Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện để tách và xác định một số vitamin B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) : Đề tài NCKH. QT.09.21

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN ********* ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Tên đề tài: NGHIÊN CỬU TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIÈU KIỆN ĐỂ TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) MẢ SỐ: QT-09-21 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS CHU NGỌC CHÂU HÀ NỘI - 2009 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN ********* BÁO CÁO TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐỀ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI r f i A Ã i i # Tên đẽ tài: NGHIÊN CỬU TÓI ƯU HÓA CÁC ĐIÈU KIỆN ĐỂ TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SÓ VITAMIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) MÃ SĨ: QT-09-21 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS Chu Ngọc Châu CÁC CÁN B ộ THAM GIA: PGS.TS Tạ Thị Thảo • • m s v Nguyễn Thị Cúc HVCH Vũ Thị Thu Hương ! ĐẠI H O C Q U Ộ C TRUNG TÂM t h ô n g D ĩ/ % HÀ NỘI - 2009 GIA HA N Ọ l tin t h v i ề n BAO CÁO TÓM TẮT a Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện để tách xác định số vitamin B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) b Chủ tri đề tài: TS Chu Ngọc Châu c Các cán tham gia: PGS.TS Tạ Thị Thảo sv Nguyễn Thị Cúc HVCH Vũ Thị Thu Hương d Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu: Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện để tách xác định số vitamin nhóm B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nội dung: - Khảo sát độ hấp thụ quang cực đại tương ứng với vitamin Bl, B2, B3, B6 , BI2 - Khảo sát điều kiện ảnh hưởng tới q trình tách phân tích so vitamin B (Bl, 2, 3, , 12): nghiên cứu tìm chọn điều kiện tối ưu thông số cột tách, pha động (thành phần pha động, chế độ rửa giải, pH, tác nhân tạo cặp ) để tách xác định so vitamin nhóm B phương pháp HPLC - Khảo sát ảnh hưởng vitamin nhóm khác (vitamin C) đến kết phân tích vitamin nhóm B - Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích tách xác định đồng thời vitamin Bl, 2, 3, , 12 bàng phương pháp HPLC: xây dựng đường chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp, đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp - Nghiên cứu lựa chọn qui trình xử lý mẫu thích hợp: xử lý mẫu thuốc sữa bột - ứng dụng điều kiện thu để xác định hàm lượng so vitamin nhóm B mẫu thuốc sữa bột e Các kết đạt được: 1) Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sắc ký lóng hiệu cao cột đảo pha (RPHPLC) với detector PDA đặt bước sóng đặc trưng vitamin B Cụ thể : A.= 246; 268; 261; 290; 361 nm tương ứng với Bl, B2, B3, B6 , B12 Q trình phân tích tiến hành cột Supelco C18, chiều dài cột 250mm đường kính cột 6,1 mm, cỡ hạt |im Nhiệt độ cột: 40°c 2) Thành phần pha động: Axetonitril/dung dịch đệm photphat điều chỉnh đến pH = axit H3PO4, với chế độ rửa giải gradient theo thời gian Sử dụng chất tạo căp ion muối natri heptansunfonat (SHS) Tốc độ pha động f = ml/phút 3) Xây dựng đường chuẩn vitamin B, xác định giá trị giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), kháo sát độ lặp lại vitamin B Khảo sát, đánh giá độ tin cậy phương pháp thông qua đại lượng: độ lặp lại (RSD < 5%), độ thu hồi (80 % - 98% mẫu sữa 89 - 103% mẫu thuốc) 4) Đưa quy trình xử lý mẫu sữa dung dịch TCA 4% phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm, hiệu suất thu hồi đạt 80 -98% Đối với mẫu thuốc, axit axetic 2,4% chọn dung môi chiết tốt (hiệu suất thu hồi 89 - 103%) 5) ứ n g dụng phương pháp phân tích để xác định đồng thời vitamin B l, B2, B3, B , B I2 mẫu thuốc thực phẩm chức 6) Bài báo khoa học: 01 Chu Ngọc Châu, Nguyễn Thị Cúc, Tạ Thị Thảo, “Xác định số vitamin nhỏm B dược phẩm thực phẩm phương pháp R P -H P L C Gửi đăng tuyển tập báo cáo tóm tắt cơng trình khoa học Hội nghị nhà Khoa học trẻ lĩnh vực Khoa học Tự nhiên Công nghệ lần thứ Tháng 5/2010 Đăng tồn văn Tạp chí Khoa học & Công nghệ (Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam) 7) Hướng dẫn 01 khoá luận tốt nghiệp f Tình hình kinh phí đề tài: Tổng kinh phí cấp : 25.000.000đ Đã c h i: 25.000.000đ bao gồm: Thanh tốn dịch vụ cơng cộng: 1.000.000 Vật tư văn phòng: 400.000 Hội nghị: 2.000.000 Thuê mướn: 7.500.000 Chi phí nghiệp vụ chun mơn ngành: 14.100.000 KHOA QUẢN LÝ CHỦ TRÌ ĐẺ TÀI PGS.TSKH Lưu Văn Bơi TS Chu Ngọc Châu C QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : SUMMARY REPORT OF THE SCIENTIFIC RESEARCH SUBJECT a Title of subject: Optimization study of separation conditions and determination of several vitamin group B using high performance liquid chromatography method (HPLC) b Code No: Q T -09-21 c Head of project: Dr Chu Ngoc Chau Participants: Assoc Prof Dr Ta Thi Thao Student Nguyen Thi Cue MSc Vu Thi Thu Huong d Aim and contents of the subject: Aim: To optimize the separation conditions and the analysis procedures for the high performance liquid chromatography (HPLC) determination of various vitamin group B Contents: - Investigation o f the maximum absorbance wavelength for each vitamin B l, B2, B3, B and B12 - To investigate some important parameters affecting the separation as well as the analysis of several vitamin group B (B l, B2, B3, B , B12): selection and optimization the most suitable parameters for the separation column, the mobile phase (e.g., the component o f mobile phase, elution procedure, pH value, couple agent, etc.) in order to determine such vitamins by using HPLC system - To some investigating to select the suitable conditions for sample preparation: medicine sample and food sample - To determine the content of several vitamin group B drug sample and powder milk e The obtained results: 1) The Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography method (RP-HPLC) using PDA detector was selected The absorbance wave length (A.) was found to be 246; 268; 261; 290 and 361 nm for vitamin B l, B2, B3, B and B12, respectively The analysis was carried out by using a Supelco C l column (250 mm in length, internal diameter o f 6.1 mm, and particle size o f I^m) The column temperature was maintained at 40°c 2) Mobile phase: acetonitrile/phosphate buffer solution was used as mobile phase with the gradient elution over time The sodium heptane sulfonate (SHS) was also added as the ion-couple agent The flow rate of mobile phase was set as f = ml/min 3) The standard curve, the low limit of detection (LOD), the low limit of quantification (LOQ), and the relative standard deviation (RSD) were investigated for each vitamin group B The reliability o f analysis method was confirmed since the relative standard deviation (RSD) was less than 5%, and the recovery reached up to 80-98% for powder milk samples and 89-103% for drug samples 4) The sample preparation procedures that are suitable with laboratory facilities were suggested For powder milk samples, the recovery o f 80-98% was gained when sample preparation was conducted with 4% TCA solution For drug samples, the highest recoveries (89-103%) were achieved by using acetic acid solution of 2.4% as elution solvent 5) These optimum parameters were applied to determine the contents of several vitamin group B (B l, B2, B3, B and B12) in real medicine (drug) and food samples (powder milk) 6) Publication: 01 Chu Ngoc Chau, Nguyen Thi Cue, Vu Thi Thu Hương, Ta Th Thao, “Determination o f some vitamins group B (Bl, B2, B3, B6, BỈ2) in drug and milk samples by using reversed-phase high performance liquid chromatography (R P - H P L C Accepted the short communication in the Proceeding o f the 1st Science and Technology Conference for Young Scientist (May, 2010), and Submitted to publication in the Journal of Science and Technology (Vietnamese Academy of Science and Technology publisher) 7) 01 student defended successfully her Bachelor thesis on this research topic ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN ********* BÁO CÁO TOÀN VĂN KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐỀ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Tên đề tài: NGHIÊN CỬU TÓI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐẺ TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B BẢNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) MÃ SĨ: QT-09-21 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS Chu Ngọc Châu CÁC CÁN B ộ THAM GIA: PGS TS Tạ Thị Thảo s v Nguyễn Thị Cúc HVCH Vũ Thị Thu Hương HÀ NỘI - 2009 MỤC LỤC A MỞ ĐẦU B NỘI DƯNG CHÍNH I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 V itam in nhóm B vai trị chúng 1.1.1 Tên gọi, cẩu trúc, công thức cẩu tạo vitamin nhóm B 1.1.2 Tính chất vai trị vitamin nhóm B 1.1.3 Độc tỉnh vitamin nhóm B 1.2 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3 Tổng quan phương pháp xác định vitamin nhóm B phương pháp HPLC 1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng pha ngược sử dụng detector PDA 1.3.2 Phương pháp sắc kỷ lỏng cặp ion sử dụng cột tách pha ngược, detector UV- VIS 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang Ií MỤC TIÊU VÀ NỘI DƯNG NGHIÊN c ứ u III, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết bị hóa chất 3.2 Xử lý mẫu phân tích IV KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tối ưu hóa điều kiện tách xác định số vitamin nhóm B phương pháp HPLC 4.1.1 Khảo sát độ hấp thụ quang vitamin B nghiên cứu 4.1.2 Chọn pha tĩnh cột tách 4.1.3 Nghiên cứu chọn hệ dung môi pha động 3.1 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 3.2 Khảo sát ảnh hưởng p H 3.3 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ pha động 1.4 Tổng hợp điều kiện phân tích với hệ thống RP-HPLC 4.2 Đánh giá phương pháp phân 4.2.1 Đường chuẩn, giới hạn phát khoảng tuyến tính tích V 4.2.2 Đánh giá độ xác phương pháp phân tích 29 4.3 Phân tích mẫu thực tế 32 4.5 Kết cơng bố 34 KẾT LUẬN c TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 35 37 A MỞ ĐẦU Các vitamin cần thiết cho việc trì sức khỏe người, đặc biệt khả tăng trưởng trẻ Trong số 13 loại vitamin quan trọng thể, vitamin nhóm B tan nước như: thiamin (B l), riboflavin (B2), niacin (B3), pyridoxin (B ), cyanocobamine (B12) đặc biệt quan trọng cho trình trao đổi chất tái tạo lượng tổng hợp tế bào máu cho thể Vitamin B l, B6 , B I2, tế bào sống thành phần cần thiết cho phát triển Bất thiếu hụt thành phần chế độ dinh dưỡng gây ảnh hưởng tiêu cực Rất nhiều trường hợp bệnh lý chế độ dinh dưỡng dẫn tới thiếu viatmin B thường bổ sung bàng thực phẩm chức sữa, bột dinh dưỡng hỗ trợ thuốc dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp vitamin Xác định xác hàm lượng vitamin bổ sung có ý nghĩa việc đảm bảo quyền lợi sức khỏe người tiêu dùng Để xác định hàm lượng vitamin B dược phẩm thực phẩm, có nhiều phương pháp phân tích nghiên cứu áp dụng để phân tích riêng rẽ đồng thời vitamin nhóm B phương pháp điện hóa [1], động học huỳnh quang [2 ], phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến đạo hàm [3, 4], phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [5-7] Trong phương pháp này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao RP-HPLC, detector ƯV với cột tách c 18 [8 , 9] sử dụng cách rộng rãi khả tách tốt vitamin đáp ứng yêu cầu cho phân tích đồng thời lượng khơng nhỏ vitamin nhóm B dược phẩm lượng vet vitamin thực phẩm, đồng thời phát trực tiếp sau tách mà khơng phải dẫn xuất hóa phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang [10], Dựa tình hình thực tế, chúng tơi nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích hàm lượng vitamin Bỉ, B2, B3, B6, B ỉ phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu cao pha đảo, chế độ rửa giải gradient để góp phần kiểm tra đánh giá, hàm lượng vitamin dược phẩm thực phẩm, từ có thơng tin xác hàm lượng thành phần vitamin so với giá trị công bô nhãn sản phâm Phụ lục Đánh giá phương pháp phân tích Hình 2.1 Sắc phổ hỗn hợp axit với nồng độ BI (8.6ppm ), B2 (10.3 ppm), B3 (20.2 ppm), B6 17 (ppm), B I2 (4.0 ppm) ¥ n ft I Ạ I Hình 2.2 Sắc phổ hỗn hợp axit với nòng độ BI (42.8 ppm), B2 (5.2 ppm), B3 (80.8ppm), B6 (21.2ppm), B12 (20.2ppm) Phụ lục Đánh giá độ xác phương pháp phân tích Hình 3.1 Ả n h hưởng vitamin C: mẫu giả thêm vitamin c (320 ppm) Phụ lục 4: Khảo sát mẫu thực H ình 4.1: M ầu thuốc 3B complex dạng siro (công ty cồ phần dược phẩm Vĩnh phúc) iv CÁC SẢN PHÀM KHOA HỌC ĐÃ HOÀN THÀNH * Các báo báo cáo khoa học Chu Ngọc Châu, Nguyễn Thị Cúc, Vũ Thị Thu Hương, Tạ Thị Thảo, “Xác định số vitamin nhóm B (Bỉ, B2, B3, B6, B ỉ 2) dược phẩm sữa phương pháp sẳc ký lỏng hiệu cao pha đảo R P -H P LC Gửi đăng tuyển tập báo cáo tóm tắt cơng trình khoa học Hội nghị nhà Khoa học trẻ lĩnh vực Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ lần thứ Tháng 5/2010 Đăng tồn văn Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ (Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam) * Đào tạo Vũ Thị Thu Hương, HVCH, “Phân tích vitamin nhóm B sữa bột trẻ em phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” (2009) Sinh viên thực hiện: (Tháng 06/2010) Nguyễn Thị Cúc, Lớp: K51A I TĨM TẮT CÁC CƠNG TRÌNH NCKH CỦA CÁ NHÂN ĐĨNG TRONG BÁO CÁO CỦA ĐÊ TÀI * Các báo báo cáo khoa học Chu Ngọc Châu, Nguyễn Thị Cúc, Vũ Thị Thu Hương, Tạ Thị Thảo, "Xác định sơ vitamin nhóm B (Bỉ, B2, B3, B6, B12) dược phẩm sữa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo RP-HPLC’ Gửi đăng tuyển tập báo cáo tóm tăt cơng trình khoa học Hội nghị nhà Khoa học trẻ lĩnh vực Khoa học Tự nhiên Công nghệ lần thứ Tháng 5/2010 Đăng tồn văn Tạp chí Khoa học & Công nghệ (Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam) RP-H PLC D E T E R M IN A T IO N OF VITAM INS B ( B l, B2, B3, B6, B12) IN M U IL T IV IT A M IN TABLETS AND M ILK SAM PLES Chu Ngọc Châu , Nguyễn Thị Cúc, Vũ Thị Thu Hương, Tạ Thị Thảo Faculty o f Chemistry, Hanoi University o f Science, VNU nsocchau 79(a yahoo, com ( SUM M ARY A sensitive reversed-phase high performance (RP-HPLC) method was developed and validated for the simultaneous determination of B-group vitamins in multivitamin tablets and milk samples The analytical method has been conducted using a Shimadzu HPLC system, equipped with a photodiode-array (PDA) detector The procedures for the determination of B|, B2, B3, B6 and B 12 were carried out on a C l column (250 mm X 6.1 mm X |im) The gradient HPLC method with chanels of mobile phase which is including acetonitrile (ACN) and solution of mM heptanesulphonic acid sodium salt and pH phosphate buffer has been studied The proposed method has been successfully applied to determine vitamins in multivitamin tablets and milk samples with high recovery, accurate and precise results XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B ( B ị, B2, B3, B6, B12) TRONG D ợ c PHẨM VÀ SỮA BÀNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO ( RP-HPLC) Chu Ngọc Châu', Nguyễn Thị Cúc', Vũ Thị Thu Hương2, Tạ Thị Thảo1 1- Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2- Viện kiềm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc Gia- Bộ Y tế neocchan 79(ẩ).vahoo com r> RP-HPLC DETERMINATION OF VITAMINS B ( B„ B2, B3, B6, BI2) IN MUILTIVITAMIN TABLETS AND MILK SAMPLES SUMMARY A sensitive reversed-phase high performance (RP-HPLC) method was developed and validated for the simultaneous determination of B-group vitamins in multivitamin tablets and milk samples The analytical method has been conducted using a Shimadzu HPLC system, equipped with a photodiode-array (PDA) detector The procedures for the determination of B|, B2, B3, B a n d B 12 w e r e c a r r ie d o u t o n a C l c o lu m n ( m m X m m X |im ) T h e g d ie n t H P L C method with chanels of mobile phase which is including acetonitrile (ACN) and solution of mM heptanesulphonic acid sodium salt and pH phosphate buffer has been studied The proposed method has been successfully applied to determine vitamins in multivitamin tablets and milk samples with high recovery, accurate and precise results Mở đầu Các vitamin cần thiết cho việc trì sức khỏe người, đặc biệt khả tăng trưởng trẻ Trong số 13 loại vitamin quan trọng thể, vitamin nhóm B tan tro n g n c n h : t h ia m in ( B l ) , r ib o fla v in ( B ) , n ia c in ( B ) , p y r id o x in ( B ), c y a n o c o b a m in e (BI2 ) đặc biệt quan trọng cho trình trao đổi chất tái tạo lượng tổng hợ p c c tế b o máu c h o c th ể V it a m in B l , B , B I , tro n g tế b o s ố n g n h th àn h p h ần cần thiết cho phát triển Bất thiếu hụt thành phần chế độ dinh dưỡng gây ảnh hường tiêu cực Rất nhiều trường hợp bệnh lý chế độ dinh dưỡng dẫn tới thiếu viatmin B thường bổ sung bàng thực phẩm chức sữa, bột dinh dưỡng hỗ trợ thuốc dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp vitamin Xác định xác hàm lượng vitamin bổ sung có ý nghĩa việc đảm bảo quyền lợi sức khỏe người tiêu dùng Để xác định hàm lượng vitamin B dược phẩm thực phẩm, có nhiều phương pháp phân tích nghiên cứu áp dụng đê phân tích riêng rẽ đơng then vitamin nhóm B phương pháp điện hóa [1], động học huynh quang [2], phương phap trắc quang kết hợp với thuật tốn qui đa biên đạo ham [3, 4], phương phap sac ky lỏng hiệu cao [5-7], Trong phương pháp phương pháp sắc ký lòng hiệu cao RP-HPLC, detector u v với cột tách C18 [8 9] sừ dụng cách rộng rãi khả tách tốt vitamin đáp ứng yêu cân cho phan tích đong thơi lượng khong nho vitamin nhóm B dược phẩm lượng vết vitamin thực phẩm, đồng thời phát trực tiếp sau tách mà dẫn xuất hóa phương pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang [ ] Dựa tren tinh hình thực te, chủng tơi nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích hàm lượng CQC vitamin BI, B2, B3, B6, B I2 băng phương pháp săc ký lỏng hiệu CŨOpho đảo chc đọ nra giai gradient đe góp phân kiêm tra đanh giá, ham lượng vitamin frong dược pham va thực phâm, từ cỏ thơng tin xác vê ham lượng thành phần vitamin so với giá trị công bố nhãn sản phẩm Thực nghiệm 2.1.Hóa chất: Các loại hóa chất dùng phép phân tích thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích (P.A.) hãng Merck gồm axit axetic băng, axit tricloaxetic (TCA) Tất dung môi sử dụng thuộc loại siêu tinh khiêt (Merck) axetonitrin (ACN), metanol dành riêng cho HPLC trước sử dụng đêu rung siêu âm để loại bỏ bọt khí, pha chế dung dịch nước cất lần Các dung dịch chuẩn: Các dung dịch chuẩn gốc vitamin gồm thiamin (106 mg/1), riboflavin ( 0 mg/1), niacin (111 mg/I), pyridoxin ( 0 mg/I), axit folic ( 0 mg/1) cyanocobalamin (178 mg/1) pha dung dịch axit axetic 2,4% Các dung dịch chuẩn gốc giữ tối bảo quản nhiệt độ -2 °c để tránh phân hủy vitamin Hàng ngày sử dụng dung dịch chuẩn 10 mg/1 pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc nói 04 ) - D u n g m ô i p h a đ ộ n g c h ứ a n a tri h e p tan s u lfo n a t m M , n atri d ih id ro p h o h a t ( N a H P 0,0IM, axit ortho phosphoric (H3PO4) chuân bị sau: cân l,203g natri heptan sulfonat 1,3609 g natri dihidro photphat vào bình 1L, sau thêm nước cất đến khoảng 800 ml, lắc dung dịch Tiếp đó, thêm axit ortho phosphoric để điều chỉnh đến pH = 3, định mức bình đến 1L bàng nước cất, lắc để đồng dung dịch rung siêu âm 10 phút Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 Ịim trước đưa vào hệ thống HPLC 2.2 Thiết bị phân tích - Hệ thống HPLC Shimadzu gồm bơm cao áp LC-10Advp, trộn dung mơi lị cột CTO 10AS, hệ điều khiển SCL 10A, detectơ PDA (Photodiode array) SPD-M10A (Đèn D2 W) V ò n g n p m ẫ u |il C ộ t S u p e l c o L iC h r o s p h e r R P - ( m m X ,1 m m , c ỡ hạt |im ) -Máy đopH HANA211 2.3 X lý mẫu phân tích: - £)ơi vói ìĩĩơu sữữ bột trẻ SĨIĨ.' Đ ô n g n h ât m â u , c a n lư ợ n g c h in h x a c k h o a n g g â m m a u tren cân phân tích có độ xác 0.000 lgam vào ống ly tâm nhựa (50 ml) Thêm 15 ml dung dịch TCA 4% Lắc đều, rung siêu âm sau ly tâm gạn lấy dung dịch lớp vào bình định mức 25ml Lặp lại trình chiết với 10 ml TCA 4% Gộp dịch chiết hai lần vào bình định mức 25 ml Định mức đến vạch mức 25 ml bàng dung dịch TCA 4% Lọc qua giấy lọc màng lọc có kích thước lỗ 0,45 jam trước bơm vào hệ thống HPLC - Đổi với mẫu thuốc: Đồng nhất, nghiền mịn viên thuốc dạng bột Cân lượng xác khoảng 0,1 gam mẫu cân phân tích có độ xác , 0 lgam, cho vào ống ly tâm nhựa (50 ml) Lắc với 10 ml dung dịch axit axetic 2,4%, rung siêu âm phút ly tâm 30 phút Thu dịch lọc vào bĩnh định mức 50 ml Định mức đến vạch mức bàng dung dịch axit axetic 2,4 /o Pha loãng mâu theo tỳ lệ thích hợp đê có nơng độ chất phần tích nằm đường chuẩn Lọc dung dịch mẫu phân tích qua giấy lọc màng lọc kích thước lỗ 0,45 ụm trước bơm mẫu vào hệ thống HPLC Kết thảo luận 3.1 Khảo sát yếu tổ ảnh hưởng tói q trình phân tích Các vitamin nhóm B hấp thụ ánh sáng mạnh vùng tử ngoại (UV) Do chúng tơi chọn detector PDA để quan trắc vitamin bước sóng vùng từ 200 nm đến 350 nm Quét phổ hấp thụ dung dịch chứa vitamin riêng rẽ Bl, B2, B3, B6 BI2 Các bước sóng cực đại hấp thụ để phát vitamin tương ứng sau: BI (246 nm), B2 (268 nm), B3 (261 nm), B6 (290 nm), B12 (361 nm) *Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động- Chúng khảo sát thành phần pha động theo hướng: sừ dụng phương pháp rừa giải gradient để tối ưu điều kiện rửa giải vitamin nhóm B khảo sát chế độ chạy sắc ký pha động thành phần không đổi (isocratic) theo tỷ lệ tăng dần ACN thành phần pha động • Khi khảo sát thành phần pha động theo phương pháp isocratic, với kênh A dung dịch đệm photphat NaH2P0 (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat kênh B ACN, nhận thấy vitamin B chất tan tốt nước nên tăng tỳ lệ ACN thời gian lưu giữ chất phân tích cột tăng dẫn đến vitamin tách muộn gây doãng chân pic làm giảm độ nhạy phương pháp phân tích Ví dụ với tỷ lệ thể tích ACN/đệm photphat 10/90 chất tách tương đối tốt thường bị doãng chân pic Ngược lại, giảm tỉ lệ ACN thời gian lưu giữ chất phân tích cột sắc ký giảm, vitamin tách sớm, chiều cao pic tăng không tách hoàn toàn vitamin; cụ thể với ti lệ thể tích ACN/đệm photphat 5/95 chi tách số vitamin (3 vitamin B2, B6 B12 không tách khoi nhau) Như chế độ isocratic khơng phù hợp để tách vitamin nhóm B khỏi • Kết khảo sát q trình tách hỗn hợp vitamin nhóm B theo phương pháp rửa giải gradient với hai kênh dung môi pha động A B ưên cho thấy vitamin B tách khỏi khoảng thời gian lưu từ 13 đên 32 phút, pic có độ đơi xứng tơt khơng xảy tượng dỗng chân pic Chế độ rửa giải gradient với chương trình bảng xem tối ưu để tách vitamin nhóm B khỏi giữ không đổi lần khảo sát Bảng 1: Chương trình rửa giải gradient pha động (Kênh B : Đệm photphat NaH2P (0,01M, pH = 3,0) + 5mM Natri heptan sulfonat; kênh A : ACN) Thời gian (phút) 0,01 15 19 23 25 27 35 % thê tích A 5 15 15 20 20 2 % tích B 98 95 95 85 85 80 98 98 80 cách thay đổi giá trị pH 2,5; 2,7; 3,5 Thực nghiệm cho thấy, độ phân giải R vitamin B2 B6 tăng dần tương ứng 1,84; 1,98; 2,24 2,70 Như vậy, pH khoảng khảo sát không ảnh hưởng nhiều đến khả tách độ phân giải R Tuy nhiên, giá trị R cần vừa đủ để tách hồn tồn hai chất khỏi nhau, chúng tơi chọn dung mơi pha động có pH = để nghiên cứu yếu tố khác trình phân tích Hình sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin B|, B2, B3, B6, B |2 thu điều kiện tối ưu chọn Từ kết khảo sát chọn detector, bước sóng, loại cột tách, thành phần pha động, pH cùa dung dịch đệm , điều kiện tối ưu cho trình phân tích vitamin B với hệ thống RJP-HPLC chọn sau: - Cột tách cột đào pha C18, chiều dài cột 250mm, đường kính cột 6,1 mm kích thước hạt 5um; nhiệt độ cột tách 40°c - Thành phần pha động: theo chế độ rửa giải gradient gồm hai kênh ACN dung dịch đệm photphat 0,0IM (pH = 3) Tốc độ pha động J L hút Hình ỉ: sắc đồ chuẩn hỗn hợp năm vitamin B theo chương trình chạy gradient B3 (13, min.), B ỉ2 J-Jetect0r PDA bước sóng X chọn lọc đối (22,3 min.), B6 (24,5 min.), B2 (25,5 min.), BI với ^ (32,9 min.) ^ v ita m in : B I ( n m ), B (2 33 (261 run), B6 (290 nm), B12 (361 nm) 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 3.2.1 Đương chuẩn, giới hạn phát (LOD) khoảng tuyến tính Đưòmg chuân xác định vitamin B,; B2; B3; B6; B 12 biểu diễn mối quan hệ giũa diện tích pic (y) thu trir* sắc ký nồng độ vitamin B (ppm) dung dịch chuẩn Phương trình hồi qui có dạng y=ax+b, hệ số tương quan r, khoảng tuyến tính (từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính) giới hạn phát tính theo qui tắc 3ơ tìm bảng Bảng 2: Các thông số đặc trưng phép định lượng vitamin B theo phương pháp RPHPLC Vitamin B y = ax + b r Khoảng tuyên tính (ppm) LOD (ppm) 1,28 B, y = 58859x+ 13929 0,9997 b2 y = 125777X-33351 0,9999 3,84-42,8 2,13-40,0 b3 y = 44593x - 8104 b6 y = 62952x - 47318 0,9989 0,9997 19,3-121,2 3,84 - 42,4 6,43 1,28 , - 20,2 0,37 y = 22739x4-4715 0,9999 B ,2 3.2.2 Đánh giá độ xác phương pháp phân tích 0,71 • Ảnh hưởng vitamin C: Trên thực tế, nhóm thuốc complex B bán thị trường, bên cạnh vitamin nhóm B cịn chứa hàm lượng lớn vitamin nhóm khác, đặc biệt vitamin c tan tốt nước Vì vậy, cần khảo sát ành hưởng vitamin c đến việc xác định hàm lượng vitamin B Hai mẫu giả chứa vitamin B|, B2, B3, B6 có nơng độ tương ứng 24, 16, 80, 16 ppm có khơng có mặt axit ascorbic (vitamin C) Kết phân tích cho thấy hàm lượng vitamin c lớn (320 ppm) không ảnh hường đến kết phân tích vitamin B • Độ chụm (Độ lặp lại độ tái lặp): - Mầu tự tạo: Hỗn hợp chứa vitamin B, nồng độ vitamin 20 ppm bơm lần vào hệ thống HPLC đế đánh giá độ lặp diện tích pic thu chất Kết cho thấy, sau lần bơm mẫu, diện tích pic cúa vitamin B|, B2, B3 B6 lặp lại tốt, độ lặp lại độ tái lập tính qua độ lệch chuẩn tương đối nhỏ 5% Tuy nhiên, với vitamin BI2, chất dễ phân hủy, nên diện tích pic giảm đáng kê (15 %) đê mâu qua đem - Mấu viên nang chứũ loợi vitamin B' Lây 10 viên thuoc Complex B (cua Cong ty co phan dược phẩm Cửu Long) chi chứa vitamin Bi, B2, B3, B6, bó phần vỏ ngồi, trộn đêu hỗn hợp Cân cân phân tích (có độ xac 0,0001 gam) khoang 0,1 gam mau mau bọt, chuyển vào bình nón 100ml, thêm 10 ml dung dich axit axetic 2,4 /0, rung sieu am ly tam Thu dịch lọc vào bình định mức 50 ml Định mức đến vạch mức dung dịch axit axetic 2,4% Phân tích hàm lượng vitamin theo qui trình thiết lập làm lặp lại lân tư mẫu bột ban đầu Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối xác định vitamin B|, B2, B3 B6 lân lượt 2,97; 0,97, 1,81,2.06 % • Đánh giá hiệu suất thu hồi cùa phương pháp phân tích - : Lựa chọn dung dịch chiết vitamin khỏi mẩu: + Đoi với mẫu sữa bột: Các vitamin chiết khỏi mẫu dung dịch tricloaxetic (TCA) Thí nghiệm tiến hành với dung dịch TCA nông độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, %, nồng độ làm lặp lại lần (n=3) Kết cho thấy tăng dần nông độ TCA từ 1% đến 4%, diện tích pic vitamin B tăng dần đạt diện tích pic lớn Khi tăng nồng độ TCA lên - % diện tích pic vitamin lại giảm dần Vì chúng tơi chọn dung dịch TCA 4% để chiết vitamin B mẫu sữa bột + Đối với mẫu thuốc: Bốn dung dịch dùng để chiết vitamin B khỏi mẫu nước, dung dịch đẹm photphat pH —3, dung dich axit axetic 2,4% dung dịch axit axetic đặc 24% Kết phân tích cho thấy diện tích pic thu viatmin (trừ vitamin B2) đạt giá trị lớn nhât nêu dùng nước (sau đến dung dịch axit axetic), sắc ký đồ thu bị ảnh hưởng nhiễu đường nên dung dịch chiết mẫu Tuy nhiên, vitamin B2 tương đối khó tan nươc, nen chi co thẻ dung nước hàm lượng B2 mẫu không cao Do chủng tơi chọn dung dịch axit axetic 2,4% làm dung dịch chiêt vitamin B mẫu thuốc Độ thu phương pháp: Đê khăng định tính hiệu phương pháp chiết cần đánh giá độ thu hôi dựa vào mâu thêm chuân nên mẫu thực cách thêm ba mức nồng độ dung dịch chuân loại vitamin vào mẫu sữa mẫu thuốc Mỗi mức nồng độ thêm chuân lặp lại lần Kêt thực nghiệm cho thây, mẫu sữa giá trị trung bình độ thu hồi nồng độ khác đạt phân tích B|, B2, B3 B6 90%, 94 %, 97 % 80% Giá trị mẫu thuốc 101 %, 89 %, 103% 96 %, độ lệch chuẩn tương đố i c c p h é p đ o lặ p lạ i đ ề u d i % Đ iề u c h ứ n g tỏ p h n g p h p c ó đ ộ đ ú n g tốt, đ ộ c h ụ m cao hay phương pháp xác phân tích mẫu thực tế 3.3 Phân tích mẫu thực tế: Áp dụng qui trình phân tích thiết lập, tiến hành phân tích mẫu thuốc viên hai mẫu sữa Kết thu bảng Bảng 3: Kết phân tích hàm lượng vitamin B!, B2, B3 B6 B 12 mẫu thuốc (ND: Dưới giới hạn phát cua phương pháp) Thuôc 4B complex c Thuôc 4B complex B Thuôc 3B complex Mâu thuôc (siro) Thành phân ghi nhãn BI ( 0 mg) B6 (100 mg) B12 (1 mg) BI (15 mg) B2 (10 mg) B3 (50 mg) B6 (5 mg) Nhà sản xuât Kết phân tích BI (15 mg) B2 (10 mg) B3 (50 mg) B6 (10 mg) c ( 0 mg) - - -Công ty cô phân dược Công ty cô phân dược Công ty cô phân dược phẩm Cửu Long phâm Cưu Long phâm Vĩnh Phúc -Nông độ Nông độ N ông độ Ị N ô n g độ Nồng độ Nông độ dung xác định xác định dung dịch xác định dung dịch phân theo dịch phản theo theo phàn tích L tính theo nhãn (ppm) Vitamin BI 40 Vitamin B2 — Vitamin B3 phương pháp HPLC (ppm) 40 tích tính theo nhãn) phương pháp HPLC (ppm) tích tính theo nhãn phương pháp HPLC (ppm) 24 24 16 80 26,2 16,4 16 26,0 16,0 76,8 80 78,0 8,8 16 16,8 — — — Vitamin B6 40 41,4 Vitamin B 12 4,9 — — — — B ảng 4: Kết phân tích vitamin B ị, B j, B ị B6 B ị2 (mg/100g) mẫu sữa bột (ND: Dưới giới hạn phát cùa phương pháp) Loại mẫu Sữa bột Dumex Gold Sữa bột Nan Pro Vitamin BI Vitamin B2 Vitamin B3 Vitamin B6 Vitamin B12 Giá trị nhãn 0,73 0,81 11,6 0,44 0,0016 Hàm lượng xác định 0,93 1,06 13, 0,80 ND 1,0 1,3 17,0 1,4 0,002 1.09 1,55 18,0 1,74 ND Giá trị nhãn Hàm lượng xác định đươc _1 Các kết phân tích cho thấy mẫu thuốc hàm lượng nhà sàn xuất công bổ hàm lượng vitamin B xác định khác khong ke Tuy nhien, VƠI cac mâu sữa thành phần vitamin nhỏ, gần với giới hạn phát phương pháp nên kết Quà thu hâu hêt vitamin có ham lượng cao horn so VƠI giâ t n cong bo trcn nhãn sàn phẩm Tuy nhiên sai khác không lớn Đặc biệt vitamin B12 mâu sửa có hàm lượng nhỏ giới hạn phát phương pháp phân tích Điêu chưng to phương phap nghiên cửu có đủ tin cậy đê phân tích mau thực te K ế t luận Bàng phương pháp sắc ký long pha ngược HPLC sử dụng detector PDA, cột tách Supelco LiChrospher RP-18, thành phẩn pha động gồm dung mỏi A đệm photphat NaH2P0 (0,01M, p H = ) v m M N a t r i h e p ta n s u lfo n a t; d u n g m ô i B a c e to n itr il tô c đ ộ d o n g lm l/p h u t va rửa giải theo chế độ gradient xác định xác hàm lượng vitamin tan nước nhóm B gồm B i B 2, B 3, B Bi2-trong dược phẩm (thuốc) thực phẩm (sữa) Phương pháp mở rộng để xác định thành phần vitamin B thực phẩm khác bột dinh dưỡng, gạo nhóm đối tượng mẫu giàu vitamin nhóm B có mẫu phức tạp sau nghiên cứu tìm trình xừ lý mẫu tối ưu Nghiên cứu tiến hành thời gian tới * Cơng trình hoàn thành với hỗ trợ kinh p hỉ từ đề tài QT-09-21 Tài liệu tham khảo [1] Purvi B Desai, Rahul M Kotkar and Ashwini K Srivastava Journal of Solisd State Electrochemstry Vol 12 (9), (2008), 1067-1075 [2] Junaid Aslam, Mohammed s Mohajirl, Saeed A Khanl, and Abdul Q Khan; African Journal o f Biotechnology, Vol (14), (2008), 2310-2314 [3] Pedro L López-de-Alba, Leticia Lopez-Martinez, Victor Cerdáb and Judith AmadorHernandez J Braz Chem Soc., Vol 17, No 4, 715-722, 2006 [4], Mahmure "Ustun "OZGUR, _Ikbal KOYUNCU Turk J Chem 26 (2002), 385- 391 [5] I.F Kamman, T.p Labuza and 1.1 Warthsen, J.Food.Sci., (1980), 45, 1497 [6 ] E.c Nicolas, K.A Pfender, J.Assoc Off Anal Chem, (1990), 73(5), 792 (7) [7] R.B Toma and M.M Tabekhina, J.Food.Sci., (1979), 44, 263 [8 ] Aberto Zafra-Gomez, Antonio Garballo, Juan c Morales, Luis E Garcia-Ayuso, J.Agric Food Chem., (2006), 54, 4531- 4536 [9] Pilar Vinas, Carmen Lospez-Erroz, Nuria Balsalobre, Manuel Hamandez-Cordoba, J Chromatogr.A., (2003), 1007, 77-84 [10] M Bergaentzle, A.Arella, J.B Bourguignon, c Hasselmann Food Chemistry., (1995), 52, 81-86 B ộ• GIÁO DỤC • VÀ ĐÀO TẠO • TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THỊ THU HƯƠNG PHÂN TÍCH CÁC VITAMIN NHĨM B TRONG SỮA BỘT TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) LUẬN VĂN THẠC s ĩ HÓA c BẢN Người hướng dẫn khoa học: TS TẠ THỊ THẢO Hà Nội - 2009 PHIẾU ĐẢNG KÝ KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u KH-CN Tên đề tài: N ghiên cứu tối tru hoá điều kiện để tách xác định số vitam in B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (H PLC ) Mã số : Q T -0 -2 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH QGHN Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 38584287 Tổng kinh phí thực chi: 25.000.000 Trong đó: -Từ ngân sách nhà nước: * - Kinh phí trường: - Vay tín dụng: - Vốn tự có: - Thu hồi: Thời gian nghiên cứu: 12 tháng Thời gian bắt đầu : 01/2009 Thời gian kết thúc: 12/2009 Tên cán phối hợp nghiên cứu: PGS.TS Tạ Thị Thảo s v Neuyễn Thị Cúc HVCH Vũ Thị Thu Hương Số đăng ký đề tài Ngày: Số chứng nhận đăng ký kết nghiên cứu Bảo mật: a Phổ biến rộng rãi: b Phố biến hạn chế: c Bảo mật: T ó m tắ t k ể t q u ả n g h iên cứu: 1) Nghiên cứu lựa chọn phương pháp săc ký lỏng hiệu cao cột đảo pha (RPH PLC ) với detector PD A đặt bước sóng đặc trưng vitamin B Cụ thể : A = 246; 268; 261; 290; 361 nm tương ứng với Bl, B2, B3, B , B12 Q trình phân tích tiến hành cột Supelco C18, chiều dài cột 250mm, đường kính cột mnvcỡ hạt um Nhiệt độ cột: 40°c 2) Thành phần pha động: Axetonitril/dung dịch đệm photphat điều chỉnh đến pH = bàng axit H3P 4; với chế độ rửa giải gradient theo thời gian Sử dụng chất tạo căp ion muối natri heptansunfonat (SHS) Tốc độ pha động f = ml/phút 3) Xây dựng đường chuân đôi với vitamin B, xác định giá trị giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khảo sát độ lặp lại vitamin B Khảo sát, đánh giá độ tin cậy cùa phương pháp thông qua đại lượng: độ lặp lại (RSD < 5%), độ thu hồi (80 % - 98% mẫu sữa 89 - 103% mẫu thuốc) 4) Đưa quy trình xử lý mẫu sữa dung dịch TCA 4% phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm, hiệu suất thu hồi đạt 80 -98% Đối với mẫu thuốc, axit axetic 2,4% chọn dung môi chiết tốt (hiệu suất thu hồi 89 - 103%) 5) ứng dụng phương pháp phân tích để xác định đồng thời vitamin Bl, B2, B3, B6 , B12 dược phẩm (thuốc) thực phẩm (sữa) K iên nghị vê qui mô đôi tượng áp dụng nghiên cứu Đề nghị tiếp tục nghiên cứu vấn đề tương lai để phát triển Chù nhiệm đê tài Họ tên Học hàm Học vị Ký tên đóng dấu Chu Nế?c Châu Thù trưởng Chù tịch hội đông I Thủ trưởng quan quan chủ trì đề tài Ị đánh giá thức quàn lý đê tài ị -TL.GIẤM Đ Ố C TRijfojs RÀN KHOA HOC - CỔNG NCpHỆ ... ề n BAO CÁO TÓM TẮT a Tên đề tài: Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện để tách xác định số vitamin B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) b Chủ tri đề tài: TS Chu Ngọc Châu c Các cán tham gia: PGS.TS... dung nghiên cứu: Mục tiêu: Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện để tách xác định số vitamin nhóm B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nội dung: - Khảo sát độ hấp thụ quang cực đại tương ứng với vitamin. .. ********* B? ?O CÁO TOÀN VĂN KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u ĐỀ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC CÁP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Tên đề tài: NGHIÊN CỬU TÓI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN ĐẺ TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VITAMIN B BẢNG PHƯƠNG