ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
100 người bệnh từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và Bệnh viện Phổi Hà Nội tham gia nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: Người bệnh lao phổi có AFB dương tính (mới hoặc lao phổi tái trị); điều trị bằng các thuốc chống lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017; người bệnh tự nguyện tham gia nghiên cứu
Tiêu chuẩn loại trừ gồm có: Phụ nữ có thai và cho con bú; người bệnh nuôi cấy không mọc khuẩn lạc để xác định các thông số dược động học
Thời gian: từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018 Địa điểm xét nghiệm và phân tích: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega-Biotek)
Hóa chất dùng cho điện di: Ethylene Diamine Tetra Acetic Axit (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng ThermoScientific), Oˈ GeneRuler 50 bp DNA Ladder (hãng Thermo Scientific) ,
Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck)
Hóa chất dùng cho PCR: Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng Phusa-biochem (Việt Nam) với trình tự mồi đã được sử dụng ở một số nghiên cứu khác 5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3' [18, 34], nước khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2G T M Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng Kapabiosystems)
Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng Omega-biotek)
Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific)
Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd
- Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức),
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen -Châu Âu), máy lắc VELP (Scientifica - Châu Âu), máy quang phổ NP80 (Nanophotometer - Đức), máy làm đá vảy (Fiocchetti
- Anh), tủ ấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30 o C (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu gồm 6 bước chính được thể hiện trong Hình 2.1 gồm (1)Thu thập mẫu sinh phẩm, (2) tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số, (3) nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR, (4) tinh sạch sản phẩm PCR, (5) xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR-RFLP hoặc giải trình tự, (6) phân tích kết quả
Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số
PCR nhân dòng đoạn gen NAT2
Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự
Thu thập100 mẫu máu BN lao
Tinh sạch sản phẩm PCR
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa EDTA, bảo quản ở - 20 o C cho đến khi sử dụng
Kí hiệu mẫu: Thông tin về mẫu máu của người bệnh được lưu trong sổ thí nghiệm với các thông tin: tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số
Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng
Nguyên lý của phương pháp tách chiết này là dựa vào sự hấp thụ chọn lọc của axit nucleic vào màng silica – gel thông qua 4 bước chính như mô tả ở Hình 2.2 là ly giải, gắn DNA vào màng silica, rửa sạch tạp chất; giải phóng và thu DNA Cụ thể: (1) Quá trình ly giải thực chất chính là phá vỡ tế bào để giải phóng DNA Trong dung dịch chất ly giải có một số chất ly giải và có nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt có khả năng làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van der Walls và tương tác kị nước để tạo điều kiện để chuyển DNA lên màng silica (2) Quá trình gắn DNA vào màng silica gel nhờ sự có mặt của các muối hoạt động bề mặt và cồn (thường là ethanol hoặc isopropanol (3) Quá trình rửa: Giúp loại bỏ tạp chất khác trên màng silica gel thông qua các dung dịch có chứa muối hoạt động bề mặt cao, sau đó là ethanol để loại bỏ muối Sau bước này trên màng silica gel chỉ còn gắn DNA sẽ được làm khô cột bằng ly tâm để chắc chắn đã loại bỏ ethanol (4) Quá trình giải phóng và thu DNA:
Bằng cách sử dụng dung dịch muối phù hợp, thường là Tris 10 mM ở pH 8 hoặc 9, DNA sẽ hòa tan vào muối Cuối cùng sau khi chắc chắn DNA đã hòa tan, các cột sẽ được li tâm để thu DNA [27]
Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]
(1) Ly giải (2) Gắn DNA vào màng
(4) Giải phóng và thu DNA
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X Trộn
4 àL DNA với 1 àL 5X DNA loading Dye đó nhuộm Ethidium bromide (50 àg/mL) trước khi tra mẫu Điện di được thực hiện trong hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, các băng DNA được hiện hình dưới ánh sáng UV Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280) DNA được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0
Nguyên lý của phương pháp đo mật độ quang là do axit nucleic có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purin và base pyrimidin Vì vậy, để tính nồng độ DNA cần xác định giá trị mật độ quang ở OD260 Một đơn vị OD260 tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi Đo dung dịch ở bước sóng OD280 (mức hấp thụ cực đại của protein) và sử dụng tỉ lệ OD260/OD280 để đánh giá độ tinh sạch của DNA Các mẫu được đo ở bước sóng 260 và 280 nm, tiến hành đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu
2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Dựa vào dữ liệu trên NCBI gen NAT2 kiểu dại dài 1093 bp được khuếch đại thông qua PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự lý thuyết như sau (Hình 2.3) [62]:
1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG
81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT
161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC
241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT
321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT
401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC
481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT
561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA
641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA
721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA
801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC
881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA
961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC
1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA
Hình 2 3 Trình tự đoạn gen NAT2 được nhân dòng để xác đinh kiểu alen Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm Tất cả các phản ứng đều sử dụng đối chứng âm để đảm bảo mẫu không bị ngoại nhiễm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng E.Z.N.A.® CyclePure Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng Nguyên lý của phương pháp là loại bỏ mồi, muối và các tạp chất khác từ mẫu DNA thông qua sử dụng cột có màng silica gel tương tự như nguyên lý tách chiết DNA đã nêu ở phần 2.2.2
2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được pha loóng về nồng độ 100 ng/àL dùng cho phản ứng cắt Đê tiến hành phản ứng cắt, chúng tôi sử dụng các enzym FastDigest KpnI,
FastDigest TaqI, FastDigest BamI để cắt 3 alen NAT2*5, *6, *7 Dựa vào vị trí của enzym cắt trên gen NAT2, kích thước của các băng điện di theo từng kiểu gen dự kiến được Hình 2.4 mô tả Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI Chính vì vậy, kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt Thành phần
Thể tích 1 phản ứng (10 àL) Điều kiện cắt Đệm 10X 1 àL Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt
DNA khuụn 100 ng/àL 3,5 àL
Hình 2 4 Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 (TT: đồng hợp tử kiểu dại; CT: dị hợp tử; CC: đồng hợp tử đột biến; GG: đồng hợp tử kiểu dại; AG: dị hợp tử; AA: đồng hợp tử đột biến)
Chiều dài đoạn gen ước tính sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 lớn hơn
200bp và các đoạn gen có chiều dài khác biệt trên 200 bp, vì vậy tiến sản phẩm cắt 2
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU alen này được điện di trên gel agarose 2% với thang chuẩn O’ GeneRuler 1kb DNA ladder (ThermoScientific) Sản phẩm hiển thị dưới ánh sáng UV thông qua máy soi gel Trong khi đó, chiều dài ước tính của sản phẩm cắt NAT2*6 nhỏ hơn 400 bp và chiều dài đoạn gen cách nhau ít nhất là 15 bp, vì vậy chúng tôi điện di trên gel acrylamide 10%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler 50bp DNA ladder để có thể thu được hình ảnh cắt rõ nhất, sau đó sẽ sử dụng phương pháp nhuộm bạc để hiện hình sản phẩm
2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự
20 àL sản phẩm PCR đó được kiểm tra trờn gel agarose và tinh sạch bằng kit sẽ được gửi đến hãng First base (Malaysia ) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng 1 mồi cho cả đoạn gen NAT2 Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi người bệnh
Cách đọc kết quả giải trình tự như sau : Trong phần mềm BioEdit, mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ) Tại vị trí mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì người bệnh có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp tử Ngoài 6 SNP trên, chúng ta có thể xác định nhiều SNP khác trên đoạn gen đã được giải trình tự, giúp tìm được nhiều mối liên hệ hơn trong cùng 1 bệnh hoặc nhiều bệnh trên cùng 1 gen của 1 cá thể
2.2.7 Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa
Tần số kiểu gen và alen được xác định theo công thức sau (giả sử với kiểu gen
X gồm 2 dạng alen là C và T, cho 3 kiểu gen là CC, CT, TT):
- Tần số của mỗi kiểu gen: Tần số kiểu gen X = 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑛 𝑋
- Tần số của mỗi alen: Tần số alen C: f (C) = f (CC) + 1
2 f (CT) Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT) là tần số các kiểu gen tương ứng CC, TT, CT
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu đảm bảo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế Người bệnh trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới người bệnh Những người bệnh tham gia nghiên cứu sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu Người bệnh có quyền rút khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào Các thông tin của người bệnh được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu đã được thông qua tại Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trước khi triển khai thực hiện Mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự nguyện tham gia nghiên cứu của người bệnh được thu thập đầy đủ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số
Các mẫu máu thu được từ 100 người bệnh được tách DNA bằng kit của Omega, sản phẩm tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các người bệnh (Hình 3.1) cho thấy các sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các người bệnh đều có một băng DNA rõ nét, chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định, thể hiện qua các băng điện di có độ sáng cao tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn
Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm của sản phẩm DNA tổng số cho thấy nồng độ DNA thu được dao động từ 20 - 230 ng/àL, chỉ số OD260/OD280 phần lớn đều nằm trong khoảng từ 1,6 đến 2,2 (kết quả từng mẫu xem ở Phụ lục 2) Như vậy,
DNA tổng số thu được ít bị đứt gãy với một băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo
Hình 3 1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% Làn M1: thang chuẩn
DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
3.2.1 Tối ưu quy trình PCR
Khi tiến hành PCR, nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng cần được tối ưu để đảm bảo PCR có hiệu suất cao nhất Vì vậy, chúng tôi tiến hành PCR trên 10 nhiệt độ khác nhau trong dải nhiệt từ 51,1 o C đến 59,9 o C Nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được xỏc định từ dải nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/àL
Kết quả điện di trên Hình 3.2A cho thấy tại nhiệt độ gắn mồi 57,8 o C đến 58,9 o C sản phẩm PCR thu được băng đặc hiệu, sáng rõ có kích thước phù hợp với lí thuyết
(1093 bp).Tuy nhiên, tại nhiệt độ gắn mồi 52,6 o C đến 55,8 o C có xuất hiện băng phụ, còn tại nhiệt độ 52,6 o C; 53,6 o C; 59,5 o C và 59,9 o C các băng xuất hiện mờ, không rõ nét
Như vậy, nhiệt độ gắn mồi 58 o C cho băng sáng nhất, rõ nét và không có băng phụ nên được chọn là nhiệt độ gắn mồi cho các phản ứng tiếp theo Kết quả tối ưu nồng độ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA trờn Hỡnh 3.2B cho thấy PCR thành cụng với nồng độ từ 150-250 ng/àL, tuy nhiờn tại nồng độ 150 ng/àL và 250 ng/àL cho băng sỏng mờ, nồng độ 200 ng/àL cho băng sáng rõ nét, không có băng phụ nên được chọn làm nồng độ tối ưu
Hình 3 2 Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% (A) Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi; (B) Kết quả tối ưu nồng độ DNA; Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm
3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu
Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu với thành phần và chu trình nhiệt như trên (Bảng 3.1), nhóm nghiên cứu đã nhân dòng thành công 100 sản phẩm Hình 3.3 là kết quả điện di nhân dòng gen NAT2 của 10 mẫu đầu tiên Hình ảnh là một băng sáng rõ nét cho thấy phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, đảm bảo tham gia các phản ứng tiếp theo Thí nghiệm PCR luôn sử dụng đối chứng âm và cho kết quả âm tính, chứng tỏ quá trình thao tác không bị nhiễm DNA ngoại lai Kích thước băng sau khi so sánh với thang chuẩn cho kết quả phù hợp với kích thước lý thuyết, xấp xỉ 1093 bp
Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA khuụn 200 ng/àL 1 -Kộo dài cuối:
Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP
Xác định kiểu gen NAT2*5 bằng FastDigest KpnI Kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CC sẽ cho hai băng với kích thước là 659 bp và 434 bp; kiểu gen dị hợp tử CT cho ba băng có kích thước lần lượt là 1093, 659 và 434 bp; kiểu gen đồng hợp tử đột biến
TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A)
Hình 3 4 Phân tích ki ểu gen NAT2 dựa vào PCR-RFLP (A) Các kiểu gen NAT2*5, *7 điện di trên gel agarose 2%; M1: thang chuẩn kích thước DNA 1kb (B) Các kiểu gen NAT2*6 điện di trên gel acrylamide 10%; M2: thang chuẩn kích thước
DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm
Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng FastDigest TaqI Kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sau khi cắt bằng enzym giới hạn sẽ cho 4 băng điện di với kích thước 316,
226, 170 và 381 bp Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,
381, 316, 226 và 170 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B)
Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng FastDigest BamHI: Kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sẽ cho 2 băng với kích thước 810 bp và 283 bp, kiểu gen dị hợp GA cho 3
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU băng với kích thước 1093, 810 và 283 bp Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA không bị cắt cho 1 băng duy nhất với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A).
Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự
SNP Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9
Hình 3.5 là hình ảnh thu được về các loại kiểu gen của 6 alen khi phân tích kết quả giải trình tự trên phần mềm BioEdit 7.1.9 Tất cả các kiểu gen của 6 alen NAT2*5,
*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.
Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2
Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,
*7, *11, *12, *13 lần lượt là 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2) Kết quả tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP hoàn toàn giống nhau, tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh, trung bình, chậm thể hiện ở Bảng 3.3 lần lượt là 25 %, 38 % và 37
Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2
Tần số alen p - value χ 2 Đồng hợp tử kiểu dại
Dị hợp tử Đồng hợp tử đột biến
Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam
Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm Tổng
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2
Nhóm nghiên cứu lựa chọn 2 phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự để tiến hành nghiên cứu vì những ưu điểm của mỗi phương pháp về lý thuyết có tính bổ sung lẫn nhau Sau khi tiến hành nghiên cứu, hiệu quả của mỗi phương pháp khi phân tích các kiểu gen NAT2 cụ thể như sau
Khó khăn của nhân dòng gen NAT2 một phần do độ dài đoạn gen cần khuếch đại lớn hơn 1 kb Bên cạnh đó, các thuốc người bệnh đã sử dụng có thể tồn lưu trong mẫu DNA gây ức chế phản ứng PCR Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn Kapa2G T M Robust Hotstart Ready Mix đã có sẵn tất cả các chất cần thiết cho PCR, trừ mồi và DNA, qua đó giúp đơn giản hóa quy trình thao tác, giảm 20% -50% thời gian thực hiện so với các enzym khác Ưu điểm chính của enzym Kapa2G là khả năng PCR dù có sự hiện diện của một số chất ức chế, hoặc các mẫu DNA có độ tinh sạch chưa cao
Mặt khác, ngoài hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase, Kapa2G còn có hoạt tính 5’-3’ exonuclease cho phép tăng độ chính xác trong quá trình khuếch đại gen [63]
Ngoài enzym Kapa2G, HotStartTaq DNA polymerase của hãng QIAGEN cũng cho kết quả nhân dòng với hiệu suất và độ đặc hiệu cao Ưu điểm của HotStartTaq DNA polymerase QIAGEN là dễ dàng thực hiện nhân dòng với cả các mẫu có nồng độ DNA thấp, các mẫu DNA phức tạp khó nhân dòng Buffer dùng cho PCR của QIAGEN được thiết kế với điều kiện ủ mồi nghiêm ngặt, nồng độ Mg 2+ cao hơn các buffer PCR thông thường qua đó làm tăng hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng
Enzym của QIAGEN còn có ưu điểm là có dung dịch Q (thay vì DMSO), một chất không độc hại có tác dụng thay đổi độ tan chảy của DNA, tạo điều kiện khuếch đại các mẫu khó khuếch đại bằng các enzym thông thường [66]
4.1.2 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp này được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định đột biến, được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới đặc biệt trong lĩnh vực di truyền y học Với sự phát triển ngày càng đi lên của công nghệ nói chung và công nghệ y sinh nói riêng, giá thành giải trình tự cho mỗi mẫu phân tích tại Việt Nam ngày càng giảm, số lượng các cơ sở giải trình tự trong nước ngày càng nhiều Vì vậy, tại các cơ sở y tế nghiên cứu không có hệ thống giải trình tự vẫn có thể tiến hành gửi mẫu sang cơ sở khác đọc Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, đặc biệt giúp xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU nhạy rất cao Giải trình tự là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Trên thực tế, một gen có thể có rất nhiều đột biến liên quan đến nhiều bệnh khác nhau Vì vậy, trên cùng 1 đoạn gen đã được giải trình tự, chúng ta có thể cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ nhất của đối tượng tham gia nghiên cứu Trong nghiên cứu này, cặp mồi sử dụng cho phép nhân dòng toàn bộ vùng gen mã hóa cho enzym NAT2, vì vậy giải trình tự cung cấp rất nhiều thông tin di truyền về gen NAT2, kể cả các alen khác trên gen NAT2 Việc xác định được tất cả các đa hình trên gen NAT2 lần đầu tiên cung cấp bộ dữ liệu đa hình di truyền gen NAT2 ở người bệnh lao
Hiện nay phương pháp giải trình tự đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
Các đột biến DNA được phát hiện có vai trò trong đánh giá nguy cơ ung thư hoặc xác định tính hiệu quả của các thuốc điều trị đích sinh học, cho phép chẩn đoán nguy cơ và tình trạng mắc các bệnh lý thần kinh, bệnh lý di truyền như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis và các loại bệnh mất trí nhớ như bệnh Alzheimer
[4] Ngoài ra, kết quả giải trình tự còn giúp chẩn đoán xác định việc nhiễm một số loại virus, vi khuẩn và nấm, đánh giá sự liên quan giữa đột biến và khả năng đáp ứng hoặc kháng một vài loại thuốc Ngày nay, càng ngày càng có nhiều ứng dụng của giải trình tự được tìm ra cho thấy tầm quan trọng của phương pháp giải trình tự đối ngành y sinh học, dược học và các ngành liên quan [4]
Phương pháp PCR-RFLP có những ưu điểm vượt trội về thời gian thao tác nhanh, chi phí thấp và dễ thực hiện, vì vậy nhiều nhà nghiên cứu sử dụng phương pháp RFLP để tiến hành phân tích kiểu hình acetyl hóa thông qua 3 alen NAT2*5, *6,
*7 [43, 59] Như vậy, khi áp dụng vào thực hành lâm sàng, đối với các người bệnh cần yêu cầu gửi kết quả sớm, phương pháp RFLP là một lựa chọn sáng giá Phương pháp RFLP phân tích 3 alen NAT2*5, *6, *7 cho kết quả kiểu gen tương đồng hoàn toàn với giải trình tự, các kiểu hình xác định dựa trên 3 SNP và 6 SNP trong nghiên cứu không có sự khác biệt, giống nhau hoàn toàn Như vậy, chúng tôi khuyến cáo sử dụng kĩ thuật RFLP để dự đoán kiểu hình acetyl hóa thông qua 3 alen NAT2*5, *6, *7.
Về đa hình di truyền NAT2
Các biến thể di truyền NAT2 đóng vai trò quan trọng trong khả năng acetyl hóa của NAT2 tại gan, có thể tác động đến chuyển hóa thuốc và tính nhạy cảm với một số bệnh nhất định Phần lớn các nghiên cứu bỏ qua phân tích các đa hình không làm thay đổi chức năng của enzym, tập trung vào số ít các đột biến “chỉ thị” cho phép dự đoán được trạng thái acetyl hóa như NAT2*5,*6 và *7, *11, *12, *13 Vì vậy, nghiên cứu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU của chúng tôi đã thực hiện trên 100 người bệnh người Việt Nam mắc lao, kết quả tần số 6 alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 lần lượt là 6%, 32%, 12%, 49%, 6% và 7%
Kết hợp thêm các dữ liệu tần số alen NAT2 đã được công bố [61], tôi tiến hành so sánh kết quả của nghiên cứu với một số vùng và lãnh thổ khác nhau Như thể hiện trong
Hình 4.1, alen NAT2*5 xuất hiện với tần số nhỏ hơn 10% ở quần thể Đông Á, tuy nhiên ở các quần thể khác tần số của alen này khá cao từ 29% đến 45% Alen NAT2*7 xuất hiện ở quần thể Châu Âu và Châu Phi nhỏ hơn 3%, trong khi ở quần thể Đông Á xuất hiện với tần số cao nhất là 19%, trong nghiên cứu của chúng tôi là 12% (p 0,256) Alen NAT2*6 chiếm tỷ lệ khá cao ở các vùng là từ 23% đến 36% Trong khi NAT2*11 chênh lệch nhau không nhiều giữa các vùng địa lý, thì NAT2*12 và *13 có sự khác biệt rõ rệt, nhỏ hơn 10% ở người Việt Nam, Đông Á và trên 35% ở các vùng khác [61] Như vậy, tỷ lệ phân bố các alen là khác nhau giữa các vùng và dân tộc, tuy nhiên lại có sự tương đồng của các vùng địa lý gần nhau như trong nghiên cứu, trên nhóm dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam và trên người Đông Á Điều này cho thấy có sự ảnh hưởng của gần gũi địa lý đến cấu trúc di truyền quần thể
Hình 4 1 Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số vùng và khu vực trên thế giới Các mẫu được sắp xếp theo vị trí địa lý, bao gồm:
Châu Phi (n = 661), Châu Mỹ (n = 347), Châu Âu (n = 503) , Hồ Chí Minh ( Dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, n = 198), nghiên cứu (nhóm người Việt
Nam mắcl lao, n = 100), Đông Á (n = 504), Nam Á (n = 489) [61]
Song song với các nghiên cứu về tần số các alen gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, các nghiên cứu về tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, nồng độ INH sau khi uống của mỗi kiểu hình và liều điều trị thích hợp cho mỗi cá thể cũng đã và đang được thực hiện tại nhiều nước trên thế giới Geetha Ramachandran và S Swaminathan năm 2012 đã kết luận tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm là 10% ở người Mông Cổ như Eskimos, Nhật Bản và Trung Quốc, 90% ở Trung Đông, 60% ở Negroid, da trắng và Nam Ấn
Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Nghiên cứu Hồ Chí
NAT2*5 NAT2*6 NAT2*7 NAT2*11 NAT2*12 NAT2*13
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Độ và 72% ở Mỹ [49] Kiểu hình acetyl hóa chậm trong nghiên cứu của chúng tôi là 37%, thấp hơn so với Ấn Độ, Mỹ và Negroid; cao hơn ở người Mông Cổ, Nhật bản và Trung Quốc Trong một nghiên cứu lớn hơn trên 99 quần thể khác nhau trên thế giới của Audrey Sabbagh và cộng sự năm 2011 đã cho thấy một cái nhìn toàn thể hơn về sự phân bố khác nhau của kiểu hình acetyl hóa chậm (Hình 4.2) Nghiên cứu chỉ ra rằng sự phân bố này liên quan đến nghề nghiệp chủ yếu ở mỗi quốc gia hoặc vùng lãnh thổ khác nhau Điều này có thể do sự thích ứng với điều kiện môi trường đã ảnh hưởng lên bộ gen của con người, gây ra sự thay đổi về tần số alen để đáp ứng với sự thay đổi về môi trường phù hợp [29]
Hình 4 2 Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới
Mỗi biểu đồ hình tròn báo cáo tỷ lệ phần trăm, màu cam thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, màu vàng thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh và trung bình [13].
Nghiên cứu của Toure A và cộng sự trên 96 người bệnh mắc lao dựa trên 2 phương pháp chính là đo nồng độ INH trong huyết tương sau khi uống INH 3 giờ và 6 giờ để xác định chỉ số acetyl hóa và kiểu hình acetyl hóa là nhanh hay chậm và xác định kiểu gen NAT2 thông qua phương pháp PCR - RFLP hoặc giải trình tự [7] Việc đo nồng độ INH vào thời điểm 3 giờ sau khi uống để xác định nồng độ đỉnh của INH trong huyết thanh và chất chuyển hóa của INH là acetylisoniazid, đo vào thời điểm 6 giờ để xác định tình trạng hấp thu của mỗi cá nhân Kết quả nghiên cứu cho thấy các alen NAT2*4, *5A, *6A, *13A là quan trọng nhất và kết quả kiểu hình acetyl hóa tương đồng giữa hai phương pháp trên Đồng thời nghiên cứu cũng chứng minh sự gia tăng nồng độ INH huyết tương sau 3 giờ và 6 giờ của acetyl chậm cao hơn acetyl nhanh [7]
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Donald và cộng sự đã nghiên cứu tác động của liều isoniazid và kiểu gen
NAT2 trên cơ sở dược động học và dược lực học của INH ở người bệnh là người lớn mắc lao phổi Nghiên cứu cho thấy rằng sự acetyl hóa nhanh của INH nhận liều hàng ngày là 6 mg/kg có tác dụng tương tự như liều 3 mg/kg/ngày của kiểu hình acetyl hóa chậm Nhóm nghiên cứu cho rằng việc giảm liều INH dưới 6 mg/kg sẽ là bất lợi đối với người có kiểu hình acetyl hóa nhanh, nhưng liều 3 mg/kg là đủ cho người có kiểu hình acetyl hóa chậm để đạt được nồng độ INH điều trị hiệu quả [45] Nghiên cứu trên
326 người bệnh ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình, nhanh lần lượt là 58%, 35%, 7% Nồng độ INH trong máu sau 2 giờ sử dụng INH đơn độc (6 mg/kg) của kiểu hỡnh acetyl húa chậm, trung bỡnh, nhanh là 10,2 àg/mL; 8,1 àg/mL; 4,1 àg/mL (Hỡnh 4.3) Như vậy, người bệnh cú kiểu hỡnh acetyl húa chậm cú nồng độ INH trong máu cao hơn 2 kiểu hình còn lại, điều này dẫn đến sự tăng tạo thành các chất trung gian gây độc cho cơ thể [26] Một nghiên cứu khác trên 201 người bệnh tại Ấn Độ về tần số các đa hình NAT2 và mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa và nồng độ INH sử dụng phương pháp PCR-RFLP và HPLC cho kết quả tần số tương đương với các nghiên cứu trước đó ở Ấn Độ là 55%, 32%, 13%; tuy nhiên nồng độ INH trong huyết tương của kiểu hình acetyl hóa chậm cao hơn các nghiên cứu khác [39]
Hình 4 3 Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa[26]
Hầu hết các nghiên cứu về mối tương quan giữa hiệu quả của liều INH và kiểu hình acetyl hóa đều chỉ ra rằng các người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm nên sử dụng liều thấp hơn liều được khuyến cáo Nghiên cứu đối chứng ngẫu nhiên trên 172 người bệnh của Nhật Bản năm 2013 đã chứng minh điều trị liều INH theo kiểu gen
NAT2 giúp cải thiện khả năng dung nạp thuốc và tăng hiệu quả của phác đồ 6 tháng đối với người bệnh lao phổi mới Mục tiêu của nghiên cứu là xác định tỷ lệ tổn thương
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gan do INH (INH-DILI) trong 8 tuần điều trị và tỷ lệ thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8
Kiểm tra kết quả điều trị thông qua kết quả dương tính với vi khuẩn lao ở tuần thứ 8 hoặc hình ảnh X- Quang phổi không cải thiện (với người bệnh cấy đờm âm tính ban đầu) Nghiên cứu sử dụng liều điều trị theo kiểu gen hay còn gọi là dược di truyền học (Pharmacogenetic/-nomics - PGx) và theo liều chuẩn (Standard treatment dose -STD) theo các mức cân nặng trong 6 tháng với cả 3 kiểu hình Trong phác đồ PGx liều sử dụng cho kiểu hình acetyl hóa chậm sẽ giảm 0,5 lần STD, kiểu hình acetyl hóa trung bình dùng bằng STD và kiểu hình acetyl hóa nhanh tăng 1,5 lần STD Như vậy, liều dùng tương ứng lần lượt là 7,5 mg/kg với kiểu hình nhanh; 5 mg/kg với kiểu hình trung bình, và 2,5 mg/kg với kiểu hình chậm Với liều STD và PGx, kết quả thu được sau 8 tuần thể hiện ở Hình 4.4 cho thấy tỷ lệ tổn thương gan tăng theo thời gian và tăng mức độ nhanh ở với những người bệnh kiểu hình acetyl hóa chậm sử dụng STD
Hình 4 4 Tỷ lệ tổn thường gan do INH gây ra (INH-DILI) theo thời gian trong số 172 người bệnh Kiểu gen RA type: acetyl hóa nhanh; IA type: acetyl hóa trung bình, RA type: acetyl hóa chậm; PGx điều trị theo kiểu gen; STD điều trị theo liều chuẩn thông thường [23]