Trang 1 Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐÀM VĂN QUÝ XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 CỦA GEN NPHS2 VỚI CHỈ SỐ PROTEIN/CREATININ NIỆU Ở BỆNH NHÂN MẮC HỘ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu gồm 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương tự nguyện tham gia nghiên cứu
Từ tháng 09/2015 đến tháng 06/2016, các bệnh nhân điều trị tại khoa Thận - Tiết Niệu của Bệnh viện Nhi Trung Ương đã được chẩn đoán Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012, với chỉ số protein niệu ≥.
50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 gam/lít, Protid máu ≤ 56 gam/lít [27, 28]
- Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác
- Tự nguyện tham gia nghiên cứu
- HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc…)
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
✓ Chia nhóm bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, chọn ra 03 nhóm gồm:
- Nhóm nhạy cảm (n= 58): Gồm 58 bệnh nhi mắc HCTHTP nhạy cảm với corticosteroid
- Nhóm kháng thuốc sớm (n= 56): Gồm 56 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng sớm với thuốc corticosteroid
- Nhóm kháng thuốc muộn (n= 35): Gồm 35 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng muộn với thuốc corticosteroid
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2015 đến tháng 3/2017 tại Khoa Thận - Lọc máu và phòng xét nghiệm sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương, nơi chuyên chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân Phân tích gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc Các chỉ tiêu nghiên cứu
Dữ liệu lâm sàng bao gồm các thông tin quan trọng như tuổi, giới tính, lý do nhập viện, bệnh sử và tiền sử bệnh Ngoài ra, các thông số về cân nặng, chiều cao, huyết áp, tình trạng sốt và phù cũng cần được ghi nhận Khi khám, cần chú ý đến các thông tin liên quan đến tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và tiết niệu để đánh giá tình trạng sức khỏe tổng quát của bệnh nhân.
- Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu
- Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423
Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)
For electrophoresis, essential chemicals include Ultra Pure Agarose from Invitrogen, TAE 1X, and Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Disodium Salt Dihydrate from Affymetrix Additionally, 6X DNA loading dye from ThermoScientific, GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (code: SM0321) from ThermoScientific, and Lambda DNA/HindIII Marker (code: SM0103) from ThermoScientific are crucial Tris base is sourced from Bio Basic, while Acetic Acid is obtained from Merck.
The chemicals used for PCR include primers synthesized by IDT, USA; Pfu DNA polymerase from Thermo Scientific; a 2 mM dNTP Mix also from Thermo Scientific; and deionized water supplied by Omega Biotek.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Eppendorf pipettes ranging from 0.5 µl to 1000 µl, along with Thermo tips for 10 µl, 200 µl, and 1000 µl, are essential for precise liquid handling Additionally, Thermo provides 1.7 ml Eppendorf tubes and 0.2 ml PCR tubes for sample storage and amplification The Cole-Parmer electrophoresis system from the USA and the Prime Thermal Cycler from the UK enhance molecular biology applications For optimal sample preservation, the Panasonic -30°C refrigerator from Japan is recommended The EBA 21 centrifuge from Hettich Zentrifugen in Germany, along with the VELP Scientifica shaker from Europe, supports effective sample processing Lastly, the Cole-Parmer gel documentation system and the NP80 Nanophotometer from Germany are vital for analyzing and quantifying nucleic acids.
Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h yêu cầu thu thập toàn bộ lượng nước tiểu trong 24 giờ Bô đựng nước tiểu cần có nắp đậy, được rửa sạch và sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc Trước khi lấy mẫu, bệnh nhân cần tắm rửa và vệ sinh sạch sẽ bộ phận sinh dục-tiết niệu Vào 6 giờ sáng, bệnh nhân đái bỏ lần đầu và bắt đầu ghi thời gian Trong suốt ngày và đêm, tất cả nước tiểu, bao gồm cả lượng nước tiểu lúc đại tiện, phải được gom vào bô Vào 6 giờ sáng hôm sau, bệnh nhân đi tiểu lần cuối vào bô Sau khi thu thập, đo thể tích nước tiểu trong 24 giờ và lấy 5ml để làm xét nghiệm, đồng thời bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5ml).
Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu cần được lấy vào buổi sáng và chưa ăn Cần lấy từ 1,5 - 2ml máu tĩnh mạch và đựng trong ống nghiệm có chứa Heparin để chống đông Bệnh phẩm phải được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để tiến hành phân tích.
Để phân tích gen, cần lấy 2ml máu toàn phần trong ống nghiệm chứa EDTA và bảo quản ở -20°C cho đến khi sử dụng Mẫu máu phải được ghi nhãn đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi và ngày lấy mẫu Tất cả thông tin liên quan đến mẫu máu của bệnh nhân cần được lưu trữ trong sổ bàn giao mẫu và nhật ký thí nghiệm tách DNA tổng số.
Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu
Bệnh phẩm được phân tích tại Khoa Sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương, nơi thực hiện xét nghiệm cho bệnh nhân tại các mốc thời gian khác nhau, bao gồm khi vào viện và khi ra viện.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU The study involved patients who were discharged from the hospital after one month and again after six months Key biochemical parameters analyzed included urine protein concentration, urine protein/creatinine ratio, blood protein levels, serum albumin, and serum creatinine, using the AU2700 automated biochemical analysis system (Beckman Coulter).
Phân tích đa hình gen NPHS2
Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1
Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết được thực hiện bằng cách điện di trên gel agarose 0,7% với đệm TAE 1X Để kiểm tra sự có mặt của DNA, 5 µl DNA được trộn với 1 µl đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide (50 µg/ml) Quá trình điện di diễn ra với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, và các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định qua việc đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm ADN đạt độ tinh sạch cao khi tỷ lệ OD 260 / OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được mô tả chi tiết trong Phụ lục.
Chúng tôi đã thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR bằng phần mềm PerlPrimer phiên bản 1.1.1, tập trung vào exon 2 và đã đặt hàng tổng hợp hóa học tại công ty IDT (Mỹ).
Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng phương pháp PCR là quá trình tạo ra số lượng lớn đoạn DNA cần phân tích từ DNA khuôn, nhờ vào hoạt động của enzyme ADN polymerase Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra chất lượng thông qua điện di trên gel agarose 1%.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2
Thể tích (àL) Điều kiện (chu trỡnh nhiệt) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3’
Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0,75 Mồi ngược (10 pmol/àl) 0,75
Xác định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 được thực hiện thông qua giải trình tự 20 mẫu sản phẩm, được gửi đến hãng IDT tại Malaysia Kết quả giải trình tự sau đó được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.1.9 để xác định kiểu gen cho từng bệnh nhân.
Cách đọc kiểu gen từ kết quả giải trình tự dựa vào màu sắc của các nucleotide: A được biểu thị bằng màu xanh lá cây, C màu xanh da trời, G màu đen, và T màu đỏ Nếu tại vị trí của mỗi nucleotide chỉ xuất hiện một đỉnh màu, bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp; ngược lại, nếu có hai đỉnh màu, bệnh nhân có kiểu gen dị hợp.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N9) Điều trị tấn công 4 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
Có thuyên giảm không ? Điều trị duy trì 4-8 tuần
Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h Điều trị tiếp 2 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
- Hoặc có tái phát nhưng vẫn đáp ứng thuốc
- Thuyên giảm không hoàn toàn
- Tái phát và kháng thuốc trong những đợt điều trị sau
Không thuyên giảm (Protein/creatinin
Kháng thuốc sớm nV Đặc điểm chung Chỉ số sinh hóa
Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423
Phân tích mối liên quan
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0
Phân tích phương sai (ANOVA) bao gồm hai loại: một nhân tố và hai nhân tố, cùng với việc áp dụng kiểm định Chi-Square (χ²) cho các trường hợp tương ứng Kết quả p 0,05.
Tuổi khởi phát bệnh trung bình và tuổi trung bình của bệnh nhi tại thời điểm nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu là 5,8 ± 3,7 tuổi, với độ tuổi dao động từ 2 tháng đến 16 tuổi Tuổi khởi phát bệnh được ghi nhận là 4,2 ± 2,8 tuổi, bắt đầu từ 2 tháng đến 14 tuổi Đáng chú ý, bệnh nhân nhỏ tuổi nhất nằm trong nhóm kháng thuốc sớm.
Tuổi khởi phát ở các nhóm bệnh nhân, được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân Bệnh nhân Số lượng (n)
Tuổi khởi phát trung bình của bệnh nhân trong nhóm NC là 4,4 ± 2,5, nhóm KTS là 3,8 ± 3,1, và nhóm KTM là 4,4 ± 2,8 Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về tuổi khởi phát giữa ba nhóm bệnh nhân, với chỉ số p > 0,05.
Bàn luận về đặc điểm chung
Nghiên cứu cho thấy hội chứng thận hư phổ biến hơn ở nam giới so với nữ giới, với tỷ lệ nam/nữ lần lượt là 2,7/1 theo Nguyễn Ngọc Sáng, 2/1 theo Trần Hữu Minh Quân, 2,8/1 theo Chang và 2,5/1 theo Wong.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi khởi phát bệnh trung bình là 4,2 ± 2,8 tuổi, không có sự khác biệt so với các nghiên cứu khác Cụ thể, độ tuổi khởi phát của bệnh nhi mắc HCTHTP trong nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm dao động từ 1-8 tuổi, trong khi Patrick Niaudet ghi nhận từ 2-7 tuổi Điều này cho thấy rằng độ tuổi khởi phát và độ tuổi trung bình của bệnh nhân mắc HCTHTP chủ yếu nằm trong giai đoạn tiền học đường và học đường.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Kết quả cận lâm sàng
Trong hội chứng thận hư, các biểu hiện lâm sàng như cao huyết áp và phù, cùng với các chỉ số cận lâm sàng như protein máu, albumin máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinine niệu, đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị Bệnh nhân được phân loại thành ba nhóm dựa trên phản ứng với corticosteroid: nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS) và nhóm kháng thuốc muộn (KTM) Việc theo dõi diễn ra tại nhiều thời điểm, bao gồm lúc nhập viện, ra viện, sau 1 tháng và sau 6 tháng Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu sẽ được trình bày qua các biểu đồ dưới đây.
Biểu đồ 3.2 Giá trị trung bình của protein máu của các nhóm bệnh nhân NC (hình trám), KTS (hình vuông) và KTM (hình tam giác) tại các thời điểm
Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * pT) của exon 2
Không có alen đột p biến Có alen đột biến
Tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không ảnh hưởng đến protein niệu, với các chỉ số p > 0,05 tại các thời điểm xét nghiệm.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.4.4 Chỉ số protein/creatinin niệu
Bảng 3.14 Chỉ số albumin máu theo mức độ đáp ứng corticosteroid và alen đột biến rs3738423 của exon 2
Protein/creatinin niệu (mg/mmol) ( ± SE)
Phân nhóm rs3738423 (C>T) của exon 2
Không có alen đột p biến Có alen đột biến
Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid đã ảnh hưởng đến tỷ lệ protein/creatinin niệu tại thời điểm vào viện và ra viện, với các giá trị p lần lượt là 0,002 và 0,000 Bệnh nhân mang alen đột biến trong nhóm KTS có chỉ số protein/creatinin niệu cao gần gấp đôi so với bệnh nhân không mang alen đột biến Ngược lại, bệnh nhân mang alen đột biến trong nhóm NC và KTM lại có chỉ số protein/creatinin niệu thấp hơn so với nhóm không mang alen đột biến.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bàn luận về đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa
Sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không ảnh hưởng đến các chỉ số protein máu, albumin máu, và protein niệu, nhưng có tác động đến chỉ số protein/creatinin niệu tại thời điểm nhập viện và xuất viện Đa hình thái đơn rs3738423 cho thấy tác dụng bảo vệ bệnh nhân ở nhóm NC và KTM bằng cách giảm protein/creatinin niệu, trong khi ở nhóm bệnh nhân KTS, đa hình thái này lại làm tăng protein/creatinin niệu Điều này dẫn đến giả thuyết rằng đột biến tại vị trí rs3738423 bảo vệ những bệnh nhân có đáp ứng thuốc ban đầu nhưng làm tình trạng bệnh nhân không đáp ứng trở nên xấu hơn Nghiên cứu của Junli cũng cho thấy đa hình này bảo vệ bệnh nhân gốc Trung Quốc, nhưng không thấy tác dụng tương tự ở nhóm bệnh nhân từ miền Bắc và miền Đông Trung Quốc, có thể do sự khác biệt về tần số alen hoặc biến thể di truyền giữa các miền này.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU