ĐẶC điểm DỊCH tễ học lâm SÀNG và GIÁ TRỊ của PCR đa mồi TRONG CHẨN đoán VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG có NHIỄM HAEMOPHILUS INFLUENZAE ở TRẺ EM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -* - NGUYỄN THỊ THU HNG ĐặC ĐIểM DịCH Tễ HọC LÂM SàNG Và GIá TRị CủA PCR ĐA MồI TRONG CHẩN ĐOáN VIÊM PHổI CộNG Đồng Có NHIễM HAEMOPHILUS INFLUENZAE TRẻ EM CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA II HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -* - NGUYỄN TH THU HNG ĐặC ĐIểM DịCH Tễ HọC LÂM SàNG Và GIá TRị CủA PCR ĐA MồI TRONG CHẩN ĐOáN VIÊM PHổI CộNG Đồng Có NHIễM HAEMOPHILUS INFLUENZAE TRẻ EM Chuyên ngành: Nhi khoa Mã số: CK.62721610 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA II NGƯỜI HƯỚNG DẪN: GS.TS Lê Thanh Hải HÀ NỘI - 2019 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BC: BCLP: BCTT: ELISA: Bạch cầu Bạch cầu lympho Bạch cầu trung tính Enzyme Linked Immunosorbent Assay Hb: IgA: IgG: IgM: NKQ: PCR: (Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Enzym) Hemoglobin (Huyết sắc tố) Immunoglobulin A Immunoglobulin G Immunoglobulin M Nội khí quản Polymerase Chain Reaction (Kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen) RLLN: SHH: SLBC: SLHC: UNICEF: Real-time PCR Rút lõm lồng ngực Suy hô hấp Số lượng bạch cầu Số lượng hồng cầu The United Nations Children's Fund VP: WHO: (Quỹ Nhi đồng Liên hiệp quốc) Viêm phổi World Health Organization HI: (Tổ chức Y tế giới) Haemophilus influenzae VPMPTCĐ: Viêm phổi mắc phải cộng đồng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐỊNH NGHĨA: 3 1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA VIÊM PHỔI 1.2.1 Các đường vào phổi vi sinh vật 3 1.2.2 Cơ chế bảo vệ máy hô hấp 1.2.3 Bệnh sinh 1.3 DỊCH TỄ VIÊM PHỔI TRẺ EM 1.4 CĂN NGUYÊN VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE GÂY VIÊM PHỔI TRẺ EM 1.4.1 Đặc điểm vi sinh vật học: 1.4.2 Khả gây bệnh người: 1.4.3 Chẩn đốn vi khuẩn học: 1.4.4 Phòng bệnh điều trị: 1.5 CÁC YẾU TỐ NGUY CƠ VIÊM PHỔI CỘNG ĐỒNG Ở TRẺ EM 1.6 TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG 10 1.6.1 Giai đoạn khởi phát 10 1.6.2 Giai đoạn toàn phát 10 1.7 TRIỆU CHỨNG CẬN LÂM SÀNG 11 1.8 REAL-TIME PCR ĐA MỒI 12 1.9 CÁC NGHIÊN CỨU HIỆN NAY LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:15 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 18 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 18 2.1.5 Thời gian nghiên cứu 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 18 2.2.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu nghiên cứu 2.2.3 Quy trình nghiên cứu 19 18 15 2.2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 2.2.5 Các số nghiên cứu tiêu chuẩn đánh giá số nghiên cứu 21 2.3 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 28 2.4 TỔ CHỨC THỰC HIỆN 28 2.4.1 Kỹ thuật thu thập thông tin 28 2.4.2 Khống chế sai số 28 2.4.3 Đạo đức nghiên cứu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng trẻ em có nhiễm haemophilus influenzae30 3.1.1 Một số đặc điểm dịch tế Viêm phổi cộng đồng trẻ em có nhiễm Haemophilus influenza: 30 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng có nhiễm haemophilus influenzae 35 3.2 Mối liên quan giá trị phát Real-time PCR với số số lâm sàng chẩn đoán điều trị viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương 39 Chương BÀN LUẬN 41 KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi nhóm viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus influenzae 30 Bảng 3.2 Phân bố đối tượng theo nhóm bệnh nhân giới 31 Bảng 3.3 Phân bố ca bệnh đến Bệnh viện Nhi Trung ương theo khu vực 31 Bảng 3.4 Phân bố ca mắc theo đặc điểm gia đình 32 Bảng 3.5 Phân bố viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus influenzae theo đặc điểm thân 33 Bảng 3.6 Phân bố bệnh nhân theo lý đến viện nhóm nghiên cứu 35 Bảng 3.7 Phân bố bệnh nhân theo triệu chứng nhập viện 35 Bảng 3.8 Đặc điểm triệu chứng thực thể phổi theo nhóm nghiên cứu 36 Bảng 3.9 Đặc điểm triệu chứng ngồi phổi theo nhóm nghiên cứu36 Bảng 3.10 Đặc điểm hình ảnh XQ phổi theo nhóm nghiên cứu 37 Bảng 3.11 Đặc điểm biến đổi huyết học theo nhóm nghiên cứu 37 Bảng 3.12 Đặc điểm yếu tố thời gian theo nhóm nghiên cứu 38 Bảng 3.13 Đặc điểm yếu tố thời gian theo nhóm tuổi VP cộng đồng Haemophilus influenzae 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi (VP) bệnh phổ biến trẻ em với tỷ lệ mắc tỷ lệ tử vong cao đặc biệt trẻ tuổi Hàng năm toàn giới có khoảng triệu trẻ em tử vong VP [1] Căn nguyên gây VP trẻ em vi rút, vi khuẩn vi sinh vật khác Việc chẩn đốn ngun gây VP có vai trò đặc biệt quan trọng điều trị tiên lượng bệnh Trong thời gian gần đây, Bệnh viện Nhi Trung ương có nhiều bệnh nhân vào khám điều trị với bệnh cảnh Viêm phổi cộng đồng (VPCĐ) không đáp ứng với điều trị kháng sinh thông thường Do việc tìm hiểu ngun gây VPCĐ tính kháng thuốc vi khuẩn cần thiết nên tiến hành thường quy hàng năm nhằm cung cấp hiểu biết đặc điểm bệnh nói chung đưa khuyến cáo sử dụng kháng sinh ban đầu phù hợp Điều giúp cải thiện tình trạng sử dụng kháng sinh không hạn chế gia tăng tỷ lệ đề kháng kháng sinh vi khuẩn cộng đồng Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu nước Haemophilus Influenzae Streptocucus Pneumonia hai nguyên phổ biến gây VPCĐ trẻ em [2] Các phương pháp phát nguyên gây bệnh dùng phổ biến nuôi cấy Realtime PCR Kỹ thuật nuôi cấy coi tiêu chuẩn vàng xác định vi khuẩn gây bệnh nhiên kỹ thuật cần đòi hỏi thời gian thường từ 3-5 ngày kết tìm thấy 20-30% nguyên gây bệnh, phụ thuộc vào tình trạng sử dụng kháng sinh trước Trong kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao hơn, đồng thời có giá trị sàng lọc sớm rút ngắn thời gian phát nguyên gây viêm phổi Gần kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát triển đem lại hiệu sàng lọc sớm nhiều tác nhân thời gian có độ nhạy đặc hiệu cao Tuy nhiên việc xác định dựa có mặt vật chất di truyền vi khuẩn (xác định gen đặc hiệu Haemophilus Influenzae) mẫu bệnh phẩm cần phải tìm hiểu ngưỡng phát Haemophilus influenzae thích hợp kỹ thuật để hướng bác sỹ lâm sàng điều trị sớm trước có kết cấy vi khuẩn Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu: ''Đặc điểm dịch tễ học lâm sàng giá trị PCR đa mồi chẩn đốn Viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em '' nhằm mục tiêu: - Mô tả số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương -Nhận xét giá trị Real-time PCR đa mồi chẩn đốn viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi trung ương Chương TỔNG QUAN 1.1 ĐỊNH NGHĨA: Viêm phổi tình trạng tổn thương viêm nhu mô phổi bao gồm viêm phế nang, túi phế nang, tổ chức liên kết kẽ viêm tiểu phế quản tận Viêm phổi lan toả hai bên phổi tập trung thuỳ phổi Viêm phổi cộng đồng định nghĩa viêm phổi mắc phải bệnh nhân sống bệnh viện không sử dụng phương tiện chăm sóc dài ngày.Theo hướng dẫn y tế viêm phổi cộng đồng viêm phổi cộng đồng 48 nằm viện Viêm phổi bệnh viện: viêm phổi xuất sau 48 kể từ nhập viện mà trước khơng có triệu chứng hơ hấp hay nhiễm trùng khơng có tổn thương hay tiến triển X quang ngực trước 48 nhập viện[3,4,5] 1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA VIÊM PHỔI 1.2.1 Các đường vào phổi vi sinh vật  Đường hơ hấp : Do hít phải mơi trường khơng khí: từ hạt nước bọt (chứa vi sinh vật) người mang mầm bệnh hắt hơi, ho từ hạt bụi có chứa vi khuẩn Do hít phải vi khuẩn từ ổ nhiễm đường hô hấp trên: viêm nhiễm vùng tai mũi họng, viêm lợi, viêm xoang…  Đường máu: vi sinh vật theo đường máu từ ổ nhiễm trùng ban đầu tới phổi  Đường cận phổi: abcès tạng lân cận gan, da vùng thành ngực [5] 43 United Nations Children’s Fund (UNICEF) (2008).The State of the World’s Children 2008, Child survival: Where we stand, Hatteras Press, Inc B.X Tám (1999) Viêm phổi cộng đồng, Nhà xuất y học 334-383 Bài giảng Nhi khoa Nhiễm khuẩn hơ hấp cấp tính trẻ em, tr 381 Bộ Y tế (2006) Tài liệu hướng dẫn kỹ lồng ghép chăm sóc trẻ bệnh tập 1, Nhà xuất y học 5-6 Bài giảng Viêm phổi bệnh viện – Học viện quân y 103 Basbaum C M.J.W (2000) Mucus secretion and ion transport in airway, W.B Saunders company 327-348 F.W.E (2000) General features of respiratory pathology, W.B Saunders company 443-494 Nair h, Simoes EA, Rudan I et al(2013) Global and regional burden of hospital admissions for severe acute lower respiratory infection in young children in 2010: a systemic analysis Lancet 381,1380-1390 Andrade AL, Silva SA, Martilli CM et al (2004) Population–based surveillance of pediatric pneumonia: use of spatial analysis in an urban area of Central Brazil Cad Saude Publica 20,411-421 10 Rudan I, O’Brien KL, Nair H, Liu L, Theodoratou E, Qazi S, et al (2013) Epidimiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimate of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries J Glob Health, 3,10401 11 Rudan I, Pinto C.B, Biloglav Z et al (2008) Epidemiology and etiology of childhood pneumonia Bulletin of the World Health Organization, 86, pp 408-416 44 12 Woodhead M (2002) Community-acquired pneumonia in Europe: causative pathogens and resistance patterns Eur Respir J; 20: Suppl 36, 20–27 13 Nguyễn Huy Chính (2003) Bài giảng vi sinh Nhà xuất y học Trường Đại học Y Hà Nội, tr.3 14 Chen, W.J., Moulton, L.H., Saha, S.K., et al (2014) Estimation of the herd protection of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine against radiologically confirmed pneumonia in children under years old in Dhaka, Bangladesh Vaccine, 32(8), 944-948 15 Flasche, S., Takahashi, K., Vu, D T., et al (2014) Early indication for a reduced burden of radiologically corfimed pneumonia in children following the introduction of routine vaccination against Haemophilus influenzae type b in Nha Trang, VietNam Vaccine, 32(51), 6963-6970 16 Victora C.G., Fuchs S.C., Flores J.A.F et al (1994) Risk factors for Pneumonia Among Children in a Brazilian Metropolitan Area, Pediatrics, 93, pp 977-985 17 Jackson S, Mathews KH, Pulanic D, Falconer R, Rudan I, Campbell H, et al (2013) Rick factors for severe acute lower respiratory tract infections in children: a systematic review and meta-analysis Croat Med J., 54,110-121 18 Phạm Hùng Vân (2009) PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà Xuất Bản Y Học 19 Phạm Hùng Vân cộng Tác nhân vi sinh gây viêm phổi cộng đồng phải nhập viện http://pctu.edu.vn/vn/tac-nhan-vi-sinh-gay-viem-phoicong-dong-phai-nhap-vien.html 45 20 Đào Thị Mỹ Hà (2019) “ Viêm phổi cộng đồng viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế tác nhân vi sinh vật phát real – time PCR đờm” Tạp chí y học thực hành, 33-35 21 Tạ Thị Diệu Ngân Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng Luận án tiến sỹ Y học 22 Phùng Thị Bich Thủy (2015), ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán nguyên gây nhiễm trùng huyết trẻ em bệnh viện Nhi trung ương Tạp chí y học thực hành, 23-32 23.Oliver GO et al (2001) Quantitative Detection of Streptococcus pneumoniae in Nasopharyngeal Secretions by Real-Time PCR J Clin Microbiol, 39(9): 3129–3134 24.Joowon P, Jae Kyoung K et al (2009) Evaluation of Seeplex TM Pneumobacter Multiplex PCR Kit for the Detection of Respiratory Bacterial Pathgens in Pediatric Patients Korean J Lab Med; 29: pp 30713 25 Mary PES (2015) A review of the role of Haemophilus influenza in community-acquired pneumonia Pneumonia 29,6: 26-43 26.WHO (2013) ” Revised WHO classification and treatment of childhood pneumonia at health facilities” pp.1-2 27 Trần Đình Long Phạm Xuân Tú (2009) Đặc điểm, cách chăm sóc trẻ sơ sinh đủ tháng thiếu tháng, Bài giảng Nhi khoa tập I, NXBY học, tr 138-156 28 WHO (2007) Child Growth Standard, pp.1- 200 29.Trần Quỵ (2002) Suy hơ hấp cấp tính trẻ em, Tài liệu bồi dưỡng kiến thức nhi khoa, Bệnh viện Bạch Mai,tr 159-169 46 30 Nguyễn Công Khanh, Bùi Văn Viên (2009) Hội chứng thiếu máu, Bài giảng Nhi khoa tập II, NXBY học, tr 88-92 31 Nguyễn Công Khanh, Bùi Văn Viên (2009) Hội chứng xuất huyết trẻ em, Bài giảng Nhi khoa tập II, NXBY học, tr 102 47 PHỤ LỤC 1: MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu giá trị PCR đa mồi chẩn đoán VPCĐ HI Mã số nghiên cứu: …………… Năm……… Số thứ tự:… … I Hành chính: Họ tên bệnh nhân: ………………………………………………… Ngày sinh … /……/…… Nam [ ] Ngày vào viện: … /……/…… Ra viện vì: Khỏi [ ] Đỡ: Nữ [ ] Ngày viện: … /……/…… [ ] Tử vong [ ] Xin [ ] Mã số bệnh án: ………………………………………………………… Địa ………………………………………………………………… Nông thôn [ ] Thành Thị [ ] Miền Núi [ ] Số điện thoại liên lạc: ………………………………………… Họ tên bố:…………… Nghề nghiệp……… TĐVH:… Tuổi: K rõ: [ ] Họ tên mẹ: …………… Nghề nghiệp:………TĐVH:… Tuổi:…K rõ: [ ] II Tiền sử sản khoa: Con thứ: …… Tuổi thai sinh: Đủ tháng [ ] Thiếu tháng [ ] ……Tuần Già tháng [ ] ……Tuần [ ] Đẻ huy Cách sinh: Đẻ thường [ ] Mổ đẻ [ ] Cân nặng sinh: …… g III Tiền sử nuôi dưỡng: Bú mẹ: Sữa mẹ [ ] Nơi nuôi dưỡng: Hỗn hợp Trại trẻ [ ] Bệnh viện IV Tiền sử bệnh trước đến viện Bị bệnh ngày thứ:…… Lí khám bệnh: [ ] Nhà trẻ [ ] Nuôi [ ] [ ] nhà [ ] 48 Sốt [ ] Ho [ ] Suy hơ hấp [ ] Khò khè [ ] Khác [ ] Điều trị trước đến viện a.Kháng sinh Có [ ] Khơng [ ] Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày Tên thuốc: …………………………………………Thời gian:……….ngày b.Cocticoit Có [ ] Khơng [ ] Thời gian: ………ngày c Thuốc khác:……………………………………………………………… d.Tiền sử dị ứng thuốc: Có [ ] Khơng [ ] e Nếu có loại gì:………………………………………………………… Tiền sử NKHHC: …….lần V Triệu chứng lâm sàng lúc nhập viện: 5.1 Toàn trạng: a Chiều cao: …….cm b Cân nặng: …… kg c Nhiệt độ: ,…0C d Mạch: …… lần/phút e SpO2: …… % f F thở: … lần/phút 5.2.Triệu chứng Có Khơng Sốt Chảy mũi Ho [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Khó thở Bú Tiêu chảy Ban da Bỏ bú Không uống Kích thích quấy khóc Co giật Rút lõm lồng ngực Tím tái Thở rên [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] 49 5.3.Triệu chứng phổi: 5.3.1 Ran phổi: Có [ ] Vị trí: Phải [ ] Trái Loại ran: Rít [ ] Có [ ] 5.3.2.Khò khè: [ ] Ẩm [ ] Không[ ]  5.3.2 Hai bên [ ] Ngáy [ ] Nổ [ ] Không[ ]  5.3.3 Vị trí: Phải [ ] Trái [ ] 5.3.3.Hội chứng đơng đặc phổi Có 5.3.4.Hội chứng tràn dịch màng phổi Có Hai bên [ ] [ ] Không[ ]  5.3.4 [ ] Không[ ]  5.3.5 5.3.5.Triệu chứng khác phổi:……………………………………………………… 5.4.Cơ quan khác Tim mạch Tiêu hoá Miệng họng B.thường [ ] Không BT [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Triệu chứng Tim Bẩm Sinh [ ] Gan to [ ] Lách to [ ] Nấm miệng [ ] Khe hở hàm [ ] Da Cơ, xương Thần kinh Hạch Các quan khác [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] Da xanh [ ] Da vàng [ ] [ ] [ ] Xuất huyết da [ ] ………………………… Não bé [ ] [ ] [ ] Dị tật não khác [ ] Hạch to [ ] ………………………… 50 VI Triệu chứng cận lâm sàng lúc nhập viện: 6.1.Huyết học: Bạch cầu:…………/mm3 Tiểu cầu: …… 103/mm3 TT………… % LP ……% MN……… % EO… % Hb: ……… … g/dl CRP:………… mg/l 6.2 Pcr đa mồi loại vi khuẩn: - Hi: - Phế cầu: - Mycoplasma: - Chlamedia.pneumonia: - Ho gà: - Legenela: Chỉ số CT: 6.3 Cấy dịch tỵ hầu: Âm Tính [ ] Dương tính [ ] Khơng làm [ ] Loại vi khuẩn gì:………………(1 E.coli, K Pneu, C.albican, P aeruginose, Streptococus group F, Enterobater, H Influenza, S.pneumonia, 9.Stenotrophomonas Ma, 10 P aeruginose, 11 Burkholderia cepacia ; 12 Khác…………………………… Nồng độ vi khuẩn: 6.5 XQ lồng ngực: Có [ ] Khơng[ ] Tổn thương phổi kẽ Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Đơng đặc phế nang Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Hình ảnh kính mờ Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tổn thương dạng nốt Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tràn dịch màng phổi Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Tổn thương hạch rốn phổi: Khác:…………………… Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Có [ ] (1 bên [ ] hai bên [ ] ) Không [ ] Không [ ] 51 VII Theo dõi triệu chứng trình điều trị: 7.1.Thời gian nằm viện: ……… ngày Nằm hồi sức: Có: [ ] Khơng [ ] 7.2 Thở oxy: Số ngày nằm:…………………… Có: [ ] Khơng [ ] 7.3 Thời gian điều trị khỏi bệnh:…….ngày 7.4 Các tác dụng phụ hay gặp:…………………………………………………… IX Hình ảnh X quang trình điều trị 9.1 Hình ảnh X quang sau điều trị ngày Nặng lên [ ] Đỡ [ ] Không thay đổi [ ] Hết tổn thương [ ] 9.3 Hình ảnh X quang sau điều trị 10 ngày Nặng lên [ ] Đỡ [ ] Không thay đổi [ ] Hết tổn thương [ ] X: Liệu trình điều trị: 10.1 Kháng sinh: Có [ ] Không [ ] Số loại kháng sinh:…… loại Loại 1:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… Loại 2:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… Loại 3:…… Thời gian dùng:…… ngày Lí dùng:…………………………… ( 1.Cefuroxim 750mg, 2.Cefotaxim 1g, 3.Ceftriaxon1g 4.Cefoferazone + Sulbactam 1g, 5.Immipennem 500mg 6.Ceftazidim 1g, 7.Cefepim1g, 8.Meropenem 500mg 9.Piperacilline 4, g 10.Loại khác…………………………………… ) 10.2 Tăng miễn dịch: Có [ ] 10.3 Liệu pháp oxy Có [ ] Khơng [ ] Khơng [ ] Tổng thời gian sử dụng Oxy: …… ngày 10.4 Kết điều trị: Đỡ [ ] Tử vong [ ] Khỏi [ ] Xin [ ] Ngày….tháng… năm 20… Bác sĩ Nguyễn Thị Thu Hằng 52 PHỤ LỤC 2: QQuy trình xét nghiệm real time PCR u Đây xét nghiệm Realtime PCR đa mồi cho phép khuyếch đại phát đồng thời axit nucleic mục tiêu vi khuẩn Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP), Bordetella pertussis (BP), Bordetella parapertussis (BPP), Streptococcus pneumoniae (SP), Haemophilus influenzae (HI) mẫu bệnh phẩm đường hô hấp bệnh nhân Trang thiết bị vật liệu  Găng tay SHPT không bột tan (latex or nitrile)  Pipet hút tự động thể tích 10ul, 20ul, 100 ul, 200 ul  Pipet nhựa vô trùng dùng lần ml  Ống ly tâm vô trùng 1.5 mL  Hệ thống tách chiết Magna Pure LC 2.0 hóa chất, vật tư tiêu hao kèm  Máy ly tâm nhanh (Spin)  Máy Vortex mixer  Hệ thống Real-time PCR CFX96TM (Bio-Rad)  Strips chạy Realtime PCR ống 0.2 mL (màu trắng đục, Bio-Rad)  Nắp Strips chạy Realtime PCR ống 0.2 mL (Bio-Rad)  Plate chạy Realtime PCR (Bio-Rad)  Tủ an tồn sinh học cấp II Quy trình thực 2.1Thu thập, lưu trữ vận chuyển mẫu Thu thập mẫu Sử dụng bệnh phẩm dịch tỵ hầu nội khí quản, lấy vào ống vơ trùng falcon 15ml Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm 53 Bệnh phẩm chuyển tới khoa xét nghiệm sớm hành chính, bảo quản tủ 4ºC khoa lâm sàng chờ chuyển tới khoa xét nghiệm Thời gian chờ không 48 Quy trình tách chiết mẫu bệnh phẩm Tiền xử lý mẫu bệnh phẩm Lưu ý: Quá trình xử lý mẫu phải thực tủ an toàn sinh học tránh tượng lây nhiễm chéo đảm bảo an tồn cho mơi trường cán xử lý mẫu - Các mẫu cấp mã, đánh số lưu vào ống ly tâm vô trùng 1,5 ml 3.2.2 Quy trình tách chiết bệnh phẩm hệ thống tách chiết tự động tự động MagNA Pure 2.0 (Roche) Hệ thống trang bị cánh tay robot xử lý 32 mẫu bệnh phẩm khác lần chạy Hệ thống tách chiết dựa công nghệ bi từ kết hợp với sử dụng hóa chất tinh cao đảm bảo việc tách chiết cho vật chất di truyền đạt chất lượng cao đồng kết Thời gian hoàn tất lần chạy máy 32 mẫu khoảng 90 phút Các bước thực quy trình Chuẩn bị - Chuẩn bị hóa chất Proteinase K theo hướng dẫn: thêm 4ml Proteinase K vào Incubation buffer II vào lọ Proteinase K hòa tan Thêm tiếp 2,7 ml Prpotein K trộn Lưu giữ 2-8 C tháng, -15 đến -25 C năm - Dung dịch MGP (bi từ) kit lưu trữ nhiệt độ phòng Cần Vortex kỹ trước sử dụng - Hút 10 ul IC vào giếng khay mẫu Sau hút vào giếng 200 ul mẫu cần tách Hướng dẫn tách chiết - Thực theo hướng dẫn vận hành máy tách chiết Magna Pure LC 2.0 - Vệ sinh máy: dùng giấy không bụi thấm cồn 70% lau khu vực bên máy - Mở nguồn máy MP:C 54 - Đăng nhập vào phần mềm - Thực việc bảo trì: bơi trơn đầu pipette - Ở hình Overview, click Ordering bên tay trái - Đặt tên mẫu chạy bảng thông tin - Click vào Purification Protocol để chọn Protocol - Chọn thể tích mục Sample Volume Elution Volume - Click vào biểu tượng Next - Theo thông tin hình “Workplace: Stage Setup” load vật dụng hóa chất cần thiết theo yêu cầu máy - Sau xác nhận cung cấp đủ vật dụng cần thiết - Click START để chạy máy - Sau chạy xong: lấy khay sản phẩm đồng thời bỏ vật dụng khác - Vệ sinh máy giấy thấm cồn 70% - Chiếu đèn UV - Hút sản phẩm tách chiết khay chuyển ống 0.5ml để lưu sản phẩm tách chiết Trên ống ghi mã nghiên cứu tương ứng với mã ghi ống lưu bệnh phẩm Chuẩn bị phản ứng Realtime PCR 2.3.1 Chuẩn bị hóa chất nhỏ mẫu Việc trộn hóa chất chạy PCR cần phải thực tủ trộn hóa chất phòng riêng biệt với phòng tách chiết DNA/RNA Khơng sử dụng lẫn thiết bị phòng Ghi nhãn lên ống eppendord 1.5ml Trên ống ghi rõ loại hỗn hợp phản ứng cần trộn, ngày thực hiện, người thực Tính tốn số lượng phản ứng cần chuẩn bị = Số mẫu + (01 chứng âm, 01 chứng dương) + N N = số mẫu 20 N = số mẫu từ 20 trở lên Tính tốn lượng hóa chất cần pha theo cơng thức sau: STT Tên hóa chất 5X RP4 MOM Thể tích ul 55 EM2 RNase-free Water Tổng thể tích ul ul 17 ul Lưu ý Mỗi hỗn hợp phản ứng chạy kèm với chứng âm chứng dương Vị trí mẫu đặt trước, sau đến chứng âm, chứng dương đặt sau Trình tự nhỏ hỗn hợp phản ứng mẫu vào ống phản ứng: Hỗn hợp phản ứng nhỏ vào ống trước theo sơ đồ chạy mẫu Vị trí nhỏ mẫu tương ứng với vị trí nhỏ hỗn hợp phản ứng Mẫu nhỏ trước, sau đến chứng âm, chứng dương nhỏ sau để tránh nhiễm cho mẫu Ví dụ: Sơ đồ nhỏ hỗn hợp phản ứng A Mẫu 10 11 12 S1 NC PC B C D E F G H Sau thêm vào tất thành phần phản ứng, dùng pipet trộn hỗn hợp phản ứng cách hút lên hút xuống sau ly tâm nhanh ống hỗn hợp phản ứng Chia 17 microlit hỗn hợp phản ứng vào giếng chạy Strip phản ứng RT-PCR 0.2 ml (Bio-rad) Chuyển ống chứa hỗn hợp phản ứng sang phòng nhỏ mẫu (phòng tách chiết) Hút microlit mẫu tách DNA/RNA, mẫu chứng âm, mẫu chứng dương vào ống phản ứng tương ứng Thay đầu nhỏ mẫu Vị trí ống phản ứng giống với sơ đồ chạy mẫu Ví dụ: Mẫu nhỏ theo sơ đồ Mẫu S1 nhỏ trước vào giếng A1, chứng âm vào giếng B1, chứng dương vào giếng C1 56 2.3.2 Chạy phản ứng máy Realtime PCR CFX96TM (Bio-rad) Thiết lập chương trình chạy máy Vào hình chọn File → New→ Protocol, mở Protocol Editor thiết lập chương trình chạy sau: Bước 1: 50ºC 20 phút Bước 2: 95ºC 15 phút Bước 3: 45 chu kỳ của: 95ºC 10 giây 60ºC 01 phút (đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) 72ºC 10 giây (đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) Bước 4: Thực bước 3, thêm 44 chu kỳ Nhấp chuột vào ô Sample Volume chọn thể tích mẫu 25 ul Nhấp chuột OK để lưu Protocol mở cửa sổ Experiment Setup Phần Plate Setup, chọn Create New để mở Plate Editor Với giếng chọn kênh màu: FAM, HEX, Cal Red 610, Quasar 670 Chọn Sample Type: Unknown cho giếng cần chạy Chọn Plate size (96 wells) plate type tương ứng Bấm Start Run để chạy chương trình Cài đặt cho phân tích liệu hệ thống CFX96TM (Bio-rad) Sau chạy xong phản ứng, vào phần Quantitation để xem kết Chọn No Baseline Subtraction từ phần Analysis Mode Chọn Seegene Export từ Tools manu Chọn ổ lưu liệu bấm OK Cài đặt cho phân tích liệu phần mềm Seegene Viewer Mở chương trình Seegene Viewer, nhấp chuột vào file lưu thư mục “Quantstep4” Sau mở file kết quả, chọn tên kit chạy RP4 từ phần PRODUCT Kiểm tra kết cho giếng Đọc hiểu kết phát Phân tích Biểu đồ 1(tác nhân) huỳnh quang Chất FAM Biểu đồ (tác nhân) Streptococcus pneumoniae (SP) Legionella pneumophila (LP) 57 HEX Haemophilus influenzae (HI) Bordetella parapertussis (BPP) Cal Red 610 Mycoplasma pneumoniae (MP) Bordetella pertussis (BP) Quasar 670 IC (Internal Control) Chlamydophila pneumoniae(CP) Các kết dương tính giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)=42 Diễn giải kết Tác nhân Biểu Biểu đồ + + + + - đồ + + + + - Nội kiểm Đọc hiểu + Dương tính với tác nhân phát - Dương tính với tác nhân phát Có thể dương tính với tác nhân vi khuẩn khác + - Âm tính Xét nghiệm bị lỗi, cần chạy lại -IC yếu âm tính chất lượng mẫu có chất ức chế -Tách lại mẫu khác -Nếu kết mẫu tách lại không thay đổi, tiến hành pha loãng mẫu 1/3 đến 1/10 với PBS lặp lại xét nghiệm PhuPhucPhu ... 3.1 Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng trẻ em có nhiễm haemophilus influenzae3 0 3.1.1 Một số đặc điểm dịch tế Viêm phổi cộng đồng trẻ em có nhiễm Haemophilus influenza:... giá trị Realtime PCR đa mồi chẩn đốn điều trị viêm phổi cộng đồng có nhiễm Haemophilus Influenzae trẻ em điều trị Bệnh viện Nhi Mô tả số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng viêm phổi có nhiễm HI trẻ em. .. 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng viêm phổi cộng đồng có nhiễm haemophilus influenzae 35 3.2 Mối liên quan giá trị phát Real-time PCR với số số lâm sàng chẩn đoán điều trị viêm phổi cộng đồng có