LUẬN văn THẠC sĩ tối ưu quy trình phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Mẫu máu toàn phần chống đông EDTA của 149 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc HCTHTP được lấy từ Bệnh viện Nhi Trung Ương

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:

Các bệnh nhân được chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO năm 2012: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥

200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/lít, Protid máu ≤ 56 g/lít [48]

Không mắc các bệnh hệ thống và các bệnh về cầu thận khác; Tự nguyện tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân:

HCTH thứ phát: tìm thấy nguyên nhân (Ví dụ: lupus ban đỏ hệ thống, ban xuất huyết dị ứng, ngộ độc…)

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số

E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek)

Hóa chất dùng cho điện di

Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X; Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code:

SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code:

SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck)

Hóa chất dùng cho PCR

Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Cỏc pipet Eppendorf dải 0,5 àl - 10 àl, 10 àl - 100 àl, 100 àl - 1000 àl, hóng: Thermo; Đầu tớp 10 àl, 200 àl, 1000 àl, hóng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -30 0 C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức)

2.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ tháng 9/2015 đến 3/2017 Địa điểm tiến hành phân tích gen: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cỡ mẫu nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp thỏa mãn tiêu chuẩn tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đồng ý tham gia nghiên cứu cho đến khi quy trình đạt ổn định Đề tài áp dụng phương pháp giải trình tự dựa trên nguyên lý của Sanger Tiến hành tối ưu hóa quy trình PCR với các điều kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Mức độ đánh giá tối ưu dựa trên kết quả điện di trên gel agarose Dựa trên kết quả giải trình tự sẽ tính được tần số kiểu gen và tần số alen của các SNP Tần số alen thu được trong nghiên cứu được so sánh với tần số lý thuyết khi quần thể cân bằng theo định luật Hardy-Weinberg

Phân tích kết quả và xử lý số liệu với kiểm định Khi bình phương bằng phần mềm Excel Phép thử Khi bình phương được dùng để đánh giá tần số alen thu được trong nghiên cứu có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tần số alen lý thuyết theo định luật Hardy-Weinberg hay không

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Mẫu máu toàn phần (2 ml máu/ mẫu) lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân nhi mắc HCTHTP tại Bệnh viện Nhi Trung Ương được đưa vào ống chuyên dụng chứa EDTA, bảo quản lạnh ở -20 o C đến khi sử dụng

Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách ADN tổng số

2.2.2 Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Quy trình tách chiết ADN được trình bày ở Phụ lục 1

Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết

Sự có mặt của ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X 5 àl ADN được trộn với 1 àl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 àg/ml) Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng ADN được phát hiện dưới ánh sáng UV

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0

Quy trình kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di được trình bày ở Phụ lục 2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR

Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế các mồi nhân dòng exon 2, 3 và 4, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ) Các cặp mồi dùng cho nhân dòng exon 1, 5 và 6 sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013 [17] Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1 Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2

Exon Trình tự mồi (5’ – 3’) Độ dài sản phẩm dự kiến

1 GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT 414 bp

TCC ACC TTA TCT GAC GCC CC

3 CTA GGA TCA TTC TTA TGC CA 238 bp

4 TCC CTG TTT ATA CCTATT GTC

CCC ATT CCC TAG ATT GCC

5 AAA GGA GCC CAA GAA TCA AG 292 bp AAA TAT TTC AGC ATA TTG GCC

6 GTT TAG GCA TGC TCT CCT C 228 bp

2.2.3 Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR

Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn ADN cần phân tích từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

- Sợi khuôn ADN, tổng hợp chuỗi mới theo nguyên tắc bổ sung

- Hai đoạn mồi xác định vị trí bắt đầu và kết thúc của đoạn ADN cần khuếch đại

- Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg 2+ giúp enzyme hoạt động tối ưu

- Enzyme tổng hợp chuỗi mới Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

Trình tự lý thuyết và độ dài của các exon từ 1 đến 6 của gen NPHS2 như sau (trình tự mồi được đánh dấu màu vàng, trình tự tham khảo trên NCBI có mã NG_007535.1):

4981 gtcccccggg cacgccacgc ggacccgcag cgactccaca gggactgcgc tcccgtgccc

5041 ctagcgctcc cgcgctgctg ctccagccgc ccggcagctc tgaggatgga gaggagggcg

5101 cggagctcct ccagggagtc ccgcgggcga ggcggcagga ctccgcacaa ggagaacaag

5161 agggcaaagg ccgagaggag cggcggaggc cgcgggcgcc aggaggctgg gcccgagccg

5221 tcgggctccg gacgggcggg gaccccgggg gagccccgag cgcccgccgc cacggtggtg

5281 gacgtggatg aggtccgagg ctccggcgag gagggcaccg aggtggtggc gctgttggag

5341 agcgagcggc ccgaggaagg tacggattca gcaccactat ctgctacttt tccaggtggt

5401 aactaagggg cgtcagataa ggtggaaagg gtcatcccca cgagacccac tgaagccaga

16021 tttgacttat tctaatattt ccagcaaagt ctccaagttg tgccaactcc aataccaaga

16081 attggaccaa cagatgctag tcagtgaata cagtgaagtt tcaatataat tattcttttg

16141 ctttaatttt tttaaggtac caaatcctcc ggcttagggg cctgtgagtg gcttcttgtc

16201 ctcatttccc tgctcttcat catcatgacc ttcccttttt ccatctggtt ctgcgtaaag

16261 gtgagattcc ataaggaccc aataggtaat ttcctgaggc ctctcactgg ccacaccatg

16321 cccattctca cttctgtttt ctggtacatg ttattgctcc atgtggaatg ccctcacccc

19501 tctgatatct aggatcattc ttatgccaag gccttttgaa gactttttct ttctgggagt

19561 gatttgaaag gattaaattt ctctttaggt tgtacaagag tatgaaagag taattatatt

19621 ccgactggga catctgcttc ctggaagagc caaaggccct ggtaaaaaaa cactcttttt

19681 tttctaaaca cctctctcct gacttgccaa tttcttcaac ccatgcagat ttgtaatatg

19741 gacctcagat taaatgaagt aacttgattc atgatatctg aattttccaa tctgttactt

20941 atgactaaaa ggaccacaca gcccagtttg ctgggaataa tccctgttta tacctattgt

21001 cctggattac atattataat atataatagt gctctccttt taccctcagg tggaggtggg

21061 atgggccaat ggtctgtaat tagaggctaa gaaaagtaat gtagtgtgca acctgacccc

21121 agaaaggtga aacccaaaca gccttcatgc tagctattta tctgtcactt cctcctcctc

21181 tcttttaggt cttttctttt ttttgccctg cctggatacc taccacaagg ttgaccttcg

21241 tctccaaact ctggagatac cttttcatga ggtaagccaa atgatggctt ttgctttctc

21301 tatacatttt ccatggtcta cctaccgtgg acaaaatgat tatttatact caaaaatagg

21361 aaagaaaaat aatgatatgg actacatcat aacttaaaac ttttgtgcat caaaggacac

21421 aattaacaga gtgcaaaggc aatctaggga atgggggaaa atatttgcaa atcatatctc

23641 aacacattta gttcctctaa ccccacatag gaaaggagcc caagaatcaa gcctgtcatc

23701 caaacttttt tctgcctaga tcgtgaccaa agacatgttt ataatggaga tagatgccat

23761 ttgctactac cgaatggaaa atgcctctct tctcctaagc agtcttgctc atgtatctaa

23821 agctgtgcaa ttccttgtgc aaaccactat gaagcgtctc ctagcacatc gatccctcac

23881 tgaaattctt ctagagagga agagcatcgc ccaagatgca aaggtactta gataaacata

23941 atggccaata tgctgaaata tttatctttt attcatttgt tcattggaca tttattaaat

26341 acaatggcca ccagggttta ggcatgctct cctcccacct ggaggctccc actgacatct

26401 gaattcttct ttccacaggt tgccttggat tcagtgacct gtatttgggg aatcaaagtg

26461 gagagaatag aaatgtgggt aggaaattaa ctagcaagaa ctgtatgata aaggaaaata

26521 ttctggtttc attttaaatt tttcatttga aaaattattt tcactgagta ctatagccat

26581 atcagcataa atttataaaa aagagaaaca aatcacctaa tatcttacag ccataacaca

2.2.4 Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự

20 àl sản phẩm được gửi giải trỡnh tự tại hóng IDT (Malaysia) Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân

Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ) Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp

2.2.5 Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2

Tần số kiểu gen và alen được xác định theo công thức sau (giả sử với kiểu gen X gồm 2 dạng alen là C và T, cho 3 kiểu gen là CC, CT, TT):

- Tần số của mỗi kiểu gen:

- Tần số của mỗi alen:

Tần số alen C: f (C) = f (CC) + f (CT)

Tần số alen T: f (T) = f (TT) + f (CT) Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT): tần số các kiểu gen CC, TT, CT

Quy trình nghiên cứu được tóm tắt thành sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu

ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu tuân theo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế Bệnh nhân trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh nhân Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào Các thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục

Thu nhận 149 mẫu máu toàn phần bệnh nhi mắc HCTHTP

Tách chiết ADN tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini kit Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN

Lựa chọn cặp mồi nhân gen

Exon 2, 3 và 4: tự thiết kế mồi sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1

Exon 1, 5 và 6: sử dụng trình tự công bố bởi Basiratnia năm 2013

Tối ưu các thành phần tham gia phản ứng và chu trình nhiệt

Xác định kiểu gen của SNP Giải trình tự Đọc kết quả bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9

Xác định tần số của các SNP nằm trong 6 exon

Tính toán tần số và so sánh với các nghiên cứu đã công bố trên NCBI

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đích nghiên cứu Nghiên cứu này được Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Nhi Trung Ương phê duyệt với số ID 796/BVNTW-VNCSKTE và đã được sự đồng ý của tất cả bệnh nhân và cha mẹ họ.

KẾT QUẢ

TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ

ADN tổng số từ 149 mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Omega-Biotek, sản phẩm ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0,7%

Kết quả điện di cho thấy các sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng ADN rõ nét, tương ứng với băng 23,1 kb của marker (Hình 3.1)

Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 2% Làn M: Lamda DNA/HindIII marker Làn 01-12: mẫu ADN tổng số thu của bênh nhân có mã số tương ứng

Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (số liệu chi tiết trình bày ở Phụ lục 3) cho thấy nồng độ ADN thu từ 149 mẫu máu dao động từ 31 - 350 ng/àl, chỉ số OD 260 /OD 280 nằm trong khoảng từ 1,7 đến 2,1 Axit nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260nm là do sự có mặt của bazơ purin và bazơ pyrimidin Vì vậy, nồng độ ADN có thể xác định thông qua giá trị hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) Một đơn vị OD260 tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi Ngoài ra, người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280 nm là mức hấp thụ cực đại của protein và sử dụng chỉ số OD260/OD280 để đánh giá độ tinh sạch của ADN [9] Như vậy, ADN tổng số thu được ít bị đứt gãy với một băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo.

NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Chúng tôi tiến hành tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR trong 10 nhiệt độ lựa chọn dao động quanh nhiệt độ gắn mồi lý thuyết Kết

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU quả điện di ở hình 3.2 cho thấy băng ADN ở exon 1 hiện lên rõ nét nhất tại dải nhiệt độ gắn mồi từ 54,5 o C đến 66,5 o C; exon 2 từ 50,8 o C đến 58,1 o C; exon 3 từ 50,9 o C đến 58,1 o C; exon 4 từ 51,0 o C đến 59,1 o C; exon 5 từ 53,4 o C đến 57,3 o C và exon 6 tại nhiệt độ 56,3 o C Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi là 56 o C vì nằm trong khoảng nhiệt độ để ADN hiện lên 1 băng rõ nét ở cả 6 exon

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon gen NPHS2 Làn M: marker, ĐC +: đối chứng dương, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nhiệt độ gắn mồi sử dụng cho các mẫu ( 0 C)

Tối ưu nồng độ mồi

Quá trình tối ưu hóa nồng độ mồi với sản phẩm PCR chạy ở 3 nồng độ 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/àl trờn 3 mẫu 29, 49 và 57 Hỡnh ảnh điện di sản phẩm thể hiện Hình 3.3 Kết quả điện di cho thấy cả 6 exon đều hiện băng rõ nhất ở nồng độ 0,3 pmol/àl Vỡ vậy, chỳng tụi chọn nồng độ mồi chạy PCR là 0,3 pmol/àl

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi trên 6 exon gen NPHS2 Làn M: Marker 100bp Các mẫu 29, 49, 57 được chạy PCR với nồng độ mồi 0,9; 0,3 và 0,1 pmol/àl ĐC-: Đối chứng õm

Tối ưu nồng độ ADN

Chúng tôi tiến hành tối ưu nồng độ ADN sử dụng trong phản ứng PCR ở cỏc nồng độ: 5, 10, 50, 100 và 500 ng/àl Kết quả điện di trờn 6 exon ở

Hình 3.4 cho thấy băng sáng hiện lên rõ nhất tương ứng với hai cột nồng độ

50, 100 ng/àl; băng mờ hơn ở cột 5, 10 ng/àl và hầu như khụng thấy băng sỏng ở cột 500 ng/àl Như vậy, PCR ở cả 6 exon thực hiện với nồng độ ADN xỏc định là 50 - 100 ng/àl Tại dải nồng độ này, sản phẩm PCR cho băng duy nhất, sáng rõ cho thấy phản ứng nhân dòng đặc hiệu với lượng sản phẩm cao

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác nhau trên

6 exon gen NPHS2 Làn M: marker, ĐC -: đối chứng âm, kí hiệu trên các giếng: nồng độ ADN cỏc mẫu (ng/àl.)

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu với thành phần chi tiết ở Bảng 2, chúng tôi đã nhân dòng thành công 6 exon với cùng chu trình nhiệt

Bảng 2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2

(àL) Điều kiện (chu trình nhiệt) dNTP (2mM) 2.5 * Biến tính đầu: 95 o C trong 3 phút

Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0.75 Mồi ngược (10 pmol/àl) 0.75

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ

Phân tích kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu trên NCBI, chúng tôi xác định được 73 SNP trên exon 1, 44 SNP trên exon 2, 32 SNP trên exon 3, 37 SNP trên exon 4, 50 SNP trên exon 5 và 17 SNP trên exon 6

Chúng tôi cũng phát hiện 2 đa hình mới chưa được công bố: 1 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp AT ở sau 4 Nu của rs772151217 trên exon 2; 1 bệnh nhân có kiểu gen TT ở sau 2 Nu của rs786204708 trên exon 3 Kết quả đọc kiểu gen từ giải trình tự của một số mẫu được thể hiện trong Hình 3.6

Hình 3.6 Một số kết quả giải trình tự gen NPHS2 Hình A: các kiểu gen của đa hình rs3738423 Hình B: đột biến mới trên exon 2, exon 3

Số lượng đa hình trên các exon được biểu thị ở Hình 3.7 Số lượng đa hình ở exon 1 xuất hiện nhiều nhất, tiếp đến là các exon 5, exon 2, exon 4, exon 3 theo thứ tự giảm dần và thấp nhất là ở exon 6

Hình 3.7 Số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 Đa số các đa hình phát hiện trong nghiên cứu đều chỉ có 1 kiểu gen đồng hợp kiểu dại, các đa hình xuất hiện nhiều hơn 1 kiểu gen được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3 Tổng hợp các SNP xuất hiện alen đột biến của 149 bệnh nhân

Exon SNP Số lượng bệnh nhân

1 rs1079292 2 Dị hợp rs758564490 1 Dị hợp

2 rs3738423 2 Đồng hợp đột biến

30 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs772151217 là 04 Nu)

3 rs200437667 1 Dị hợp Đột biến mới (Sau rs786204708 là 02 nucleotid)

4 rs12401711 13 Dị hợp rs12401708 13 Dị hợp rs528833893 1 Thêm 1 Nu

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6

Những công bố trên PubMed trong hơn một thập kỉ qua đã cho thấy sự đa dạng và chức năng của các đa hình gen NPHS2 ở các nhóm nghiên cứu khác nhau Tham khảo các kết quả nghiên cứu trước trên thế giới, chúng tôi xác định được trên quần thể đối tượng nghiên cứu của mình một số SNP thuộc hai nhóm đột biến thường gặp nhất là đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa Bảng 4 trình bày các đột biến sai nghĩa đã tìm thấy trong nghiên cứu này tương ứng với vị trí trên mRNA và protein Bảng 5 trình bày các đột biến vô nghĩa đã tìm thấy trong nghiên cứu này tương ứng với vị trí trên mRNA và protein

Bảng 4 Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu

Tên SNP Vị trí trên mRNA

Exon Vị trí trên protein rs74315342 c.413G>A 3 p.R138Q rs869025495 c.353C>T 2 p.P118L rs74315346 c.479A>G 4 p.D160G rs200437667 c.502C>A 3 p.R168S rs786204583 c.502C>T 4 p.R168C rs530318579 c.503G>A 4 p.R168H rs775006954 c.779T>A 6 p.V260E rs74315345 c.274G>T 1 p.G92C rs74315347 c.538G>A 5 p.V180M rs748812981 c.714G>T 5 p.R238S rs61747728 c.686G>A 5 p.R229Q rs201050491 c.182C>T 1 p.A61V rs61747727 c.725C>T 5 p.A242V

Bảng 5 Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu

Tên SNP Vị trí trên mRNA

Exon Vị trí trên protein rs147672543 c.809T>A 5 p.L270X rs869312746 c.115C>T 1 p.Q39X rs755972674 c.385C>T 3 p.Q129X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X rs12568913 c.586C>T 5 p.R196X rs778055996 c.643C>T 5 p.Q215X rs74315343 c.412C>T 3 p.R138X

TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG NGHIÊN CỨU

Trong tổng số 251 SNP chúng tôi xác định được trên 6 exon đầu của gen NPHS2, chỉ có 7 SNP xuất hiện alen đột biến Tần số kiểu gen và tần số alen được thống kê ở Bảng 6, các SNP còn lại có kiểu gen giống nhau ở tất cả

Bảng 6 Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến

SNP Tần số kiểu gen Tần số alen Giá trị p Đồng hợp kiểu dại

Dị hợp Đồng hợp đột biến

Alen đột biến rs1079292 0,987 0,013 00 0,993 0,007 0,934 rs758564490 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs3738423 0,785 0,201 0,014 0,886 0,114 0,961 rs200437667 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967 rs12401711 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs12401708 0,913 0,087 00 0,956 0,044 0,578 rs528833893 0,993 0,007 00 0,997 0,003 0,967

Thống kê Khi bình phương cho giá trị p > 0.05 chứng tỏ cấu trúc di truyền của các alen này ở người Việt Nam có thể đã trở nên ổn định (ít nhất quần thể 149 bệnh nhân thuộc nghiên cứu này đã có tính đại diện)

BÀN LUẬN

VỀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦU CỦA GEN NPHS2

Đột biến trên gen NPHS2 có liên quan đến tính kháng corticosteroid ở bệnh nhân mắc HCTHTP khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn, bệnh nhân bị tái phát nhiều lần ngay cả khi đã ghép thận Vì vậy, trên thế giới, nghiên cứu di truyền ở bệnh nhân mắc HCTHTP được đặc biệt quan tâm và đã có những kết quả nhất định trong việc xác định các đột biến gen liên quan

Quy trình phân tích gen NPHS2 trong nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo các bước sau: tách chiết ADN tổng số, PCR nhân dòng 6 exon, giải trình tự, phân tích kết quả Trong đó, sau mỗi bước chúng tôi có tiến hành kiểm tra chất lượng các sản phẩm thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose hoặc đo quang

Tách chiết ADN là bước đầu tiên quan trọng của quy trình thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử ADN tách chiết được phải đảm bảo không bị đứt gãy, không nhiễm tạp chất để đảm bảo độ chính xác cho kết quả PCR và giải trình tự gen Kết quả chúng tôi thu dược, tất cả mẫu ADN của bệnh nhân sau tách chiết được đo trên máy quang phổ kế Nano-drop ở bước sóng 260/280nm đều có nồng độ cao và độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,7  2,1

Kết quả tách chiết ADN ổn định và có tính lặp lại cao, sản phẩm ADN tổng số đạt yêu cầu về độ tinh sạch Vì vậy, sản phẩm sau khi tách chiết ADN của chúng tôi rất phù hợp cho các bước tiếp theo trong quy trình nghiên cứu, đảm bảo kết quả chính xác

Phản ứng PCR trong bước tiếp theo là phản ứng quan trọng để khuếch đại đoạn gen cần phân tích Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN- polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: sợi khuôn ADN, hai đoạn mồi, các loại nucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), môi trường đệm và enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Ngoài ra còn các yếu tố khác ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm PCR nhiệt độ nóng chảy của mồi, thời gian và số lượng chu kì phản ứng PCR hay yêu cầu về thiết bị và dụng cụ Trong nghiên cứu này do điều kiện cho phép, chúng tôi tiến hành tối ưu 3 yếu tố liên quan đến phản ứng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU nhân dòng 6 exon thuộc gen NPHS2 là: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ ADN khuôn bởi các lý do sau Thứ nhất, nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào số lượng mỗi bazơ nitơ A, T, G, C trong mỗi cặp mồi và thường được công ty cung cấp cặp mồi khuyến cáo Nghiên cứu của Basiratnia (2013) chọn nhiệt độ gắn mồi cho exon 5 là 52 o C và cho các exon 1, 2, 6, 7 là 60 o C [17]

Vì vậy, khi tiến hành phản ứng PCR cho 6 exon mà mỗi exon chọn nhiệt độ khác nhau sẽ làm cho quy trình trở nên phức tạp Chúng tôi đã tiến hành tối ưu lựa chọn một nhiệt độ gắn mồi chung cho cả 6 exon mà đảm bảo kết quả phản ứng PCR Thứ hai, nồng độ mồi nếu thêm quá nhiều sẽ làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau Ngược lại, nồng độ mồi thấp lại làm giảm hiệu suất PCR Vì thế, đây là yếu tố quan trọng đảm bảo độ chính xác cho phản ứng nhân dòng Cuối cùng, kết quả tách chiết ADN đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch cho phản ứng PCR, tuy nhiên lại có sự biến thiên đa dạng về nồng độ giữa các mẫu Chính vì vậy, trong quá trình thực hiện PCR, tối ưu nồng độ ADN khuôn là điều cần thiết Quy trình PCR chúng tôi xây dựng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: biến tính ở 95 o C – 3 phút, 35 chu kỳ (biến tính ở 95 o C trong 30s, gắn mồi ở 56 o C trong 30s, và kéo dài chuỗi ở 72 o C trong 1 phút) và tổng hợp cuối ở 72 o C trong 5 phỳt với nồng độ mồi là 0,3 pmol/àl và nồng độ ADN khuụn là 50 -

100 ng/ àl Thớ nghiệm PCR cú sử dụng đối chứng õm đều cho kết quả õm tính chứng tỏ sản phẩm PCR hoàn toàn tinh sạch, không bị nhiễm các ADN ngoại lai Kích thước các băng cần phải phù hợp với kích thước lý thuyết theo trình tự được niêm yết trên Ngân hàng gen quốc tế Các băng ADN từ sản phẩm PCR gọn, sáng và đặc hiệu (chỉ xuất hiện một băng duy nhất) là tiêu chuẩn cho sản phẩm PCR có chất lượng tốt và hoàn toàn tinh sạch, có thể sử dụng cho giải trình tự gen

Cho đến nay, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu Chúng tôi đã cố gắng đơn giản hóa quy trình nhằm đưa quy trình có thể sử dụng tại các phòng khám và cơ sở nghiên cứu có thiết bị phù hợp ADN được tách từ mẫu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU máu toàn phần, là dạng mẫu dễ thu thập tại các cơ sở khám chữa bệnh Việc tối ưu được các điều kiện như vậy có ý nghĩa quan trọng trong ứng dụng thực tế vì tiết kiệm được thời gian và công sức thao tác Áp dụng phân tích trên 149 bệnh nhân cho thấy quy trình phân tích gen của chúng tôi có tính ổn định, dễ dàng lặp lại với độ chính xác cao Quy trình được xây dựng trong nghiên cứu này sẽ là công cụ hỗ trợ các nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen NPHS2 và HCTH, một mảng nghiên cứu vẫn cần bổ sung thêm nhiều dẫn liệu và hoàn toàn chưa được đánh giá ở Việt Nam.

VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN 6

Dựa vào kết quả giải trình tự kết hợp với cơ sở dữ liệu trên NCBI, chúng tôi xác định được 251 SNP trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 và 2 đột biến mới trên exon 2 và exon 3 Trên thế giới, đã có nhiều công bố về giải trình tự toàn bộ exon của gen NPHS2, tuy nhiên, đây là lần đầu tiên chúng tôi công bố về giải trình tự toàn bộ exon trên gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc hội chứng thận hư tiên phát Nghiên cứu ở trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid không có tiền sử gia đình cho thấy khả năng liên quan giữa một số đột biến gen NPHS2 đến tiên lượng kém thuận lợi của những bệnh nhân này [14] Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư ở Nam Ấn Độ phát hiện 4 đột biến NPHS2 là rs74315345, rs869025495, rs74315342 và rs74315346, chỉ xuất hiện trong nhóm kháng corticoid mà không xuất hiện trong nhóm nhạy cảm với corticoid [15] Ở Việt Nam, chúng tôi khuyến nghị mở rộng thực hiện các nghiên cứu tiếp theo kết hợp với các dữ liệu cận lâm sàng và lâm sàng về HCTHTP để đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền NPHS2 đối với đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị HCTH

Chúng tôi cũng xác định được một số SNP thuộc nhóm đột biến sai nghĩa và vô nghĩa Theo nhiều nghiên cứu trước đây trên thế giới, đột biến sai nghĩa là nhóm đột biến xuất hiện nhiều nhất trong các đột biến của NPHS2

Trong đó, đột biến rs74315342 (tên khác là c.413G>A hay p.R138Q) trên exon 3 là đột biến thường gặp nhất ở Châu Âu [54] Axit amin arginine ở vị trí 138 đóng vai trò quan trọng trong bảo toàn cấu trúc và chức năng của podocin trên màng đáy cầu thận [21] Vì vậy, sự thay thế nucleotit G bằng A dẫn đến sự thay thế của glutamine cho arginine đã làm mất khả năng giữ lại

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU nephrin và mất tính toàn vẹn của màng lọc cầu thận [37] Nghiên cứu của chúng tôi cũng tìm thấy sự xuất hiện của đột biến này Các đột biến gen mã hóa protein podocin được giữ lại trong mạng lưới nội chất cũng được chứng minh là các đột biến sai nghĩa khác như: p.P118L (c.353C> T), p.D160G (C.479A> G), p.R168S (c.502C> A), p.R168C (c.502C> T), p.R168H (C.503G> A), và p.V260E (c.779T> A) [62] Mặt khác, một số đột biến sai nghĩa dẫn đến các đột biến của podocin nhắm mục tiêu đúng vào màng tế bào

Các đột biến gây hại bằng việc ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng của protein làm thay đổi đặc tính báo hiệu và/ hoặc thay đổi tương tác với các protein khác trên màng lọc cầu thận [57] Các đột biến sai nghĩa không chỉ giới hạn ở một vài exon cụ thể mà phân bố trong suốt chiều dài của gen Do đó, các miền chức năng khác nhau của podocin đều bị ảnh hưởng [62] Trong số các đột biến sai nghĩa, 3 đột biến đã được công bố trong cơ sở dữ liệu giải trình tự p.V290M (C.868G> A) và p.V180M (c.538G> A) với tần suất 1/13006 alen (0.008%), và p.R138Q (c.413G> A) với tần số 8/13006 (0.06%), được cho là thường gặp hơn các đột biến sau này ở các bệnh nhân [20]

Nhóm đột biến thứ hai được xác định trên gen NPHS2 là đột biến vô nghĩa Tổng hợp từ các nghiên cứu trước, mười bảy đột biến vô nghĩa đã được mô tả, trong đó có 4 đột biến mới (p.S46X [c.137C> A], p.Q219X [c.655C>

T], p.R229X [C.685C> T], và p.L270X [c.809T> A]) Các đột biến khác đã mô tả trước đây là: p.Q39X (c.115C> T), p.R71X (c.211C> T), P.E87X (c.259G> T), p.W122X (c.366G> A), p.Q129X (c.385C> T) P.R138X (c.412C> T), p.Y162X (c.486C> A), p.R196X (c.586C> T) P.Q215X (c.643C> T), p.E237X (c.709G> T), p.E264X (c.790G> T) P.K289X (c.865A> T), và p.R322X (c.964C> T) Xét nghiệm invitro đã chỉ ra protein đột biến p.R138X (c.412C> T) gây mất khả năng giữ lại nephrin trên màng đáy cầu thận [37] Mặt khác, phản ứng khuếch đại gen khi sinh thiết thận của bệnh nhân mang đột biến p R138X (C.412C> T) không thể phát hiện sản phẩm chứng tỏ đột biến làm phân hủy mRNA [20, 21]

Nghiên cứu của Karim Bouchireb và cộng sự (năm 2013) cập nhật các đột biến trên gen NPHS2 liên quan đến HCTH kháng corticosteroid, các đột biến thêm hay mất bớt nucleotit đã xác định được bao gồm 11 đột biến chèn

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thêm và 26 đột biến xóa những đoạn gen ngắn Trong số đó có 3 đột biến gây lệch khung đọc Đột biến thêm và mất nucleotit rải rác toàn bộ chiều dài gen mã hóa podocin, tuy nhiên, những đột biến mất nucleotit tập trung ở vùng PHB và đầu C-terminal Chỉ có 4 đột biến mất nucleotit là: p.Pro89ArgfsX13 (c.264 265del), (p.P45RfsX54 [C.134del], p.E56GfsX43 [c.167del], và p.L84WfsX15 [c.249del]) ở exon đầu tiên có ảnh hưởng đến đầu N của podocin Nghiên cứu của chúng tôi không thấy sự xuất hiện của những đột biến này, có thể do kích thước quần thể nghiên cứu vì đây là những đột biến có tần số thấp hoặc có thể đây là những đột biến liên quan đến chủng tộc và địa dư mà chưa được chứng minh rõ

Ngoài các đột biến thuộc 6 exon đầu, nhiều nghiên cứu khác về các đột biến thuộc vùng intron và đột biến mã kết thúc đã được xác định Mười sáu đột biến làm thay đổi vị trí cắt đã được mô tả trong các nghiên cứu bao gồm:

A, 451 + 3A> T, 452-2A> C, 534 + 1G> T, 535-1G> T, 794 + 5G> T, 873 + 5G> A, 873 + 2T> A, 873> 1G> A, 874-1G> C, và 874-2A> G Tuy nhiên cả đều được cho là nguyên nhân gây bệnh Phần lớn các đột biến tại vị trí cắt ảnh hưởng đến intron 3 và 7 (58% tất cả các đột biến tại vị trí cắt) Đột biến mới p.X384QextX7 (c.1150T>C) được tìm thấy gần đây trong nghiên cứu của Bouchireb Trong đột biến này, sự thay thế 1 base đơn lẻ trong stop codon tạo ra khung đọc mở dài hơn, kết quả là tạo ra protein với hơn 390 axit amin dẫn đến sự biểu hiện quá mức của podocin trong tế bào chân giả Vì vậy, những nghiên cứu thực nghiệm trong tương lai là cần thiết để đánh giá hậu quả chức năng do đột biến đơn lẻ này

Việc xác định tần số kiểu gen và tần số alen của các đa hình di truyền xuất hiện alen đột biến này sẽ góp phần vào việc xác định SNP tiềm năng cho mối liên quan giữa đa hình di truyền gen NPHS2 với HCTHTP kháng corticoid trên quẩn thể người Việt Nam Trong 149 bệnh nhân nghiên cứu, ngoài hai đột biến mới nằm trên exon 2 và exon 3, chúng tôi thấy có 7 SNP có tính đa hình trên exon 1 - 4 là rs1079292, rs758564490, rs3738423, rs200437667, rs12401711, rs12401708 và Rs528833893; exon 5, 6 có tính đồng hình Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Hasan Otukesh trên

20 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng corticoid tại bệnh viện Ali Asghar (Iran) và nghiên cứu của Maruyama trên cả 8 exon ở 36 trẻ em Nhật Bản mắc HCTH kháng corticosteroid [32, 50] Trong nghiên cứu của Yu năm

2005 trên 23 bệnh nhân người Trung Quốc, có một trường hợp đột biến mất dị hợp tử ở 7 đa hình: 51G>T, 288C>T, IVS3-46C>T, IVS3-21C>T, IVS7- 74G>C, 954T>C và 1038A>G xảy ra với cả bệnh nhân và nhóm đối chứng

[67] Nghiên cứu về HCTH kháng corticosteroid đối với một số nhóm người châu Âu cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến gen NPHS2 từ 12-19% [26, 58, 65] Ở một nghiên cứu khác, những đột biến của gen NPHS2 là phổ biến ở trẻ em

KẾT LUẬN

Từ những kết quả đạt được, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

- Chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân tích gen cho exon 1 đến 6 thuộc gen NPHS2 sử dụng mẫu máu toàn phần với các điều kiện đã được tối ưu hóa cho phản ứng PCR: nhiệt độ gắn mồi là 56 o C, nồng độ mồi là 0,3 pmol/àl và nồng độ ADN khuụn trong khoảng 50 - 100 ng/àl

- Áp dụng thành công quy trình phân tích gen trên 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát Qua đó xác định được 251 SNP và 2 đột biến mới Tần số alen các SNP xuất hiện đột biến được thống kê và so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy – Weinberg đều cho giá tri p > 0,05.

KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

- Thực hiện các nghiên cứu tiếp theo đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền gen NPHS2 với đáp ứng thuốc corticosteroid trong điều trị hội chứng thận hư

- Xây dựng quy trình phân tích gen với 2 exon còn lại và vùng không mã hóa protein của gen NPHS2 để xác định thêm các đa hình có khả năng ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc corticosteroid

1 Bệnh viện Nhi Trung Ương (2006), "Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trẻ em"

2 BioMedia Việt Nam Đa hình đơn nucleotide – Công cụ sử dụng trong di truyền học ở người, truy cập ngày 01 - 03-2018, tại trang web http://www.biomedia.vn/review/da-hinh-don-nucleotide-cong-cu-su- dung-trong-di-truyen-hoc-o-nguoi.html

3 Đinh Đoàn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 325-355

4 Hà Phan Hải An (2015), "Hội chứng thận hư", Bệnh học nội khoa, tập

5 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học

6 Hoàng Hà Kiểm (2010), "Thận học lâm sàng", Nhà xuất bản Y học

7 Khuất Hữu Thanh (1997), "Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen", Nhà xuất bản KHKT HN

8 Lê Nam Trà (2009), "Hội chứng thận hư tiên phát", Bài giảng Nhi khoa, tập 2, Nhà xuất bản Y học

9 Lê Thị Nhiên (2016), Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở bệnh nhân đặt Stent động mạch vành qua da, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội

10 Nguyễn Gia Khánh (2013), "Bài giảng Nhi khoa", tập 2

11 Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét về đặc điểm lâm sàng và sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc ở trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Trường Đại học Y Hà Nội

12 Trần Đình Long (1995), "Một số biến chứng của liệu pháp corticoid trong điều trị hội chứng thận hư ở trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, 4 (2&3), tr 50-51

13 Andolino TP and Reid-Adam J (2015), "Nephrotic syndrome",

14 Arbeitsgemeinschaft fur Pọdiatrische Nephrologie (1988), "Short versus standard prednisone therapy for initial treatment of idiopathic nephrotic syndrome in children", Lancet, 1, pp 380 –383

15 Azocar M, Vega A et al (2016), "NPHS2 Mutation analysis study in children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Rev Chil Pediatr,

16 Bakr A Yehia S, El-Ghannam D and et al (2008), "NPHS2 mutations",

17 Basiratnia M., Yavarian M and Torabinezhad S (2013), "NPHS2

Gene in Steroid-resistant Nephrotic Syndrome Prevalence, Clinical Course, and Mutational Spectrum in South-West Iranian Children",

18 Berdeli A, M.S et al ( 2007), "NPHS2 (podocin) mutations in Turkish children with idiopathic nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 22, pp

19 Bernward Hinkes, C.V et al (2008), "Specific Podocin mutations correlate with age of onset in Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J

20 Bouchireb K, Boyer O and Gribouval O (2013), "NPHS2 mutations in steroid-resistant nephrotic syndrome: a mutation update and the associated phenotypic spectrum", Hum Mutat, 35(2), pp 178-86

21 Boute N, Gribouval O and Roselli S (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid- resistant nephrotic syndrome", Nat Genet, 24(4), pp 349-54

22 Budowle B., Adams D.E and Allen R.C (1994), "Fragment-length polymorphisms for forensic science applications", Methods in nucleic acids research, pp 181-202

23 Buscher AK and Weber S ( 2012), "Educational paper: the podocytopathies", Eu J Pediatr, 171 (8), pp 1151-60

24 Butler J.M (2001), "Biology and Technology behind STR marker",

Forensic DNA Typing, Academic Press, London

25 Caridi G, Bertelli R and Carrea A (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroid- resistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephrol, 12 (12), pp 2742-6

26 Caridi G, Bertelli R et al (2003), "Broadening the spectrum of diseases related to podocin mutations", J Am Soc Nephrol, 14, pp 1278‐86

27 Chanchlani R and Parekh RS (2016), "Ethnic differences in childhood nephrotic syndrome", Front Pediatrics, DOI:

28 Dedi Rachmadi, A.M and Leo Monners (2015), "Gene Mutation and

Polymorphisms in Indonesian Chhildren with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp 27-33

29 Dusel JA, Burdon KP and Hicks PJ (2005), "Identification of podocin

(NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic end- stage renal disease", Kidney Int, 68(1), pp 256-62

30 Eddy AA and Symons JM (2003), "Nephrotic syndrome in childhood",

31 HabibR (1993), "Nephrotic syndrome in the 1 st year of life", Inserm

U, Hospital Necker – Enfant Malades, Paris, France, 7(4), pp 347-

32 Hasan Otukesh, B.G et al (2009), "NPHS2 Mutations in Children with

Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", Iranian Journal of Kidney Diseases, 3, pp 99-102

33 Hee Gyung Kang and H.I.C (2015), "Nephrotic syndrome: What’s new, what’s hot?", Korean J Pediatr 58, pp 275-282

34 Hee Yeon Cho, Joo Hoon Lee and Hyun Jin Choi (2008), "WT1 and

NPHS2 mutations in Korean children with steroid resistant nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 23, pp 63-70

35 Hinkes B, Wiggins RC et al (2006), "Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible", Nat Genet, 38, pp 1397–1405

36 Hinkes BG, Mucha B and ) Vlangos CN (2007), "Nephrotic syndrome in the first year of life: Two thirds of cases are caused by mutations in 4 genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2)", Pediatrics, 119, pp

37 Huber TB, Simons M and Hartleben B (2003), "Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Hum Mol Genet,

38 International Study of Kidney Disease in Children (1981), Primary nephrotic syndrome in children: Clinical significance of histopathologic variants of minimal change and of diffuse mesangial hypercellularity, A Report of the International Study of Kidney Disease in Children

39 Jaffer A, Unnisa W et al (2014), "NPHS2 mutation analysis and primary nephrotic syndrome in southern Indians", Nephrology, 19(7), pp 398-403

40 Joshi S, A.R et al (2013), "Genetics of steroid resistant nephritic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing", Acta Paediatr, 102(9)

41 Kalman Tory, Dora K Menyhard et al ( 2013), "Mutation dependent recessive inheritance of NPHS2 associated steroid resistant nephritic syndrome", Nature Genetics, 46(3), pp 299-304

42 Karle SM, Uetz B and Ronner V (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13(2), pp 388-93

43 Karle SM, Uetz B et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am

44 Kitamura A, Tsukaguchi H et al (2006), "Genetics and Clinical

Features of 15 Asian Families with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome.", HealthNephrology Dialysis Transplantation, 21, pp 3133-

45 Kosskimies O, V.J et al (1982), "Long-termoutcome of primary nephrotic syndrome", Archives of Diseasein Chilhood 57, pp 544-548

46 Kruglyak L and Nickerson D.A (2001), "Variation is the spice of life",

47 Kwok PY and Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol, 5(2), pp 43-60

48 Lombel R M., Hodson E M and Gipson D S (2012), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", Pediatr Nephrol, 2304(8)

49 Maddalena Gigante, Matteo Piemontese et al (2011), "Molecular and

Genetic Basic of Inherited nephrotic syndrome ", International Journal of Nephrology, 2011, pp 1-15

50 Maruyama K, Iuima K et al (2003), "NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant nephrotic syndrome in Japanese children", Pediatr Nephrol, 18, pp 412‐6

51 Mitra Basiratnia, M.Y et al (2013), "NPHS2 gene in Steroid resistant nephritic syndrome Prevelance, clinical course, and mutational spectrum in South West Iranian children", IJKD, 7, pp 357-362

52 Nelson (2000), "Nephrosis", Textbook of Pediatrics, 1129-1133

53 Nephrotic Syndrome: Pathophysiology, Treatment, Complications,

Differential Diagnoses (2017), accessed 01 - 03-2018, from web https://www.healthdiseaseblog.com/2017/09/nephrotic-syndrome- treatment-pathophysiology-complications-differential-diagnosis.html

54 Patrick Niaudet (2004), "Podocin and Nephrotic Syndrome:

Implications for the Clinician", Journal of the American society of Nephrology, 15, pp 832-834

55 Pereira AC, Pereira AB and Mota GF (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney Int, 65(3), pp 1026-30

56 Ren Q and Y.S (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal 4, pp 30-33

57 Roselli S, Moutkine I and Gribouval O (2004), "Plasma membrane targeting of podocin through the classical exocytic pathway: effect of NPHS2 mutations", Traffic, 5(1), pp 37-44

58 Ruf RG, Lichtenberger A and Karle SM et al (2004), "Patients with mutations in NPHS2 (podocin) do not respond to standard steroid treatment of nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol 15, pp 722 –732

59 Schumacher V, Scharer K et al (1998), "Spectrum of early onset nephrotic syndrome associated with WT1 missense mutations", Kidney

60 Severine Roselli, Imane Moutkine et al (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", TRafic, 5, pp 37-44

61 Snustad D P and Simmons M J (2012), "The human Hapmap project", Principle of genetics, John Wiley & Sons, Inc, 414-415

62 Stefanie Weber, Oliver Gribouval and Ernie L (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid-resistant nephrotic syndrome and low post-transplant recurrence", Kidney International, 66(2004), pp 571–579

63 Tsukaguchi H, Yager H and Dawborn J (2000), "A locus for adolescent and adult onset familial focal segmental glomerulosclerosis on chromosome 1q25-31", J Am Soc Nephrol, 11(9), pp 1674-80

64 A Vignal and et al (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE, 34(3), pp 275-305

65 Weber S Gribouval O, Esquivel EL and et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and low post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp 571-579

66 What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? , accessed 03 - 01-

2018, from web https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp

67 Yu Sy Ren Q (2011), "NPHS2 variation in children with late steroid- resistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4(30-33)

68 Zenker M, Tralau T et al (2004), "Congenital nephrosis, mesangial sclerosis, and distinct eye abnormalities with microcoria: An autosomal recessive syndrome", Am J Med Genet A, 130, pp 138–145

69 Zihua Yu, Jianping Huang et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid – resistant nephrotic syndrome in Chinese children",

Tiêu đề	TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT
Tác giả	Nguyễn Thị Thùy Linh
Người hướng dẫn	ThS. Phạm Thị Hồng Nhung, ThS. BS. Vũ Vân Nga
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Y đa khoa
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	2,06 MB