đạt chất lượng cao đồng kết Thời gian hoàn tất lần chạy máy 32 mẫu khoảng 90 phút Các bước thực quy trình Chuẩn bị - Chuẩn bị hóa chất Proteinase K theo hướng dẫn: thêm 4ml Proteinase K vào Incubation buffer II vào lọ Proteinase K hòa tan Thêm tiếp 2,7 ml Prpotein K trộn Lưu giữ 2-8 C tháng, -15 đến -25 C năm - Dung dịch MGP (bi từ) kit lưu trữ nhiệt độ phòng Cần Vortex kỹ trước sử dụng - Hút 10 ul IC vào giếng khay mẫu Sau hút vào giếng 200 ul mẫu cần tách Hướng dẫn tách chiết - Thực theo hướng dẫn vận hành máy tách chiết Magna Pure LC 2.0 - Vệ sinh máy: dùng giấy không bụi thấm cồn 70% lau khu vực bên máy - Mở nguồn máy MP:C - Đăng nhập vào phần mềm - Thực việc bảo trì: bơi trơn đầu pipette - Ở hình Overview, click Ordering bên tay trái - Đặt tên mẫu chạy bảng thông tin - Click vào Purification Protocol để chọn Protocol - Chọn thể tích mục Sample Volume Elution Volume - Click vào biểu tượng Next - Theo thông tin hình “Workplace: Stage Setup” load vật dụng hóa chất cần thiết theo yêu cầu máy - Sau xác nhận cung cấp đủ vật dụng cần thiết - Click START để chạy máy - Sau chạy xong: lấy khay sản phẩm đồng thời bỏ vật dụng khác - Vệ sinh máy giấy thấm cồn 70% - Chiếu đèn UV - Hút sản phẩm tách chiết khay chuyển ống 0.5ml để lưu sản phẩm tách chiết Trên ống ghi mã nghiên cứu tương ứng với mã ghi ống lưu bệnh phẩm Chuẩn bị phản ứng Realtime PCR 2.3.1 Chuẩn bị hóa chất nhỏ mẫu Việc trộn hóa chất chạy PCR cần phải thực tủ trộn hóa chất phịng riêng biệt với phịng tách chiết DNA/RNA Không sử dụng lẫn thiết bị phòng Ghi nhãn lên ống eppendord 1.5ml Trên ống ghi rõ loại hỗn hợp phản ứng cần trộn, ngày thực hiện, người thực Tính tốn số lượng phản ứng cần chuẩn bị = Số mẫu + (01 chứng âm, 01 chứng dương) + N N = số mẫu 20 N = số mẫu từ 20 trở lên Tính tốn lượng hóa chất cần pha theo cơng thức sau: STT Tên hóa chất 5X RP4 MOM EM2 RNase-free Water Tổng thể tích Thể tích ul ul ul 17 ul Lưu ý Mỗi hỗn hợp phản ứng chạy kèm với chứng âm chứng dương Vị trí mẫu đặt trước, sau đến chứng âm, chứng dương đặt sau Trình tự nhỏ hỗn hợp phản ứng mẫu vào ống phản ứng: Hỗn hợp phản ứng nhỏ vào ống trước theo sơ đồ chạy mẫu Vị trí nhỏ mẫu tương ứng với vị trí nhỏ hỗn hợp phản ứng Mẫu nhỏ trước, sau đến chứng âm, chứng dương nhỏ sau để tránh nhiễm cho mẫu Ví dụ: Sơ đồ nhỏ hỗn hợp phản ứng A Mẫu 10 11 12 S1 NC PC B C D E F G H Sau thêm vào tất thành phần phản ứng, dùng pipet trộn hỗn hợp phản ứng cách hút lên hút xuống sau ly tâm nhanh ống hỗn hợp phản ứng Chia 17 microlit hỗn hợp phản ứng vào giếng chạy Strip phản ứng RT-PCR 0.2 ml (Bio-rad) Chuyển ống chứa hỗn hợp phản ứng sang phòng nhỏ mẫu (phòng tách chiết) Hút microlit mẫu tách DNA/RNA, mẫu chứng âm, mẫu chứng dương vào ống phản ứng tương ứng Thay đầu côn nhỏ mẫu Vị trí ống phản ứng giống với sơ đồ chạy mẫu Ví dụ: Mẫu nhỏ theo sơ đồ Mẫu S1 nhỏ trước vào giếng A1, chứng âm vào giếng B1, chứng dương vào giếng C1 2.3.2 Chạy phản ứng máy Realtime PCR CFX96TM (Bio-rad) Thiết lập chương trình chạy máy Vào hình chọn File → New→ Protocol, mở Protocol Editor thiết lập chương trình chạy sau: Bước 1: 50ºC 20 phút Bước 2: 95ºC 15 phút Bước 3: 45 chu kỳ của: 95ºC 10 giây 60ºC 01 phút (đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) 72ºC 10 giây (đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) Bước 4: Thực bước 3, thêm 44 chu kỳ Nhấp chuột vào ô Sample Volume chọn thể tích mẫu 25 ul Nhấp chuột OK để lưu Protocol mở cửa sổ Experiment Setup Phần Plate Setup, chọn Create New để mở Plate Editor Với giếng chọn kênh màu: FAM, HEX, Cal Red 610, Quasar 670 Chọn Sample Type: Unknown cho giếng cần chạy Chọn Plate size (96 wells) plate type tương ứng Bấm Start Run để chạy chương trình Cài đặt cho phân tích liệu hệ thống CFX96TM (Bio-rad) Sau chạy xong phản ứng, vào phần Quantitation để xem kết Chọn No Baseline Subtraction từ phần Analysis Mode Chọn Seegene Export từ Tools manu Chọn ổ lưu liệu bấm OK Cài đặt cho phân tích liệu phần mềm Seegene Viewer Mở chương trình Seegene Viewer, nhấp chuột vào file lưu thư mục “Quantstep4” Sau mở file kết quả, chọn tên kit chạy RP4 từ phần PRODUCT Kiểm tra kết cho giếng Đọc hiểu kết phát Phân tích Biểu đồ 1(tác nhân) huỳnh quang Chất Biểu đồ (tác nhân) FAM Streptococcus pneumoniae (SP) Legionella pneumophila (LP) HEX Haemophilus influenzae (HI) Bordetella parapertussis (BPP) Cal Red 610 Mycoplasma pneumoniae (MP) Bordetella pertussis (BP) Quasar 670 IC (Internal Control) Chlamydophila pneumoniae(CP) Các kết dương tính giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)=42 Diễn giải kết Tác nhân Biểu Biểu đồ + + + + - đồ + + + + - Nội kiểm Đọc hiểu + Dương tính với tác nhân phát - Dương tính với tác nhân phát Có thể dương tính với tác nhân vi khuẩn khác + - Âm tính Xét nghiệm bị lỗi, cần chạy lại -IC yếu âm tính chất lượng mẫu có chất ức chế -Tách lại mẫu khác -Nếu kết mẫu tách lại khơng thay đổi, tiến hành pha lỗng mẫu 1/3 đến 1/10 với PBS lặp lại xét nghiệm PhuPhucPhu ... xét giá trị Realtime PCR đa mồi chẩn đoán điều trị viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi Mô tả số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng viêm phổi có nhiễm HI trẻ. .. số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương - Nhận xét giá trị Real-time PCR đa mồi chẩn đoán viêm phổi. .. điều trị sớm trước có kết cấy vi khuẩn Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu: "Đặc điểm dịch tễ học lâm sàng giá trị PCR đa mồi chẩn đoán Viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em' '