Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của một số chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Nhƣ Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Nhƣ Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu, PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh, người thầy tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cán nghiên cứu Phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực đề tài nghiên cứu luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thị Mai Linh, Phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn, làm việc phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, người trực tiếp hướng dẫn giúp mặt kỹ thuật phân tử ý kiến tư vấn hiệu trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm tập thể thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, nói chung Bộ mơn động vật khơng xương sống nói riêng tận tình bảo, giúp đỡ để tơi hồn thành chương trình khóa học Cuối tơi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể gia đình, bạn bè người bên cạnh giúp đỡ, chỗ dựa tinh thần để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Tác giả Nguyễn Như Trang i MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: .4 1.1.2 Đặc điểm hình thái 11 1.1.3 Đặc điểm sinh học 14 1.2 Khả ứng dụng tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng phịng trừ sinh học sâu hại 16 1.2.1 Trên giới .16 1.2.2 Tại Việt Nam 19 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu .22 2.2 Đối tượng nghiên cứu .22 2.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùng 23 2.4.2 Phương pháp phân loại tuyến trùng dựa trình tự 18S – rDNA 25 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học EPN .29 2.4.4 Phương pháp xác định độc lực EPN .30 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƢƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .32 3.1 Đặc điểm hình thái 32 3.2 Đặc điểm sinh học phân tử (đoạn 18S-rDNA đoạn D2-D3, thuộc 28SrDNA) 38 3.2.1 Kết PCR .38 3.2.2 Kết giải trình tự gen 39 ii 3.2.3 Kết phân tích mối quan hệ di truyền tuyến trùng 42 3.3 Một số đặc điểm sinh học tuyến trùng .44 3.3.1 Thời gian sinh trưởng phát triển tuyến trùng G melonnella 44 3.3.2 Khả sinh sản tuyến trùng ấu trùng G mellonella .45 3.3.3 Hiệu lực gây chết tuyến trùng S-DL13 ấu trùng BSL 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 58 iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematodes) VKCS : Vi khuẩn cộng sinh IJs : Ấu trùng cảm nhiễm (Infective juveniles) BSL : Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) PTSH : Phòng trừ sinh học iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Mối quan hệ họ hàng loài Steinernema phân lập Việt Nam (Phan Ke Long, 2004) .10 Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử tuyến trùng Steinernema Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 12 Hình 1.3: Vịng đời lồi Heterorhabditis and Steinernema bọ ( Gaugler, Brown, Shapiroilan & Atwa , 2002) 15 Hình 3.1: Ảnh chụp hiển vi đực Steinernema siamkayai hệ 33 Hình 3.2: Ảnh chụp hiển vi Steinernema siamkayai T 34 Hình 3.3: Ảnh chụp hiển vi ấu trùng cảm nhiễm Steinernema siamkayai 35 Hình 3.4a: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 18S 38 Hình 3.4b: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen D2D3 38 Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại gen 18S mẫu nghiên cứu với loài khác genbank theo phương pháp ME 43 Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại gen D2-D3 mẫu nghiên cứu với loài khác genbank theo phương pháp ME 44 Hình 3.7: Ấu trùng cảm nhiễm phát tán khỏi vật chủ 45 Hình 3.8: Đồ thị tương quan sản lượng IJs số lượng IJs gây nhiễm ban đầu chủng S-DL13 ấu trùng BSL .47 Hình 3.9: Đồ thị tương quan tỷ lệ ấu trùng BSL chết số lượng gây nhiễm ban đầu chủng S-DL13 .49 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Danh sách chế phẩm sinh học BIOSTAR 20 Bảng 1.2 Áp dụng phòng trừ sâu hại số địa phương .20 Bảng 2.1 Các mồi đặc hiệu cho PCR 26 Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR 26 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 28 Bảng 2.5: Chu trình nhiệt phản ứng xác định trình tự DNA 29 Bảng 3.1: Các số đo loài S siamkayai Việt Nam 36 Bảng 3.2: Bảng ma trận khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu với trình tự đoạn gen 18S Genbank 40 Bảng 3.3: Bảng ma trận khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu với trình tự gen D2-D3 Genbank 41 Bảng 3.4: Khả sinh sản chủng S-DL13 ấu trùng BSL .46 Bảng 3.5: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL chủng S-DL13 48 vi MỞ ĐẦU Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có đa dạng phong phú loài thực vật, động vật có nơng nghiệp phát triển Tuy nhiên, điều kiện khí hậu điều kiện tốt để sâu bệnh hại phát sinh, phát triển quanh năm Có thể nói, trở ngại lớn sản xuất nông nghiệp nước ta Hàng năm, côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản lượng sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999) Để bảo vệ suất trồng, người nông dân sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học khác nhau, đem lại hiệu nhanh, dễ sử dụng, giá thành thấp, lại gây hậu tiêu cực môi trường sống, gây hại đến sức khỏe người động vật ni, đồng thời tạo nên tính kháng thuốc nhiều lồi dịch hại Đặc biệt, thuốc hóa học cịn tiêu diệt nhiều lồi sinh vật có ích làm giảm tính đa dạng tự nhiên gây cân sinh thái Hướng đến phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe người, vật ni sinh vật có ích, đảm bảo tính đa dạng sinh học tính cân sinh thái tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phịng trừ tổng hợp có biện pháp sinh học nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng tiến tới thay phần thuốc hóa học trừ sâu dùng nơng nghiệp Hiện nay, phương pháp phịng trừ sinh học, nghiên cứu ứng dụng nhiều thực tế, số kết đạt sử dụng thiên địch tự nhiên ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để khơng chế dịch hại Ngồi vi khuẩn, nấm virut đa nhân nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại trồng Đặc biệt gần đây, loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng phòng trừ sâu hại Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cho côn trùng (EPN) thực chất tổ hợp cộng sinh loài tuyến trùng ký sinh thuộc giống Steinernema (Họ Steinermatidae) Heterorhabditis (Họ Heterorhabditidae) loài vi khuẩn gây bệnh giống Xenorhabdus Photorhabdus Trong đó, tuyến trùng đóng vai trò vừa ký sinh lại vector mang truyền vi khuẩn gây bệnh Chính mà nhóm tuyến trùng trở thành tác nhân sinh học có nhiều ưu phịng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu hại rộng, khả diệt sâu nhanh, có khả tự sản sinh tăng số lượng sau giết chết sâu hại sản xuất sinh khối lớn công nghệ sinh học thích hợp in vivo in vitro EPN nghiên cứu ứng dụng rộng rãi thương mại hóa chế phẩm sinh học nhiều nước Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan [2] Mặc dù nghiên cứu EPN Việt Nam triển khai vài thập niên gần đây, kết nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú đa dạng, đồng thời đạt số kết quan trọng việc điều tra phân loại nghiên cứu, tuyển chọn chủng tuyến trùng có tiềm sinh học đưa vào sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5] Tuy nhiên, hầu hết chủng EPN Việt Nam tồn hệ sinh thái rừng tự nhiên, chủng EPN phân lập từ hệ sinh thái nơng nghiệp Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên cần thiết Để có thêm dẫn liệu tuyến trùng hệ sinh thái nông nghiệp, tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tử số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên ” với mục đích sau: Xác định đặc điểm hình thái phân tử EPN hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên Đặc trưng sinh học tiềm sử dụng EPN phòng trừ sinh học Do hạn chế thời gian phạm vi nghiên cứu rộng, nên tập trung nghiên cứu xác định tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN hệ sinh thái công nghiệp hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với loại công nghiệp chủ lực cà phê hồ tiêu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ KẾT LUẬN Đã phân lập chủng tuyến trùng S-DL13 ký sinh gây bệnh côn trùng từ vùng cà phê thuộc xã Ea Sin, huyện Krông Búk, tỉnh Đắk Lắk Tỷ lệ tuyến trùng mẫu 0,95 % Về hình thái chủng tuyến trùng S-DL13 giống loài Steinernema siamkayai Stock, Somsook & Reid, 1998 Đặc điểm hình thái hình thái lượng chủng tuyến trùng S-DL13 khơng có biến động nhiều so với mô tả gốc từ mẫu vật Thái Lan có đa dạng số đo trưởng thành Đây ghi nhận Việt Nam Đặc điểm trình tự đoạn gene 18S-rDNA D2-D3 chủng tuyến trùng S-DL13 phân lập Việt Nam có tương đồng cao với trình tự chủng khác loài S siamkayai,phân lập Thái Lan với độ tương đồng 97-99% Thời gian để hoàn thành chu kỳ phát triển ấu trùng cảm nhiễm tuyến trùng S-DL13 thể vật chủ 8-10 ngày Tỷ lệ gây chết ấu trùng bướm sáp lớn (G mellonella) tỷ lệ thuận với số lượng ấu trùng cảm nhiễm gây nhiễm ban đầu Giá trị LC50 chủng tuyến trùng S-DL13 đồi với ấu trùng bướm sáp lớn 7, thấp cho thấy độc lực chủng tuyến trùng S-DL13 tương đối mạnh KIẾN NGHỊ Trên sở nghiên cứu ban đầu sinh học chủng tuyến trùng S-DL13, đề nghị:  Tiếp tục triển khai nghiên cứu khả nhân nuôi chủng tuyến trùng SDL13 môi trường nhân tạo điều kiện in vitro nhằm xác định khả sản xuất sinh khối chủng tuyến trùng S-DL13 qui mô pilot  Triển khai thử nghiêm quy mô đồng ruộng chế phẩm sinh học tuyến 51 trùng S-DL13 nhằm xác định hiệu lực phòng trừ khả áp dụng PTSH đối tương sâu hại Việt Nam 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Nguyễn Ngọc Châu (1998),” Nghiên cứu sử dụng tuyến trùng phòng trừ sinh học sâu hại trồng Việt Nam”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ 36(2), 24-29 Nguyễn Ngọc Châu (2007), “Tình hình sâu đục thân hại ăn số trang trại Mê Linh, Vĩnh Phúc khả phòng trừ tuyến trùng diệt sâu epn”, Tạp chí BVTV (212), 21-24 Nguyễn Ngọc Châu (2008), Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Việt Nam, Nhà Xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh (1997), “Phát nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh trùng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 19 (4), 22-29 Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hồng, Ngơ Xuân Tường (1999), “Hiệu lực gây chết chủng tuyến trùng Steinernema sp TK10 Heterorhabditis sp TK3 số sâu hại trồng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 21(2B), 104-113 Lại Phú Hồng, Nguyễn Ngọc Châu (2004), “Hiệu lực gây chết chủng tuyến trùng H-MP11 sâu xanh Helicoverpa armigera (Hubner)”, Tạp chí BVTV (198), 27-31 Lại Phú Hồng, Nguyễn Ngọc Châu (2005), “Hiệu lực diệt sâu xanh Helicoverpa armigera (Hubner) chủng tuyến trùng TX1”, Tạp chí Sinh học 27(3A), 87-90 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ (2003), “Hiệu lực phòng trừ sâu xám (Agrotis ypsilon) hại thuốc số chế phẩm sinh học tuyến trùng (EPN)”, Tạp chí BVTV (190), 26-29 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Nguyễn Anh Diệp (2003), “Hiệu lực gây chết khả sinh sản tuyến trùng 53 Steinernema carpocapsae TL bọ hại mía (Alissonotum impresscolle)”, Tạp chí Khoa học 1, 100-104 10 Phan Kế Long (2004), “Cây phát sinh chủng loại số chủng Steinernema Việt Nam sở giải mã vùng ITS-rDNA”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nhà xuất KHKT Hà Nội, tr 156-159 Tài liệu nƣớc 11 Akhust R.J (1986), “Controlling insects in soil with Entomopathogenic Nematodes”, Fundamental and Applied Aspects of Invertebrate Pathology, Wageningen, The Netherlands, 265-267 12 Anon (1988a), SAS Technical Report, Additional SAS/STAT Procedures Release 6.03, SAS Institute, NC, USA, pp 179 13 Anon (1988b), SAS/STAT User Guide Release 6.03, SAS Isntitute, Cary, NC, USA, pp 1028 14 Bedding R.A (1984b), “Large scale production, storage and transport of insect parasitic nematodes Neoplectana spp and Heterorhabditis spp”, Annals of Applied Biology 104, 117-120 15 Bedding R.A (1990), “Logister and strategies for introduction entomopathogenic nematodes technology into Developing Countries”, In: Gaugler, R & Kaya, H.K.(Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control, CRC Press, Florida, 233-246 16 Cabanias H.E & Raulston J.R (1994), “Pathogenicity of Steinernema riobranis against corn earworm, Helicoverpa zea (Boddie)”, Fund Appl Nematol., 17(3), 219-223 17 Cutler C.G and Stock S.P (2003), “Steinernema websteri sp n (Rhabditida: Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from China”, Nematol medit, 31, pp 215-224 18 Deley P., Félix M.A., Frisse L.M., Nadler S.A., Sternberg P.W & Thomas W.K (1999), “Molecular and morphological characterisation of two 54 reproductively species with mirror-image anatomy (Nematoda: Cephalobidae)”, Nematology, 2, pp 591-612 19 Dutky S.R & Hough W.S (1955), “Note on parasitic nematode from codlinhmoth larvae Carpocapsae pomonelle (Lepidoptera: Olethrutidae)”, Proceedings of the Entomological Society of Washington, 57, pp 244 20 Elawad S.A., Gowen S L., Hague N.G.M (1999), “The life cycle of S abbasi and S riobave in Galleria mellonella”, Nematology, 1(7-8), pp 762764 21 Friedman M.J (1990),” Commercial production and development In: Gaugler R & Kaya H.K (Eds.)”, Entomopathogenic Nematodes in Biological Control, CRC Press, Florida, 153-172 22 Glaser R.W (1932),” Studies on Neoaplectana glaseri, a nematodes parasite of the Japanese beetle (Popillia japonica Newn)”, New Jersey Department of Agriculture, Trenton, NJ Circular, 211, pp 34-42 23 Hazir S., Stock S.P., Kaya H.K., Koppenhofer A.M and Kenkin N (2001), “Developmental temperature effects on five geographic isolates of the entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae)”, Journal of Invertebrate Pathology, 77, pp 243-250 24 Holterman M., Wurff A.V.D., Elsen S., Megen H.,(2009) “Phylum-Wide Analysis of SSU rDNA Reveals Deep Phylogenetic Relationships among Nematodes and Accelerated Evolution toward Crown Clades” Molecular Biology and Evolution , pp 1792-1800 25 Hunt D.J (2007),” Overview of taxonomy and systematics”, In: Nguyen K.B & Hunt D.J (Eds) Entomopathogenic nematodes: systematics, phylogeny and bacterial symbionts Nematology Monographs and Perspectives Leiden, The Netherlands, Brill, pp 27-57 26 Hussaini S.S., Ansari M.A., Ahmad W and Subbotin S.A (2001),” Identification of some Indian populations of Steinernema species 55 (Nematoda) by RFLP analysis of the ITS region of rDNA”, International Journal of Nematology, 11(1), pp 73-76 27 Kaya H.K and Gaukler R (1993), “Entomopathogenic nematodes”, Annual Review of entomology, 38, pp 181-206 28 Nguyen K.B & Smart J.C (1994), “Neosteinernema longicurvicaudata n gen n sp (Rhabditida: Steinernematidae), a parasite of termite Reticulitermis flavips (Koller)”, Journal of Nematology, 26, pp 162-174 29 Nguyen K.B., Shapiro-Ilan D.I., Stuart R.J., McCoy C.W., James R.J and Adams B.J (2004a), “Heterorhabditis mexicana n sp (Rhabditida: Heterorhabditidae) from Tamaulipas, Mexico and morphological studies of the bursa of Heterorhabditis spp”, Nematology, 6(2), pp 231-244 30 Nguyen K.B., Tesfamariam M., Gozel U., Gaugler R and Adams J.B (2004b), “Steinernema yirgalemense n sp (Rhabditida: Steinernematidae) from Ethiopia”, Nematology,6(6), pp.839-856 31 Nguyen K.B., Malan A.P., Gozel U (2006), “Steinernema khoisanae n sp (Rhabditida : Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from South Africa”, Nematology, 8(2), pp 157-175 32 Nguyen N Chau, Phan K Long (2009), “Some field trials of entomopathogenic nematodes in biological control of some insect pests in Viet Nam“, Development of IPM in Asia and Africa, Vol 2, Sci Publ House, Hanoi, 217-223 33 Phan K.L., Nguyen N.C and Moens M (2001a), “Steinernema loci n sp and Steinernema thanhi n sp (Rhabditida: Steinernematidae) from Vietnam“, Russ J Nematology, 9, pp 1-7 34 Poinar G.O.Jr (1975), “Description and biology of a new insects, parasitic rhabditoids, Heterorhabditis bacretiophora n gen., n sp (Rhabditida: Heterorhabditidae n, fam) “, Nematologica, 21, pp 463-470 56 35 Qiu L., Hu X., Zhou Y., Mei S., Nguyen K.B and Y Pang (2005), “Steinernema akhursti sp n (Nematoda: Steinernematidae) from Yunnan, China”, Journal of Invertebrate Pathology, 90, pp 151-160 36 Rodda M.S Nguyen N Chau (2009), “The potential of entomopathogenic nematode train S-TX1 for biocontrol of flea beetle (Phyllotreta striolata) on cabbage in Hai Phong“, Development of IPM in Asia and Africa, Vol 2, Sci Publ House, Hanoi, 225-233 37 Spiridonov S.E., Waeyenberge L., Moens M (2010), “Steinernema schliemanni sp n (Steinernematidae; Rhabditida): a new species of steinernematids of the 'monticolum' group from Europe”, Russ J Nematol, 18 (2) pp 175-190 38 Steiner G (1929),” Neoaplectana glaseri n g., n sp., (Oxyuridae) a new nemic parasite of Japanese beetle (Popillia japonica Newm)”, J Wash Acad Science., 19, pp 436-440 39 Stock S.P , V Somsook & A Reid (1998), “Steinernemasiamkayai n sp (Rhabditida: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Thailand”, Systematic Parasitology 41:105-113 40 Vu Quang Con, Nguyen Ngoc Chau (2001), “ Development of biological control as key component for ecological sustainable agriculture in Vietnam”, Proceedings of the 20th APEC Symposium on Advanced Technology for Sustainable Agriculture, 68-78 41 Wang, J.X & Bedding, R.A (1996), “Population development of Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema carpocapsae in the larvae of Galleria mellonella”, Fundamental and Applied Nematology, 19, pp 363367 WEB SITES 42 Genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 57 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự vùng 18S-rDNA chủng tuyến trùng S-DL13 Kết đọc trình tự đoạn gen 18S-rDNA loài Steinernema siamkayai từ Việt Nam máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer >AI_V2 CCGCCGTCGCTGCCCGGGACTGAGTTGTTTCGAGAAAAGCGGAGATTGC GATGTTGAATGTTTTCGGATGTTCTTTATTGCGAGAACCGCGTTAATCGAA TCGGCTTGAACCGGGCAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCT GCGGAAGGATCATTATTGAGCTAATTTCTTCCATTTTAATCAGGTCTTTGC TGTTCGTTTCTAAGCATTGACTTGTTCTGGCTTTGAATGGTTTCTAGAGAC GTTTGGAGCAGTCGTTTAAGCGTGACTGTGGTGATAAGCGTTTTACTTTG CTTAGCAGTTCGTTGTTTCTTGAATGCTTAGCGATGAGAATTAAAGAGGT CTGCTGACTCGCCATTTTTGATTGCTAACAAAAACGTTTTGTTTTGATATT TGTGTCACTCGTTGATGCATTATTCAATTATCAAGTCTTATCGGTGGATCAC TCGGTTCGTAGGTCGATGAAAAACGGGGCAAAAACCGTTATTTGGCGTG AATTGCAGACATATTGAGCGCTAAAATTTTGAACGCAAATGGCACTAACA GGGTTATCTGTTAGTATGTTCAATTGAGGGTCTTTTGACTAGAATCTGGCA ATCGGCTGTGATTGCTTTTTCGGAAAGCTACTTTGCTGTGCAGTGAAGTA CCTTTTTGGTATGGCTATTTGATTGTCTAATGGATGTCTGGTTCGCTGTTTC TTGACTAGACGTCTGCAATCATTTGGCTTTGCGTAGTGTTTGAATGATAGG TTAGCGCGTTTCTTGCTAACTGACTTTTGCACAAGCAAGTGTAATACGTTT CTTAAAGTCAGCTATTATTCAATTTGGTTTTCTGACTTGATTTGTCGGTTTA CTGTGCTATGCTCTGTCAATCTTTTCGAACTAGACCTCAATTTGAGCAAGA TTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAGTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACT AGGATTTCCTTAGTACGGGCGAAGTG 58 Phụ lục : Số liệu thống kê sinh học đánh giá độc lực sinh sản chủng tuyến trùng S-DL13 Tính số LC Probit Analysis Data Information N of Cases Valid 11 Missing LOG Transform Rejected Cannot be Done Number of Responses > Number of Subjects Control Group Convergence Information Number of Optimal Iterations Solution Found PROBI 16 Yes T Parameter Estimates Parameter Estimate Std Error Z Sig 95% Confidence Interval Lower Upper Bound Bound soluongIJsgaynhie PROBIT a m Intercept 2.670 281 9.501 000 2.119 3.221 -2.283 333 -6.867 000 -2.616 -1.951 59 a PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10.000 logarithm.) Chi-Square Tests dfb Chi- Sig Square PROBI Pearson Goodness-ofT Fit Test 9.117 427a a Since the significance level is greater than 150, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits b Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases Cell Counts and Residuals Number soluongIJs Number of Observed Expected gaynhiem Subjects Responses Responses Residual Probability 699 45 19 15.222 3.778 338 1.000 45 27 29.270 -2.270 650 1.301 45 35 39.736 -4.736 883 1.477 45 43 42.821 179 952 1.602 45 45 43.961 1.039 977 PROBIT 1.699 45 45 44.454 546 988 1.778 45 45 44.691 309 993 1.845 45 45 44.815 185 996 1.903 45 45 44.884 116 997 10 1.954 45 45 44.925 075 998 11 2.000 45 45 44.950 050 999 60 Confidence Limits Probability 95% Confidence Limits for 95% Confidence Limits for log(soluongIJsgaynhiem)a soluongIJsgaynhiem Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound 010 964 473 1.552 -.016 -.325 191 020 1.219 635 1.890 086 -.197 277 030 1.415 765 2.143 151 -.116 331 040 1.583 880 2.355 200 -.056 372 050 1.734 986 2.544 239 -.006 406 060 1.875 1.086 2.717 273 036 434 070 2.007 1.182 2.878 302 073 459 080 2.133 1.275 3.030 329 106 481 090 2.255 1.366 3.176 353 135 502 100 2.373 1.455 3.317 375 163 521 150 2.931 1.890 3.971 467 276 599 200 3.467 2.325 4.585 540 366 661 PROBIT 250 4.005 2.774 5.192 603 443 715 300 4.559 3.249 5.810 659 512 764 350 5.139 3.758 6.454 711 575 810 400 5.759 4.311 7.137 760 635 854 450 6.429 4.917 7.875 808 692 896 500 7.165 5.590 8.687 855 747 939 550 7.985 6.344 9.598 902 802 982 600 8.915 7.202 10.642 950 857 1.027 650 9.990 8.191 11.868 1.000 913 1.074 700 11.263 9.351 13.356 1.052 971 1.126 750 12.819 10.745 15.232 1.108 1.031 1.183 800 14.807 12.478 17.725 1.170 1.096 1.249 850 17.516 14.754 21.293 1.243 1.169 1.328 61 .900 21.639 18.054 27.061 1.335 1.257 1.432 910 22.772 18.932 28.710 1.357 1.277 1.458 920 24.071 19.926 30.629 1.381 1.299 1.486 930 25.585 21.069 32.904 1.408 1.324 1.517 940 27.388 22.410 35.665 1.438 1.350 1.552 950 29.601 24.028 39.123 1.471 1.381 1.592 960 32.430 26.060 43.649 1.511 1.416 1.640 970 36.280 28.769 49.983 1.560 1.459 1.699 980 42.116 32.769 59.925 1.624 1.515 1.778 990 53.279 40.141 79.937 1.727 1.604 1.903 a Logarithm base = 10 Sự tƣơng quan sản lƣợng IJs số lƣợng IJs gây nhiễm ban đầu chủng S-DL13 Oneway 62 ANOVA SanluongIJs Sum of df Mean Squares Between Sig Square 131 015 Within Groups 007 20 000 Total 138 29 Groups F 40.871 000 Homogeneous Subsets SanluongIJs Duncan soluongIJsgaynhiem N Subset for alpha = 0.05 10.00 20.00 1.9263 30.00 1.9501 40.00 1.9965 100.00 2.0196 2.0196 50.00 2.0221 2.0221 90.00 2.0464 60.00 2.0468 80.00 2.0544 70.00 Sig 1.8703 2.1037 1.000 137 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 63 130 054 1.000 Curve Fit [DataSet1] C:\Users\Admin\Documents\Untitled1.sav Model Description Model Name MOD_1 Dependent Variable SanluongIJs Equation Linear Independent Variable soluongIJsgaynhiem Constant Included Variable Whose Values Label Observations in Plots Unspecified Case Processing Summary N Total Cases 30 Excluded Casesa Forecasted Cases Newly Created Cases a Cases with a missing value in any variable are excluded from the analysis Variable Processing Summary Variables 64 Dependent Independent SanluongIJs soluongIJsgaynhiem Number of Positive Values 30 30 Number of Zeros 0 Number of Negative Values 0 Number of Missing User-Missing 0 Values System-Missing 0 Model Summary and Parameter Estimates Dependent Variable: SanluongIJs Equation Model Summary R Square Linear 615 F 44.680 df1 Parameter Estimates df2 The independent variable is soluongIJsgaynhiem 65 Sig 28 000 Constant 1.902 b1 002