(Luận văn thạc sĩ) xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc lá nhỏ pico (chrysanthemum sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG INVITRO CÂY CÚC LÁ NHỎ PICO (Chrysanthemum sp.) Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS Hà Thị Loan Sinh viên thực : Huỳnh Thị Anh Đài MSSV : 1411100170 Lớp : 14DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu, nội dung, quy trình đồ án tồn đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn TS Hà Thị Loan Toàn đề tài đƣợc thực phòng thực nghiệm trồng Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 12/2017-7/2018 Tất nội dung, quy trình, số liệu đồ án chƣa đƣợc công bố tạp chí, hội thảo hay diễn đàn khoa học Đồ án đƣợc thực có tham khảo, trích dẫn số tài liệu đảm bảo tác quyền theo chuẩn quốc tế APA Trong trƣờng hợp có thắc mắc nội dung, số liệu đồ án tơi sẵn sàng xuất trình liệu có liên quan đƣợc lƣu trữ nơi thực đề tài TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực Huỳnh Thị Anh Đài LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trƣờng Đại học Công Nghệ TP HCM, đặc biệt Quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH Em biết đề tài đƣợc thực phản ánh phần kiến thức mà thầy cô biên soạn dạy cho em suốt năm qua, học, kinh nghiệm mà thầy cô giảng dạy giúp em nhiều Trong suốt thời gian em làm đề tài, giá trị đƣợc lặp lại lần nữa, em cảm nhận rõ hệ thống kiến thức tảng Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo cán viên chức Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh tiếp nhận, tạo điều kiện để em có nơi thực đề tài Và đặc biệt em muốn gửi lời tri ân sâu sắc đến TS Hà Thị Loan, nơi cô em hiểu tận tâm hƣớng dẫn, nhƣ nghiên cứu khoa học Ngoài em khám phá đƣợc lý thuyết thông qua cách cô giúp em bƣớc giải khó khăn Em nhận đồng hành em nhƣ phân công anh kĩ sƣ Trịnh Bá Uy thƣờng trực phịng thí nghiệm để hỗ trợ em Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, ba mẹ em không trực tiếp giúp việc làm đề tài, nhƣng cách hay cách khác gia đình động viên, lắng nghe chia gặp khó khăn, khích lệ cố gắng, giúp đỡ tài tinh thần, xin ghi khắc Luận văn thành khoa học em, nên chắc có thiếu sót nội dung Rất mong đƣợc quý thầy nhà khoa học nhận xét, đóng góp ý kiến để em đƣợc học hỏi, rèn luyện trƣởng thành Xin chân thành cảm ơn Quý thầy tồn thể ân nhân Trân trọng MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam 1.1.4 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.4.1 Tính tồn tế bào 1.1.4.2 Tính phân hóa phản phân hóa tế bào 1.1.5 Các giai đoạn nuôi cấy mô 1.1.5.1 Chuẩn bị mẹ, lựa chọn mẫu cấy: 1.1.5.2 Khử trùng mẫu cấy 1.1.5.3 Tạo thể nhân giống in vitro tăng sinh mô 1.1.5.4 Ra rễ in vitro tái sinh hoàn chỉnh 1.1.5.5 Chuyển vƣờn ƣơm 1.1.5.6 Ra rễ ex vitro 1.1.6 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 1.1.6.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chồi bất định 1.1.6.2 Nuôi cấy tế bào đơn 1.1.6.3 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô 10 1.1.8 Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng 11 1.1.9 Tổng quan ánh sáng 13 1.2 Tổng quan cúc 17 1.2.1 Phân loại khoa học 17 1.2.2 Nguồn gốc, lịch sử phân bố 17 1.2.3 Đặc điểm thực vật học 19 1.2.4 Tình hình nhân giống cúc giới Việt Nam 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 i 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đồ án 23 2.1.1 Địa điểm 23 2.1.2 Thời gian 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 23 2.2.2 Trang thiết bị 23 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 24 2.3 Phƣơng pháp 25 2.3.1 Pha môi trường 25 2.3.2 Hấp khử trùng 25 2.4 Bố trí thí nghiệm 25 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 26 2.4.2 Pico Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến nhân chồi mẫu cúc 27 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nước dừa đến khả nhân chồi mẫu cúc 28 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng loại đèn chiếu sáng đến nhân nhanh chồi mẫu cúc 29 2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến rễ mẫu cúc 30 2.5 Thống kê xử lý số liệu 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 32 3.2 Ảnh hƣởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 34 3.3 Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 37 3.4 Ảnh hƣởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico 40 3.5 Ảnh hƣởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 – Dichlorphenoxy acetic acid BA Benzyl adenyl Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid GA3 Gibberellic acid IAA Indolylacetic acid IBA Indole -3-Butyric acid LED Light Emitting Diode MS Murashige and Skoog NAA Naphthul acetic acid RNA Ribonucleic acid TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh Vitamin B1 Thiamin Vitamin B2 Riboflavin Vitamin B6 Pyridoxin iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 27 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả nhân chồi mẫu cúc 28 Bảng 2.3 Khảo sát nồng độ nƣớc dừa thích hợp đến tái sinh chồi mẫu cúc 29 Bảng 2.4 Khảo sát loại đèn LED thích hợp đến tái sinh chồi mẫu cúc 30 Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hƣởng NAA đến rễ mẫu cúc 31 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc 32 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 35 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 38 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico 41 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 44 iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng thời gian khử trùng Javel 5% đến vô trùng mẫu thân cúc Pico .33 Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico .35 Biểu đồ 3.3: Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico .38 Biểu đồ 3.4: Ảnh hƣởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico .41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 45 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Phổ hấp thụ ánh sáng thực vật 14 Hình 1.2 Chrysanthemum sp .17 Hình 1.3 Một số hình ảnh cúc Pico 21 Hình 2.1 Chrysanthemum sp…………………………………………………….23 Hình 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng 5% Javel đến vô trùng mẫu thân cúc Pico 33 Hình 3.2 Ảnh hƣởng BA đến nhân chồi mẫu cúc Pico 36 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến nhân chồi mẫu cúc Pico 39 Hình 3.4 Ảnh hƣởng loại đèn chiếu sáng lên nhân nhanh chồi cúc Pico .42 Hình 3.5 Ảnh hƣởng NAA đến rễ mẫu cúc Pico 45 vi Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đời sống ngƣời ngày đƣợc cải thiện kéo theo không gian sống ngày chất lƣợng, ngƣời ta hƣớng tới sống đầy đủ tiện nghi phong cách Đặc biệt thành phố lớn, nơi đời sống ngƣời dân cao nhƣng lại thiếu vẻ đẹp hoang sơ thiên nhiên Chính thế, hoa đƣợc sử dụng nhƣ quà tinh thần bù đắp lại thiếu sót Việc trƣng bày hoa nơi công sở để bàn làm việc thêm sắc màu hay dùng hoa để thay lời nói ngày lễ tết thu hút đam mê nhiều ngƣời Trong đó, hoa cúc chiếm vị trí lớn, theo (Đặng, 2006) cho biết, với màu sắc phong phú, kích cỡ hình dáng đa dạng, dễ điều khiển cho hoa tạo nguồn giống quanh năm khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa đƣợc tiêu thụ đứng thứ hai giới sau hoa hồng Ngày cúc đƣợc sử dụng rộng rãi sống, ngồi trang trí, cúc cịn đƣợc dùng để làm cảnh, thờ cúng, dƣợc liệu, trà,…Ở nhiều nơi, ngƣời ta tin cúc biểu tƣợng sống, niềm tin, bắt đầu Cúc đƣợc đƣa vào đời sống ngƣời dân nhƣ q tinh thần khơng thể thiếu ngày đặc biệt Nhắc đến cúc ta kể đến cúc nhỏ hay gọi cúc Pico, tên khoa học Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae, nguồn gốc Châu Á, Châu Âu Cúc Pico thân thảo, có bế, mọc bóng râm, chiều cao trung bình 2050cm Hiện nay, cúc Pico đƣợc Dalat hasfarm nhập hạt giống trồng, Dalat hasfarm độc quyền với loại hoa này, ngồi cịn có số sở nhỏ lẻ trồng vài biện pháp thủ công nhƣ giâm cành Việc làm cho mức độ nhân giống không cao, dễ nhiễm bệnh từ mẹ, ngồi khơng có kỹ thuật tốt làm ảnh hƣởng đến mẹ, dễ gây thoái hóa giống Vì cần chọn biện pháp để nhân nhanh mà lại giúp bảo tồn giống, không làm ảnh hƣởng đến mẹ thách thức lớn Hơn nữa, mức độ tiêu thụ cúc mạnh, Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.1489 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NAA A A A 10.6933 9.6233 C C C 9.0533 1.5 8.3667 2.5 7.6567 0.5 B B B D D D 36 Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 19:49 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for SORE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.398813 Number of Means Critical Range 1.149 1.201 1.231 1.250 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NAA A A A 10.6933 9.6233 C C C 9.0533 1.5 8.3667 2.5 7.6567 0.5 B B B D D D 37 Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIỀU DÀI RỄ THÍ NGHIỆM The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Class Level Information Class NAA CHIEUDAIRE Levels 14 Values 0.5 1.5 2.5 3.34 3.7 3.85 3.91 4.15 4.16 4.4 4.44 4.68 4.71 4.76 4.85 5.42 5.67 Number of observations 38 15 Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAIRE Source DF Squares Sum of Mean Square F Value Pr > F Model 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 Source NAA Error 10 2.02820000 Corrected Total 14 5.48164000 0.20282000 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAIRE Mean 0.630001 10.12490 0.450355 4.448000 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 3.45344000 0.86336000 4.26 0.0288 39 Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 10 0.20282 2.22814 0.8193 Means with the same letter are not significantly different t Grouping B B B B B A A A A A C C C C C 40 Mean N NAA 5.1767 4.7167 4.4700 0.5 4.0567 1.5 3.8200 2.5 Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:21 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for CHIEUDAIRE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 8193 0.05 10 0.20282 8562 8779 8918 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping B B B B B A A A A A C C C C C 41 Mean N NAA 5.1767 4.7167 4.4700 0.5 4.0567 1.5 3.8200 2.5 Đồ Án Tốt Nghiệp - XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Class Level Information Class NAA SOCHOI Levels 13 Values 0.5 1.5 2.5 2.1 2.27 2.37 2.5 2.83 3.53 4.13 4.3 4.47 5.07 5.13 5.47 Number of observations 42 15 Đồ Án Tốt Nghiệp The SAS System 20:17 Friday, July 16, 2018 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Source DF Squares Sum of Mean Square F Value Pr > F Model 18.67180000 4.66795000 65.45 F 18.67180000 4.66795000 65.45