Xác định mối liên quan giữa các đa hình đơn rs3738423 C>T và rs1201807 C>T của gen NPHS2 với một số chỉ tiêu sinh hóa ở bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticoid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ THẾ HOÀNH XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708 (C>T) CỦA GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÁNG CORTICOID LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THẾ HOÀNH XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708 (C>T) CỦA GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÁNG CORTICOID Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Thơm TS Nguyễn Văn Sáng Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành nỗ lực quan tâm giúp đỡ nhiều cá nhân tập thể Nhân dịp hoàn thành luận văn tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: Ban giám hiệu; Phòng đào tạo sau đại học; Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN; Bộ môn Y Dược học sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN; Phòng Kế hoạch tổng hợp, BV Nhi TW; Khoa Xét nghiệm tổng hợp, BV Mắt TW tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thơm - Chủ nhiệm Bộ môn Y Dược học sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN TS Nguyễn Văn Sáng - Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, hai người thầy tận tình hướng dẫn bảo tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn đề tài Cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.16.23 tài trợ cho thực đề tài Xin trân trọng cảm ơn Thầy, Cô hội đồng chấm luận văn có ý kiến đóng góp quý báu, học cho đường nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn Ths BS Phạm Văn Đếm - Bộ môn Y Dược học sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia HN; TS BS Hoàng Anh Tuấn - trưởng Khoa Xét nghiệm tổng hợp, ThS.BS Cao Vũ Thư, anh Bùi Quang Long, cô Nguyễn Ngọc Diệp anh chị đồng nghiệp Khoa Xét nghiệm tổng hợp BV Mắt TW thật động viên giúp đỡ nhiều để hồn thành luận văn Xin bày tỏ lịng biết ơn tới bố mẹ, người thân, vợ nhỏ bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tinh thần tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Cuối xin gửi lời tri ân sâu sắc tới bệnh nhi gia đình họ tham gia vào nghiên cứu Sự đóng góp họ giúp tơi hồn thành luận văn Hà nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Đỗ Thế Hoành LỜI CAM ĐOAN Tên tơi Đỗ Thế Hồnh, cao học khóa 24, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan: Đây Luận văn thân thực hướng dẫn TS Vũ Thị Thơm TS Nguyễn Văn Sáng Nghiên cứu không trùng lặp với nghiên cứu công bố Việt Nam Các số liệu, thông tin kết luận văn hồn tồn xác, trung thực, xác nhận sở nơi nghiên cứu Hà nội, ngày tháng Học viên Đỗ Thế Hoành năm 2017 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT Ở TRẺ EM 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 1.1.3 Sinh lý bệnh HCTHTPTE 1.2 MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA TRONG HCTH 10 1.2.1 Protein toàn phần máu protein nước tiểu 24h 10 1.2.2 Albumin máu nước tiểu 11 1.2.3 Ure máu nước tiểu 11 1.2.4 Creatinin máu nước tiểu 12 1.2.5 Một số nghiên cứu số sinh hóa bệnh HCTH 13 1.3 ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 13 1.3.1 Khái niệm đa hình đơn nucleotit 13 1.3.2 Protein podocin gen mã hóa 15 1.3.3 Đa hình đơn rs12401708 C>T rs3738423 C>T gen NPHS2 16 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID 18 GEN NPHS2 18 1.4.1 Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert 18 1.4.2 Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson 19 1.4.3 Giải trình tự máy tự động 19 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỂN GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.2 Các số nghiên cứu 22 2.2.3 Phương tiện nghiên cứu 22 2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 25 2.2.5 Xử lý số liệu 29 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30 3.2 MỘT SỐ KẾT QUẢ SINH HÓA MÁU VÀ NƯỚC TIỂU 33 3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA 36 3.3.1 Kết đo độ hấp thụ quang (OD) 37 3.3.2 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số 38 3.4 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI EXON VÀ EXON CỦA GEN NPHS2 38 3.4.1 Kết khuếch đại exon 38 3.4.2 Kết khuếch đại exon 39 3.5 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 40 3.5.1 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen hai đa hình đơn rs3738423 40 3.5.2 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen đa hình rs12401708 42 3.6 MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 VÀ RS12401708 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HCTHTP KHÁNG CORTICOSTEROID 43 3.6.1 Mối tương quan đa hình đơn RS3738423 số tiêu sinh hóa 44 3.6.2 Mối tương quan đa hình đơn RS12401708 số tiêu sinh hóa 48 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphotphat ADH Antidiuretic hormone bp base pair DBSNP Database single nucleotide polymorphism ddNTP Dideoxynucleotide triphosphat dNTP Deoxynucleotide triphosphat DNA Deoxyribonucleotide acid DDW Deionized Distilled Water EDTA Ethylene diamin tetraacetic acid HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát HCTHTPTE Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em NCC Nhóm nhạy cảm với corticosteroid NKC Nhóm kháng corticosteroid nt nucleotide position Kb Kilo base pair kDa kilo Dalton OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNA Acid ribonucleic rs Reference single nucleotide polymorphism SNP Single nucleotide polymorphism SE Standard error of mean TAE Tris acetate ethylene diamin tetraacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Mồi exon exon gen NPHS2 .28 Bảng 2.2 Nồng độ thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 3.1 Phân bố tuổi giới tính nhóm đối tượng nghiên cứu 31 Bảng 3.2 Tuổi khởi phát số lần tái phát tháng bệnh 31 Bảng 3.3 Mức độ tái phát bệnh 32 Bảng 3.4 Kết phân tích protein, albumin, creatinin ure máu, protein niệu tỷ lệ protein/creatinin niệu 34 Bảng 3.5 Một số kết đo nồng độ độ tinh sản phẩm tách DNA 37 Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs3738423 41 Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen rs12401708 42 Bảng 3.8 Nồng độ protein, albumin, creatinin ure máu kiểu gen RS3738423 44 Bảng 3.9 Nồng độ protein niệu tỷ lệ protein/creatinin niệu kiểu gen RS3738423 46 Bảng 3.10 Nồng độ protein, albumin, creatinin ure máu kiểu gen rs12401708 48 Bảng 3.11 Nồng độ protein tỷ lệ protein/creatinin niệu kiểu gen rs12401708 50 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng bệnh nhân HCTHTPTE 30 Biểu đồ 3.2 So sánh nồng đồng protein máu, albumin máu, creatinin máu, ure máu, protein niệu tỷ lệ protein/creatinin niệu nhóm NCC NKC .35 Biểu đồ 3.3 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu kiểu gen rs3738423 nhóm NCC 47 Biểu đồ 3.4 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu kiểu gen rs3738423 nhóm NKC 47 Biểu đồ 3.5 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu kiểu gen rs12401708 nhóm NCC 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ tả đa hình đơn nuclotide (SNP) 14 Hình 1.2 Cấu tạo màng cầu thận 15 Hình 1.3 Vị trí gen NPHS2 NST số người 16 Hình 1.4 Cấu trúc đoạn exon intron gen NPHS2 16 Hình 3.1 Hình ảnh điện di gel agarose 0,7% sản phẩm tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần 38 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phầm PCR exon 38 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 39 Hình 3.4 Kết giải trình tự cho rs3738423 40 Hình 3.5 Kết giải trình tự cho rs12401708 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Sinh lý bệnh HCTH Sơ đồ Sơ đồ nghiên cứu 25 MỞ ĐẦU Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em (HCTHTPTE) hội chứng lâm sàng sinh hóa xuất có tồn thương cầu thận nhiều nguyên nhân khác nhau, thường không rõ ràng đặc trưng bởi: protein niệu tăng cao, protein máu giảm, albumin máu giảm, lipit cholesterol máu tăng Bệnh thường gặp trẻ em, 90% trường hợp xảy độ tuổi 16 với tỷ lệ trẻ nam mắc nhiều trẻ nữ Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi theo địa dư, tuổi, giới tính chủng tộc Khoảng 20% bệnh nhân không đáp ứng sau điều trị với corticoid (HCTH kháng steroid) thuốc ức chế miễn dịch khác, 50% bệnh nhân tiến triển thành suy thận bệnh thận giai đoạn cuối gây tử vong ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, sống trẻ Ngoài dấu hiệu lâm sàng dịch tễ học như: phù nhanh tồn thân, mềm, ấn lõm khơng đau, tiểu máu…thì số tiêu sinh hóa cận lâm sàng dựa theo đặc điểm sinh lý bệnh có nghĩa quan trọng cơng tác chẩn đốn, theo dõi điều trị cho bệnh nhân HCTH Thận hư bệnh mạn tính, diễn biến với đợt bộc phát nên bệnh nhân cần phải theo dõi điều trị lâu dài (ít năm sau bệnh thuyên giảm) Nhờ tiến ngành sinh học phân tử người ta nghiên cứu sâu chế bệnh học HCTHTPTE để từ đề biện pháp điều trị hiệu bệnh nhân Hiện nay, xác định gen mã hóa cho protein có vai trị đảm bảo chức lọc cầu thận, có protein podocin mã hóa gen NPHS2 Gen NPHS2 gồm exon, nằm vai dài nhiễm sắc thể số người (1q25-q31) Bằng chứng thực nghiệm nhà khoa học chứng minh đột biến gen NPHS2 có liên quan chặt chẽ đến HCTH Nhiều nghiên cứu đa hình đơn nucleotid rs3738423 C>T cho thấy SNP xuất ở cộng đồng người Châu Âu, Châu Á có tác dụng bảo vệ; rs12401708 C>T SNP báo cáo lên ngân hàng liệu database năm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Hà Phan Hải An (2015), Hội chứng thận hư, Bệnh học nội khoa, Tập 1, NXB Y học, tr 324-333 Nguyễn Đạt Anh, Nguyễn Thị Hương (2010), Các xét nghiệm thường quy áp dụng thực hành lâm sàng, Nhà xuất y học Bộ môn Y sinh học - di truyền (2006), Thực tập di truyền y học, Trường Đại học Y Hà Nội, tr 37-38 Hồ Thị Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Hà Nội, tr.190-197, 200-204 Tạ Thị Hòa (1981), Theo dõi diễn biến lâu dài HCTH tiên phát trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Xuân Hưng, Nguyễn Ngọc Lương (2010), Sinh học phân tử tế bào, 1, NXB trẻ Hà Hoàng Kiệm (2008), Thận học lâm sàng, NXB Y học Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 41-48 Trần Đình Long, Lê Nam Trà, Đỗ Bích Hằng (1994), "Tình hình bệnh thận - tiết niệu trẻ em điều trị viện Nhi 1981-1990", Kỷ yếu cơng trình nhi khoa Bệnh viện Nhi, tr 161-162 10 Vũ Vân Nga (2016), Xác định đa hình đơn gen NPHS2 tượng kháng corticosteroid trẻ em mác hội chứng thận hư tiên phát, Đại học Y Hà Nội 11 Phạm Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị Thùy Linh Vũ Vân Nga, Đỗ Thế Hoành, Phạm Văn Đếm, Đinh Đoàn Long, Vũ Thị Thơm (2017), "Xây dụng quy trình phân tích gen NPHS2 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa Y Dược, 33(2), tr 8-13 12 Nguyễn Ngọc Sáng (1999), Đánh giá hiệu điều trị Methylprednisolon thay đổi miễn dịch trước sau điều trị hội chứng thận hư tiên phát trẻ em, Luận Án Tiến sỹ, Đại học Y Hà Nội 13 Nguyễn Thị Diệu Thúy (1996), Đặc điểm lâm sàng biến đổi sinh học suy thận cấp HCTH tiên phát trẻ em, Luận văn thạc sỹ y học, Đại học Y Hà Nội 14 Đoàn Thị Thắm (2012), Nhận xét kết điều trị hội chứng thận hư tiên phát trẻ em, Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y Hà Nội 15 Lê Nam Trà (1999), "Điều trị hội chứng thận hư tiên phát trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, 8(2), tr 101-105 54 16 Lê Nam Trà (2006), Hội chứng thận hư, Bài giảng nhi khoa tập II, NXB Y học, tr 157-167 17 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 18 Albert A., Epstein M.D (1952), "Concerning the causation of edema in chronic parenchymatous nephritis: Method for its alleviation", The American Journal of Medicine, 13(15), pp 556-561 19 Beata Banaszak Pawel Banaszak (2012), "The increasing incidence of initial steroid resistance in childhood nephrotic syndrome", Pediatric Nephrol, 27, pp 927-932 20 Besbas N., Saatci O., Topaloglu R., Bakkaloglu A (1992), "Long-term followup in children with steroid-resistant nephrotic syndrome, 1992", Clin Pediatr, 31, pp 283-288 21 Boute N., Roselli S., Gribouval O., Benessy F., Lee H., Fuchshuber A., Dahan K., Gubler M C., Niaudet P., Antignac C (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid resistant nephritic syndrome", Nature genetics, 24, pp 349-354 22 Caridi G., Carrea A., Bertelli R., Di Duca M., Catarsi P., Artero M., Carraro M., Zennaro C., Candiano G., Musante L., Seri M., Ginevri F., Perfumo F., Ghiggeri G M (2001), "Prevalence, genetics and clinical features of patients carying podocin mutations on steroid-resistane nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephro, 1(13), pp 388-393 23 Dai Y., Gao P., Yang H., Liu W D (2011), "NPHS2 variation in Chinese southern infants with late steroid-resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4, pp 30-33 24 Dhandapani M C., Rengaswamy N B., Venkatesan V., Gowrishankar K., Ekambaram S., Sengutavan P., Perumal V (2016), "Report of novel genetic variation in NPHS2 gene associated with idiopathic nephritic syndrome in South Indian children", Clinical and experimental nephrology, 21(1), pp 127-133 25 Müller F., Morbus Brightii (1905), Verland Dtsch Pathol Ges 9, pp.64–99 26 Franceschini N., Kopp J B., North K E., McKenzie L., Winkler C (2006), "NPHS2 gene, nephritic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis: a huge review", Genetics in Medicine, 8, pp 63-75 27 Gianluca Caridi Francesco Perfumo, Gian Marco Ghiggeri (2005), "NPHS2 (podocin) mutations in nephrotic syndrome", Clinical Spectrum and Fine Mechanism, Pediatric Research, 57, pp 54-61 55 28 Goszczyk A., Bochniewska V., Jung A., Straz Zebrowska E (2011), The effect of treatment methods on frequency of requency of relapse in nephritic syndrome in children, Poland 29 Tae Sun Ha (2013), "World J Nephrol", Roles of adapter protein in podocyte biology, 2(1), pp 1-10 30 Sadeghi-Bojd S., Hashemi M., Aryanezhad S., Rezaei M (2016), "Association of Endothelin-1 rs5370 G>T gene polymorphism with the risk of nephrotic syndrome in children", Journal of Nephropathology, 6(3), pp 138-143 31 Hee Gyung Kang, Hae Il Cheong (2015), "Nephrotic syndrome: What's new, What's hot?", Korean J Pediatr, 58, pp 275-282 32 Hinkes B., Heeringa S., Vlangos C., Mucha B., Gbadegesin R., Liu J., Hasselbacher K., Ozaltin F., Hildebrandt F., Members of the APN Study Group (2008), "Specific podocin mutations corelate with age of onset in steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 19, pp 365-371 33 Huber T B., Simons M., Hartleben B., Sernetz L., Schimidts M., Gundlach E., Saleem M A., Walz G., Benzing T (2003), "Molecular basis of the functional podocine-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Human Molecular Genetics, 12, pp 3397-3405 34 Kitamura A., Iijima K., Tsukaguchi H., Araki J., Hattori M., Ikeda M., Honda M., Nozu K., Nakazato H., Yoshikawa N., Kagami S., Muramatsu M., Choi Y., Cheong H I., Doi T (2006), "Genetics and clinical features of 15 Asian families with steroid-resistant nephrotic syndrome", Nephrol Dial Transplant, 21(11), pp 3133-3138 35 Comai L., Henikoff S (2006), "TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery", The plant journal, 45(4), pp 684-694 36 Ng Jun Li (2012), Genetics of nephrotic syndrome in Singapore paediatrics patiens, NUS a thesis submitted for the degree of master of science department of paediatrics nationnal university of Singapore 37 Lombel R M., Gipson D S., Kidney Disease: Improving Global Outcomes Hodson E M (2012), "Treatmen of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", pediatr Nephrol, 2304(8) 38 Mattoo T K., al-Harbi M S., Mahmood M A (1990), "Nephrotic syndrome in Saudi children clinicopathological study of 150 cases", PediatrNephrol, 4, pp 517-519 39 Mishra O P., Singh A K., Kakani N., Narayan G., Abhinay A., Prasad R, Batra V V (2014), "NPHS2 R229Q Polymorphism in Steroid Resistant Nephrotic Syndrome: Is it Responsive to Immunosuppressive Therapy?", Journal of Tropical Pediatrics, 60(3), pp 231–237 56 40 Otukesh H., Ghazanfari B., Fereshtehnejad S M., Bakhshayesh M., Hashemi M., Hoseini R., Chalian M., Salami A., Mehdipor L., Rahiminia A (2009), "NPHS2 mutation in children with steroid - resistant nephrotic syndrome", Iranian Journal of Kidney Diseases, 3, pp 99-102 41 Niaudet P (2004), "Podocin and nephrotic syndrome: implication for the clinician", J Am Soc Nephrol, 15, pp 557-573, 832-834 42 Pereira A C., Mota G F., Pereira A B., Cunha R S., Herkenhoff F L., Pollak M R., Mill J G., Krieger F E (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney International, 65(3), pp 1026-1030 43 Bright R., Richard T (1827), Resport of medical cases selected with a view to illustrating the symptoms and cure of diseses by reference to morbid anatomy, London: Longman Green, pp 75-85 44 Rachmadi D., Monnens L., Melani A ( 2015), "NPHS2 Gene Mutation and Polymorphisms in Indonesian Children with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp 27-33 45 Roselli S., Gribouval O., Moutkine I., Benmerah A., Antignac C (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", Trafic 2004, 5, pp 37-44 46 Rainer G Ruf, Anne Lichtenberger (2004), "Anne Lichtenberger", Anne Lichtenberger, 15, pp 722-732 47 Schork NJ Fallin D., Lanchbury S (2000), "Singel nucleotide polymorphism and the future of genetic epidemiology", Clin Gener 2000, 58, pp 250-264 48 Sharma J., Vasudevan A (2014), Normal reference values of blood and urine chemistries, Manual of Pediatric Nephrology, London, UK, pp 533–610 49 Shatha Hussain Ali, Hussein Ali Saheb Rasha Kasim Mohammed, Ban A Abdulmajeed (2017), "R229Q Polymorphism of NPHS2 Gene in Group of Iraqi Children with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", International Journal of Nephrology 50 Simons M., Kriz W., Schwarz K., Miettinen A., Reiser J., Mundel P., Holthofer H (2001), "Involvement of lipid rafts in nephrin phosphorylation and organization of the glomerular slit diaphragm", Am J Pathol, 159, pp 106977 51 Tarshish P., Bernstein J., Tobin J.N., Edelmann C M J (1997), "Prognostic significance of the early course of minimal change nephrotic syndrome: report of the International Study of Kidney Disease in Children", J Am Soc Nephrol, 8(5), pp 769–776 57 52 Vignal A., SanCristobal M., Milan D., Eggen A (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genet Sel Evol, 34(3), pp 275-305 53 Weber S., Esquivel E L., Gribouval O., Moriniere V., Tete Marie-Josephe, Legendre C., Niaudet P., Antignac C (2004), "NPHS2 mutations analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and low post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp 571-579 54 Zihua Yu, Jianping Huang Jie Ding, Yong Yao, Huijie Xiao, Jingjing Zhang, Jingcheng Liu, Jiyun Yang (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroidresistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrol Dial Transplant, 20, pp 902-908 55 Zhu L., Wang C D., Yu L., Lv J C., Zhang H., Wang H Y (2009), "Genetic effect of the NPHS2 gene variants on proteinuria in minimal change disease and immunoglobulin A nephropathy", Nephrology (Carlton), 14(8), pp 728734 56 Zsuzsanna G., Tory K., Duicu C., Kiss E (2013), "Anne Lichtenberger", Anne Lichtenberger, 46(3), pp 299-304 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1: THÔNG BÁO CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC Phụ lục 2: QUY TRÌNH TÁCH DNA TỔNG SỐ BẰNG E.Z.N.A BLOOD MINI KIT Phụ lục 3: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU Phụ lục 4: KẾT QUẢ OD 128 MẪU DNA TỔNG SỐ Phụ lục QUY TRÌNH TÁCH DNA TỔNG SỐ BẰNG E.Z.N.A BLOOD MINI KIT Rã đông mẫu máu đá để hóa chất nhiệt độ phịng Lắc ống máu, hút 25µl máu vào ống lý tâm vơ trùng Thêm 25µl OB Protease Solution 250µl BL Buffer, vortex 10 giây Ủ 65oC 10 phút Chú ý: sau ủ phút, vortex 15 giây Thêm 260µl Ethanol 100%, vortex 20 giây Ly tâm 1000 vòng/phút 15 giây để đảm bảo mẫu khơng dính thành nắp ống Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2ml Chuyển toàn mẫu vào cột (để pipet mức 790µl) Ly tâm 14.000 vịng/phút phút 10 Bỏ dịch lọc Collection Tube 11 Lắp Hibind DNA Mini Column vào Collection Tube 2ml 12 Thêm 500µl HBC Buffer 13 Ly tâm 14.000 vịng/phút phút 14 Bỏ dịch lọc sử dụng lại Collection Tube 15 Thêm 700µl DNA Wash Buffer 16 Ly tâm 10.000g 17 Bỏ dịch lọc sử lại Collection Tube 18 Lặp lại bước từ 14 đến 16 cho bước rửa thứ với DNA Wash Buffer 19 Ly tâm Hibind DNA Mini Column 14.000 vòng/phút phút để làm khô cột 20 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml 21 Thêm 100µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 65oC), ủ 65oC phút 22 Ly tâm 14.000 vòng/phút phút 23 Thêm 50µl Elution Buffer phút nhiệt độ phòng 24 Ly tâm 14.000 vòng/phút phút 25 Thu bảo quản DNA -20oC Phụ lục DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU Họ tên Giới Tuổi theo tháng Mã bệnh án Mã nghiên cứu Hoàng Trường G Nam 30 14057109 Nguyễn Thị Thu T Nữ 156 14057109 Trần Kỳ A Nữ 84 14324321 Đào Đức N Nam 13 1412076 Trần Duy Q Nam 84 12010952 Trần Minh K Nam 22 13272173 Ngô Mai T Nữ 48 1365113 Tống Văn Bảo N Nam 84 13014385 10 Lưu Hương G Nữ 36 1272332 11 10 Kiều Thị Hải M Nữ 108 10311182 12 11 Trần Ngọc H Nữ 19 1441181 13 12 Nguyễn Quốc C Nam 60 12373036 14 13 Nguyễn Vũ Ngọc K Nam 120 15655257 15 14 Lê Bá Đ Nam 48 15048355 16 15 Thái Hữu L Nam 120 12140932 17 16 Vũ Gia L Nữ 60 1155156 18 17 Đỗ Thị H Nữ 180 10188213 19 18 Linh Minh H Nam 48 1159764 20 19 Phạm Phát L Nam 1522067 21 STT 20 Vũ Đức S Nam 24 1540593 22 21 Bàn Phúc T Nam 60 15013604 23 22 Tô Đức T Nam 36 1548717 24 23 Phạm Thị T Nữ 108 13226994 25 24 Nguyễn Quang K Nam 22 14263657 26 25 Trần Thị T Nữ 96 110445724 27 26 Lê Tuyền C Nữ 96 9178578 28 27 Vũ Thị T Nữ 156 14549602 29 28 Bùi Quý T Nam 60 14099239 30 29 Trần Như Q Nam 48 12134331 33 30 Ngô Minh H Nam 36 14913054 34 31 Trần Thị T Nữ 156 15047747 35 32 Nguyễn Đình Quốc M Nam 40 15021680 36 33 Trần Bích Nữ 24 14201553 37 34 Phạm Vũ Hoàng A Nam 72 8028096 38 35 Vương Ngọc Anh Đ Nam 72 13247781 39 36 Nguyễn Ngọc M Nữ 36 15075971 41 37 Vũ Tiến Đ Nam 48 15091226 42 38 Nguyễn Phương D Nữ 60 12420282 43 39 Lê Chung H Nam 60 12012758 44 40 Nguyễn Phương A Nữ 96 6149804 46 41 Đổng Sỹ N Nam 84 1131667 47 42 Phạm Hoàng A Nam 84 15092824 48 43 Bùi Thị Mai P Nữ 24 14098246 49 44 Nguyễn An K Nam 84 15091226 50 45 Hoàng Phúc H Nam 84 12282569 51 46 Nguyễn Vũ Tùng A Nam 48 13017764 52 47 Đặng Sỹ H Nam 27 14249115 53 48 Trần Hữu Trung H Nam 36 1562488 54 49 Phạm Anh V Nam 84 15959621 55 50 Lù Văn T Nam 192 14154999 57 51 Ngô Lệ Q Nữ 36 12288479 58 52 Nguyễn Văn Q Nam 156 13091482 59 53 Nguyễn Thị M Nữ 108 14787434 60 54 Trương Ngọc H Nữ 168 15098519 61 55 Nguyễn Xuân P Nam 60 13754482 63 56 Chu Anh Đ Nam 84 11156232 64 57 Lê Ngọc T Nữ 96 15173540 65 58 Nguyễn Quốc V Nam 144 15216008 66 59 Bùi Trung H Nam 21 13345118 67 60 Nguyễn Tấn D Nam 36 15698321 68 61 Phan Hoàng B Nam 72 14578711 72 62 Hoàng Ngọc H Nam 60 15268347 75 63 Lê Hữu T Nam 36 16216630 76 64 Vũ Đặng Lâm A Nữ 11 15418678 78 65 Nguyễn Hoàng H Nam 36 12346758 79 66 Nguyễn Văn T Nam 60 15031374 80 67 Đinh Ngọc K Nam 168 9654541 81 68 Nguyễn Tú M Nam 84 9090541 82 69 Hà Hải N Nam 61 15401660 83 70 Nguyễn Thị H Nữ 144 15419293 85 71 Đỗ Quang M Nam 36 15127786 88 72 Hoàng Lê Anh T Nam 84 13148391 90 73 Trịnh Duy T Nam 84 10021888 91 74 Nguyễn Anh K Nam 84 14376414 92 75 Lê Ngọc Minh T Nam 48 15429714 93 76 Đinh Gia L Nam 180 7567891 95 77 Mã Văn T Nam 84 12091887 96 78 Nguyễn Thị Vân A Nữ 156 11564534 98 79 Nguyễn Hoàng L Nam 24 15893412 99 80 Lê Đình H Nam 84 8030107 100 81 Nguyễn Thu H Nữ 108 11274618 101 82 Nguyễn Văn T Nam 24 15443427 102 83 Lê Thành N Nam 120 15191961 103 84 Hoàng Xuân T Nam 108 15448091 105 85 Hà Thùy L Nữ 20 15031163 106 86 Nguyễn Hoàng H Nam 36 12346758 107 87 Nguyễn Như T Nam 21 150832325 109 88 Nguyễn Thu H Nữ 72 15471902 110 89 Lý Tiến V Nam 72 15466754 111 90 Kiều Quang H Nam 72 9204549 112 91 Trần Tiến H Nam 36 15471981 113 92 Hoàng Minh Đ Nam 168 5093951 114 93 Trần Xuân Q Nam 36 12144943 115 94 Ngô Tuấn H Nam 96 12276423 116 95 Đỗ Văn H Nam 72 150468754 117 96 Phạm Thị Bảo C Nữ 25 15471998 118 97 Vũ Văn D Nam 48 15477328 119 98 Lê Ngọc Minh T Nam 48 159632689 120 99 Lê Phương Ng Nữ 19 15693567 121 100 Thạch Phúc T Nam 60 13002230 122 101 Hứa Xuân T Nam 72 15048796 123 102 Nguyễn Văn T Nam 144 15482293 124 103 Tạ Bảo L Nam 60 15484670 125 104 Phan Huy Nhật M Nam 10 15472951 126 105 Trần Khánh G Nữ 96 15478474 127 106 Đặng Duy A Nam 16 150507512 128 107 Hoàng Hải N Nam 96 15339756 129 108 Nguyễn Thiên A 109 Nam 65 1620798 130 Đào Yến N Nữ 42 161579878 131 110 Tào Minh Đ Nam 108 160064623 132 111 Lê Quỳnh A Nữ 68 130018648 133 112 Trương Quang B Nam 96 160003947 135 113 Nguyễn Nhật T Nam 36 130030728 137 114 Nguyễn Huy H Nam 48 160088801 138 115 Hoàng Minh Đ Nam 96 160081160 139 116 Nguyễn Trường T Nam 96 13252878 140 117 Nguyễn Gia H Nam 60 160082327 141 118 Trần Đức T Nam 84 1173669 143 119 Lê Xuân K Nam 23 15175177 144 120 Hoàng Thị H Nữ 144 15842395 145 121 Trương Hoàng H Nam 48 160056100 146 122 Nguyễn Nhật T Nam 23 1330728 147 123 Vũ Đức M Nam 41 16121216 148 124 Ngô Văn D Nam 40 130303164 149 125 Lê Đình H Nam 72 150398425 151 126 Trần Lưu Trí D Nam 36 16113523 152 127 Vũ Đăng K Nam 60 16113262 153 128 Trịnh Tuấn K Nam 18 15403320 154 Phục lục KẾT QUẢ OD 128 MẪU DNA TỔNG SỐ Mã nghiên cứu OD260/280 Mã nghiên cứu OD260/280 Mã nghiên cứu (ng/µl) (ng/µl) (ng/µl) 186,000 1,931 23 125,650 1,852 47 95,700 1.957 62,550 1,853 24 65,100 1,852 48 63,050 2.002 58,050 1,797 25 31,700 1,761 49 11,200 1.902 59,000 1,832 26 160,300 1,829 50 146,400 1.901 35,400 1,723 27 61,350 1,771 51 112,750 1.932 57,050 1,840 28 68,550 1,876 52 169,350 1.916 88,000 1,833 29 87,200 1,910 53 105,250 1.975 10 49,400 1,830 30 125,150 1,886 54 90,500 2.025 11 72,100 1,828 33 77,400 1,972 55 87,500 1.910 12 64,100 1,834 34 34,650 2,126 57 60,000 1.862 13 66,800 1,838 35 74,950 1,949 58 106,000 1.859 14 83,500 1,835 36 105,250 1,903 59 59,100 2.017 15 34,900 1,776 37 282,250 1,866 60 89,300 1.882 16 75,300 1,848 38 92,450 1,938 61 156,500 1.854 17 12,700 1,837 39 157,250 1,862 63 202,000 1.852 18 55,700 1,814 41 91,550 1,942 64 65,000 1.898 19 105,900 1,827 42 189,300 1,908 65 164,800 1.865 20 65,000 1,860 43 126,800 1,836 66 82,850 2.023 21 123,900 1,892 44 128,050 1,911 67 353,650 1.858 22 119,250 1,856 46 60,600 2,000 68 95,950 2.016 CDNA CDNA CDNA OD260/280 72 78,900 1,779 106 138,100 1,843 131 89,550 1.916 75 15,550 1,865 107 101,000 1,796 132 32,950 2.175 76 90,600 1,872 109 108,500 1,869 133 77,700 1.962 78 166,400 1,850 110 97,100 1,873 135 128,700 1,91 79 96,650 1,910 111 130,350 1,873 137 121,550 1.846 80 110,85 2,165 112 61,150 2,347 138 58,200 1.836 81 67,850 1,829 113 95,650 1,838 139 63,250 2.014 82 149,750 1,871 114 77,950 2,230 140 56,000 1.968 83 95,700 1,935 115 231,05 1,876 141 65,300 2.047 85 90,950 1,839 116 65,850 2,335 143 84,450 1.868 88 83,950 1,833 117 94,400 1,855 144 78,550 1,861 90 146,500 1,884 118 110,750 1,819 145 82,950 1.860 91 126,250 1,93 119 101,400 1,829 146 47,900 1.860 92 71,400 2,122 120 143,600 1,859 147 49,800 1.890 93 103,800 1,968 121 53,200 1,921 148 34,450 1.867 95 60,150 2,175 122 58,650 2,026 149 40,350 1.758 96 91,550 2,064 123 71,700 1,846 151 70,500 1,868 98 104,500 2,057 124 133,400 1,849 152 77,300 1,874 99 64,400 2,248 125 140,550 1,851 153 52.900 1.856 100 106,100 1,801 126 61,650 1,819 154 96,900 1,867 101 159,100 1,793 127 49,700 1,807 102 109,900 1,852 128 57,800 1,806 103 82,800 1,765 129 93,55 1,849 105 179,550 1,872 130 69,250 1,976 ... "Xác định mối liên quan đa hình đơn nucleotid rs3738423 C>T rs12401708 C>T gen NPHS2 với số tiêu sinh hóa bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticoid" với hai mục tiêu sau: Xác. .. NHI? ?N - ĐỖ THẾ HOÀNH XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708 (C>T) CỦA GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI... RS3738423 VÀ RS12401708 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HCTHTP KHÁNG CORTICOSTEROID 43 3.6.1 Mối tương quan đa hình đơn RS3738423 số tiêu sinh hóa 44 3.6.2 Mối tương quan đa