LUẬN văn THẠC sĩ xác định mối liên quan giữa đa hình đơn RS3738423 của gen NPHS2 với chỉ số protein creatinin niệu ở bệnh nhân mắc hội chứng thận hư tiên phát tại bệnh viện nhi trung ương

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung Ương tự nguyện tham gia nghiên cứu

- Các bệnh nhân điều trị ở khoa Thận - Tiết Niệu bệnh viện Nhi Trung Ương từ tháng 09/2015 đến tháng 06/2016 được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥

50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 gam/lít, Protid máu ≤ 56 gam/lít [27, 28]

- Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác

- Tự nguyện tham gia nghiên cứu

- HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc…)

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

✓ Chia nhóm bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện, chọn ra 03 nhóm gồm:

- Nhóm nhạy cảm (n= 58): Gồm 58 bệnh nhi mắc HCTHTP nhạy cảm với corticosteroid

- Nhóm kháng thuốc sớm (n= 56): Gồm 56 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng sớm với thuốc corticosteroid

- Nhóm kháng thuốc muộn (n= 35): Gồm 35 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng muộn với thuốc corticosteroid

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ tháng 9/2015 đến 3/2017 Đề tài được tiến hành tại khoa Thận - Lọc máu, phòng xét nghiệm sinh hóa của Bệnh viện Nhi Trung Ương là nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân Địa điểm tiến hành phân tích gen: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc

Các chỉ tiêu nghiên cứu

- Dữ liệu lâm sàng: tuổi, giới, lý do vào viện, bệnh sử, tiền sử, cân nặng, chiều cao, huyết áp, tình trạng sốt, phù; các thông tin khi khám về tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu

- Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu

- Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423

Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa chất dùng cho điện di: Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X;

Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code: SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck)

Hóa chất dùng cho PCR: Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek)

Cỏc pipet Eppendorf dải 0,5 àl - 10 àl, 10 àl - 100 àl, 100 àl - 1000 àl, hóng: Thermo; Đầu tớp 10 àl, 200 àl, 1000 àl, hóng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -30 0 C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức)

Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ 24h) Bô đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc Tối hôm trước tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng bệnh nhân đái bỏ đi, và bắt đầu ghi thời gian Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5ml để làm xét nghiệm Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5ml)

Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu: lấy máu buổi sáng, chưa ăn Lấy 1,5 - 2ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để phân tích

Mẫu cho phân tích gen: lấy 2ml máu toàn phần đựng trong ống nghiệm chống đông bằng EDTA, bảo quản ở -20 o C đến khi sử dụng Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách DNA tổng số

Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu

Bệnh phẩm được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh Viện Nhi Trung Ương

Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng Các chỉ số sinh hóa cơ bản được phân tích bao gồm: nồng độ protein niệu, protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu, creatinin máu sử dụng hệ thống phân tích sinh hóa tự động AU2700 (Beckman Coulter)

Phân tích đa hình gen NPHS2

Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1

Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết: Sự có mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X 5 àl DNA được trộn với 1 àl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 àg/ml) Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0

Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được trình bày ở Phụ lục

Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR: Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế mồi nhân dòng exon 2, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ)

Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng PCR: Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA cần phân tích từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1 %

Bảng 2.1 Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2

Thể tích (àL) Điều kiện (chu trình nhiệt) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3’

Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0,75 Mồi ngược (10 pmol/àl) 0,75

Xỏc định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 bằng giải trỡnh tự: 20 àl sản phẩm được gửi giải trình tự tại hãng IDT (Malaysia) Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân

Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotide được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ) Tại vị trí cho mỗi nucleotid, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp

Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N9) Điều trị tấn công 4 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h

Có thuyên giảm không ? Điều trị duy trì 4-8 tuần

Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h Điều trị tiếp 2 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h

- Hoặc có tái phát nhưng vẫn đáp ứng thuốc

- Thuyên giảm không hoàn toàn

- Tái phát và kháng thuốc trong những đợt điều trị sau

Không thuyên giảm (Protein/creatinin

Kháng thuốc sớm nV Đặc điểm chung Chỉ số sinh hóa

Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423

Phân tích mối liên quan

Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0

Phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố và hai nhân tố; Kiểm định Chi- Square (χ 2 ) được áp dụng cho các trường hợp tương ứng p 0,05

Tuổi khởi phát bệnh trung bình và tuổi trung bình của bệnh nhi tại thời điểm nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tuổi khởi phát trung bình và tuổi trung bình hiện tại

Tuổi trung bình của bệnh nhân tại thời điểm nghiên cứu là 5,8 ± 3,7 tuổi, nhỏ nhất 2 tháng, lớn nhất 16 tuổi Tuổi khởi phát bệnh là 4,2 ± 2,8 tuổi (từ 2 tháng đến 14 tuổi) Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất thuộc nhóm kháng thuốc sớm

Tuổi khởi phát ở các nhóm bệnh nhân, được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Tuổi khởi phát trung bình ở các nhóm bệnh nhân Bệnh nhân Số lượng (n)

Tuổi khởi phát trung bình ở nhóm bệnh nhân NC là 4,4 ± 2,5; ở nhóm bệnh nhân KTS là 3,8 ± 3,1; ở nhóm bệnh nhân KTM là 4,4 ± 2,8 Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tuổi khởi phát giữa 3 nhóm bệnh nhân với chỉ số p> 0,05

Bàn luận về đặc điểm chung

Trong nghiên cứu này, hội chứng thận hư hay gặp ở nam giới hơn nữ giới Điều này được thể hiện rõ rệt qua những nghiên cứu trong và ngoài nước như tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng là 2,7/1, Trần Hữu Minh Quân là 2/1, Chang là 2,8/1 và Wong là 2,5/1 [7, 56, 23, 6]

Tuổi khởi phát bệnh trung bình trong nghiên cứu của chúng tôi là 4,2 ± 2,8 tuổi Khi so sánh độ tuổi khởi phát trung bình với các nghiên cứu khác thì không có sự khác biệt Độ tuổi khởi phát của bệnh nhi mắc HCTHTP trong nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm là từ 1-8 tuổi, Patrick Niaudet là 2-7 tuổi [42, 9] Như vậy, độ tuổi khởi phát và độ tuổi trung bình của bệnh nhân mắc HCTHTP là độ tuổi tiền học đường và học đường

Kết quả cận lâm sàng

Trong hội chứng thận hư, ngoài những biểu hiện lâm sàng như cao huyết áp, phù, những chỉ số cận lâm sàng trong máu và nước tiểu như protein máu, albumin máu, protein niệu, protein/creatinine niệu đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán, theo dõi và điều trị Bệnh nhân được chia thành ba nhóm dựa trên mức độ đáp ứng với corticosteroid là nhóm nhạy cảm (NC), nhóm kháng thuốc sớm (KTS), nhóm kháng thuốc muộn (KTM), theo dõi dọc tại nhiều thời điểm, từ lúc vào viện, ra viện, sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng Kết quả xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu được trình bày bằng các biểu đồ dưới đây

Biểu đồ 3.2 Giá trị trung bình của protein máu của các nhóm bệnh nhân NC (hình trám), KTS (hình vuông) và KTM (hình tam giác) tại các thời điểm

Kí hiệu * thể hiện giá trị p giữa nhóm NC và nhóm KTS : * pT trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid đã làm thay đổi tỷ lệ protein/creatinin niệu tại thời vào viện và ra viện với các giá trị p tương ứng là 0,002 và 0,000 Các bệnh nhân mang alen đột biến ở nhóm KTS có chỉ số protein/creatinin niệu cao gần gấp đôi các bệnh nhân không mang alen đột biến trong cùng nhóm Trong khi đó, các bệnh nhân mang alen đột biến ở nhóm NC và KTM lại có chỉ số protein/creatinin niệu thấp hơn các bệnh nhân không mang alen đột biến trong cùng nhóm

Bàn luận về đa hình thái đơn rs3738423 với các chỉ số sinh hóa

Như vậy, sự tương tác giữa alen đột biến rs3738423 C>T trên exon 2 và mức độ đáp ứng thuốc corticosteroid không có ảnh hưởng lên các chỉ số protein máu, albumin máu, protein niệu nhưng lại có ảnh hưởng lên chỉ số protein/creatinin niệu thời điểm vào viện và ra viện Chúng tôi nhận thấy rằng đa hình thái đơn rs3738423 có tác dụng bảo vệ bệnh nhân ở nhóm NC và KTM khi mà làm giảm protein/creatinin niệu ở các bệnh nhân thuộc hai nhóm này Tuy vậy, đa hình thái đơn rs3738423 lại làm tăng protein/creatinin niệu ở nhóm bệnh nhân KTS Chính điều này làm chúng tôi nghĩ đến giả thuyết rằng đột biến ở vị trí rs3738423 có tác dụng bảo vệ những bệnh nhân có đáp ứng thuốc ban đầu, nhưng lại làm tình trạng của các bệnh nhân không đáp ứng trở nên xấu đi Tác dụng của đa hình đơn rs3738423 cũng gặp trong nghiên cứu của Junli khi ông thấy đa hình này bảo vệ các bệnh gốc Trung Quốc, nhưng tác dụng này lại không gặp ở nhóm bệnh nhân từ phía Bắc và phía Đông Trung Quốc Sự khác biệt này có thể do sự khác biệt về tần số alen hoặc biến thể di truyền giữa miền Bắc và miền Nam Trung Quốc [32]

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	1,31 MB