ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh
100 Người bệnh mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội tham gia cung cấp mẫu Tiêu chuẩn chọn người bệnh theo Khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [2]
2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;
Tai biến mạch não dưới 3 tháng; Mới phẫu thuật dưới 1 tuần; Chống chỉ định dùng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu; Nguy cơ cao chảy máu; Suy thận, suy gan giai đoạn cuối; Không đồng ý tham gia nghiên cứu
2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018 Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);
DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific)
Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Tủ lạnh sâu Panasonic (Nhật Bản); Máy quang phổ NP 80 Nanophotometer (Implen, Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm
Về lượng mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên dụng chứa sẵn EDTA chống đụng (tối thiểu 300 àL mỏu/ống) Mỗi ống mỏu đủ cho
1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh
Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -20 đến -30 0 C cho đến khi được sử dụng Nếu không có tủ lạnh -20 0 C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá không quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ -20 0 C để bảo quản
Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU với các thông tin: tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA
2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit
Các bước thao tác được tiến hành như sau:
Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng
Bước 2 Lắc đều ống mỏu Chuyển 250àL mẫu vào ống ly tõm vụ trựng Bước 3 Thờm 25 àL OB Protease Solutionvà 250 àL BL Buffer, vortex 10 giõy Bước 4 Ủ 65 o C trong 10 phút Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây Bước 5 Thờm 260 àL Ethanol 100% Vortex trong 20 giõy
Bước 6 Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và nắp ống Bước 7 Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 mL Bước 8 Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 àL)
Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube
Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới Bước 12 Thờm 500 àL HBC Buffer
Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 15 Thờm 700 àL DNA Wash Buffer
Bước 16 Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 vòng/phút Bước 17 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube Bước 18 Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer
Bước 19 Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/p trong 2 phút để làm khô cột Bước 20 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới Bước 21 Thờm 100 àL Elution Buffer (đó làm ấm đến 65 o C) Ủ ở 65 o C trong 5 phút
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút Bước 23 Thờm 50 àL Elution Buffer trong 5 phỳt ở nhiệt độ phũng Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 o C
2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’
GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’ Dựa trên trình tự DNA tham chiếu trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia- Mỹ (National Center for Biotechnology Information
- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp
2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA
DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá chất lượng thông qua hai phương pháp được mô tả bên dưới Đánh giá chất lượng DNA thông qua phương pháp đo quang
Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA
Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 àL Elution buffer dựng để pha loóng DNA làm dung dịch đo mẫu trắng
Bước 3 Đo mẫu DNA: lấy 2 àL mỗi mẫu DNA để đo, mỏy sẽ tự động tớnh toỏn nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa vào giá trị OD260 và OD280 thu được Đánh giá chất lượng DNA thông qua điện di trên gel agarose
Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm
TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60 o C thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo các giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, gel đã đông lại, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, phần giếng nằm gần phía cực âm của máy Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1 – 2 mm
Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 àL mẫu DNA được trộn với 1 àL 6X DNA loading dye đó nhuộm Ethidim Bromua trước khi tra vào giếng 5 àL thang chuẩn
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR
Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút
Bước 4: Quan sát kết quả: Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra khỏi khuôn, soi dưới ánh sáng tử ngoại trong hệ thống phân tích kết quả Gel-DocIt Các mẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di sáng, rõ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA
100 mẫu máu toàn phần được lấy từ tĩnh mạch của người bệnh sau phẫu thuật thay van tim có điều trị chống đông bằng thuốc acenocoumarol tại Bệnh viện Tim Hà Nội đã được tách chiết DNA tổng số thành công Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh đầu tiên quan sát ở Hình 3.1 cho thấy các băng DNA tổng số đều lên sáng rõ
Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm nghiên cứu Làn 1-10: DNA tổng số của 10 người bệnh
Làn M: Lamda/HindIII DNA ladder Kết quả đo quang phổ hấp thụ ở các bước sóng 260 nm và 280 nm để đánh giá chất lượng 100 mẫu thu được trình bày ở Bảng 3.1 Mỗi mẫu được đo 2 lần và lấy giá trị trung bình Nồng độ DNA thu hồi dao động trong khoảng từ 41,15 đến 133,90 ng/àL, trung bỡnh 111,0 ± 47,7 ng/àL Mẫu cú độ tinh sạch cao, với 90/100 mẫu có chỉ số OD nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,2 Tỉ số OD260/280 trung bình là 2,02 ± 0,01, chứng tỏ các mẫu này tương đối sạch Như vậy DNA được tách chiết đạt yêu cầu cho phản ứng khuếch đại DNA bằng PCR tiếp theo
Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số
Chỉ số Giá trị trung bình ± sai số SE
Nồng độ DNA (ng/àL) 111,0 ± 47,7
Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3
Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho CYP2C9, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ DNA sử dụng và và nồng độ hoạt động của mồi được tiến hành tối ưu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase
10 nhiệt độ dao động quanh nhiệt độ gắn mồi được hãng khuyến cáo được thử nghiệm Kết quả điện di trình bày ở Hình 3.2 Ở dải nhiệt độ từ 50,8-56,6 o C xuất hiện các băng điện di không đặc hiệu Ở nhiệt độ 67,2 - 69,0 o C băng điện di giảm độ sáng hoặc không lên băng Trong dải nhiệt độ 58,8 - 65,5 o C băng điện di lên đặc hiệu và sáng rõ nhất Do đó, tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng nhân dòng đoạn gen chứa CYP2C9*3 trong dải 58,8 - 65,5 o C Dải nhiệt độ gắn mồi rộng cho phép có thể chạy ghép nhiều phản ứng nhân dòng các gen khác nhau nhưng cho chu trình nhiệt trùng nhau
Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M: DNA marker 100bp-4kb
Làn (-): đối chứng âm Làn (+): đối chứng dương
3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA
Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối ưu nồng độ mồi (A)và nồng độ DNA (B) nhân dòng alen CYP2C9*3 Làn M: DNA marker 100bp-4kb Làn ĐC (-): đối chứng âm
Thực hiện PCR ở các nồng độ DNA lần lượt là: 5, 10, 50, 100 và 200 ng/μl cho kết quả điện di như ở Hình 3.3 Nồng độ DNA cho lên băng kích thước rõ
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU trong khoảng từ 5-200 ng/àL, khụng cú băng phụ xuất hiện, chứng tỏ phương phỏp có độ nhạy cao, có thể nhân dòng đoạn gen với nồng độ DNA rất thấp Tiếp tục PCR ở cỏc nồng độ mồi lần lượt là: 0,5; 0,7; 0,9 àM Hỡnh 3.3 cũng cho thấy nồng độ mồi 0,5 àM, cỏc băng điện di xuất hiện khỏ rừ nột ở kớch thước tương ứng 719 bp như lý thuyết và không có băng phụ Như vậy, nồng độ DNA của phản ứng nhân dòng CYP2C9*3 tối ưu trong khoảng 5-200 ng/μl, nồng độ hoạt động của mồi tối ưu là 0,5 àM Phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 cú thành phần và điều kiện phản ứng sau khi tối ưu được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2C9*3
Thành phần Nồng độ hoạt động
Thể tích phản ứng (30 àl) Điều kiện phản ứng
DNA khuụn 100 ng/àl 1,5 - Biến tớnh:
72 0 C – 2 phút dNTP mix 2 mM 0,2 mM 3,0
Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel agarose 1,5 % Làn M: DNA marker 100bp-4kb, Làn 1-3: sản phẩm PCR của 3 mẫu người bệnh, Làn 4: Đối chứng âm Áp dụng quy trình trên, 100 người bệnh tham gia nghiên cứu đều được nhân dòng thành công đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3, kết quả sản phẩm thu được ổn định, đặc hiệu với 1 băng sáng rõ như ví dụ trong Hình 3.4 Tất cả các thí nghiệm
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đều có đối chứng âm không lên, chứng tỏ phản ứng PCR không bị nhiễm trong quá trình thao tác.
Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3
Kết quả giải trình tự trong nghiên cứu được trình bày trong Hình 3.5 Trong nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu, người bệnh mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC chưa thấy xuất hiện Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen thể hiện ở Bảng
AA (đồng hợp tử kiểu dại)
(đồng hợp tử đột biến)
Hình 3.5 Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự Bảng 3.3 Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3 SNP Tần số kiểu gen (%) Tần số alen
CC AC AA A C Giá trị p
Kết quả xác định và phân tích kiểu gen của CYP2C9*3 (n = 100) cho thấy: kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại AA chiếm tỉ lệ 96 % và chỉ có 4 % người bệnh mang kiểu gen dị hợp tử AC Từ đó, tôi tính được tần số xuất hiện của alen C là 0,02, alen
A là 0,98 Kiểm định với X 2 = 0,0416, giá trị p = 0,84 Như vậy, tần số các alen thu được trong nghiên cứu này phù hợp theo định luật Hardy-Weinberg, chứng tỏ cấu trúc di truyền của các alen này có thể đã trở nên ổn định trong nhóm mẫu nghiên cứu
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
BÀN LUẬN
So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau
Theo kết quả của dự án 1000 genome giai đoạn 3 đã được công bố [49], tần số alen C tại các quần thể được báo cáo và thể hiện trong Hình 4.1
Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số 48
Quan sát biểu đồ phân bố alen C ở một số quần thể người nhận thấy: nếu như tần số alen C xuất hiện rất ít ở các quần thể người Châu Phi (0,2%) thì ở quần thể người Châu Âu con số đó chiếm hơn 7 %, còn với khu vực Nam Á tần số này tăng tới hơn 10 % Tần số ở khu vực Đông Á tương đồng gần nhất với kết quả nghiên cứu của tôi, điều này có thể giải thích do dự gần gũi về mặt địa lý
Nghiên cứu của tôi trên nhóm người bệnh cho tần số alen C là 2 %, ở quần thể người bình thường tại Tp Hồ Chí Minh tần số alen C là 3,5 % [49] Tuy nhiên sự khác nhau giữa nhóm bệnh và nhóm bình thường này là không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Điều này được giải thích rằng đột biến CYP2C9*3 không phải đột biến gây bệnh, mà là đột biến liên quan đến chuyển hóa thuốc, do đó giữa 2 nhóm sẽ không có sự khác nhau có ý nghĩa
Kết quả nghiên cứu cho thấy alen A chiếm tỉ lệ rất lớn trong quần thể với 98
% Kiểu gen chuyển hóa bình thường AA 96 %, chuyển hóa chậm AC 4 %, và không xuất hiện kiểu gen CC cho thấy khả năng đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K ở người Việt Nam là tương đối tốt
Châu Mỹ Châu Phi Châu Âu Nam Á Đông Á
Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu này
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của đa hình di truyền đã được nghiên cứu và chứng minh hiệu quả như: giải trình tự gen, kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP), PCR định lượng (Realtim PCR) Tuy nhiên, giải trình tự gen vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt là với các gen mới, cần hiểu thêm thông tin di truyền về các đột biến trong đó Ưu điểm của phương pháp giải trình tự gen: kỹ thuật ngày càng phổ biến, chi phí ngày càng hạ
Có thể nói hiện nay giải trình tự vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm tại Việt Nam
Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP a: độ dài của alen X; b: độ dài của alen Y; c = a + b - (d - 1): độ dài giữa mồi 1F và 2R; d: tổng chiều dài của 2 mồi 2F và 1R [41]
Ngoài giải trình tự, một số phương pháp phân tích CYP2C9*3 khác đã được các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới thực hiện Nghiên cứu của Tamura và cộng sự tại Nhật Bản (2014) thực hiện phân tích đa hình CYP2C9*3 bằng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase với các cặp mồi kép (PCR-CPTT) Nguyên lý của phương pháp này là nhân dòng gen dựa trên 4 đoạn mồi (2 cặp mồi) là F1 và R1 cho alen X, F2 và R2 cho alen Y Phản ứng PCR khuếch đại tạo ra 3 đoạn DNA có kích thước khác nhau nằm giữa F1 và R1, giữa F2 và R2 và giữa F1 và R2 Nguyên lý của phương pháp thể hiện ở Hình 4.2 Chu trình nhiệt họ sử dụng là biến tính: 95 ºC – 10 phút – 1 chu kỳ; 30 chu kỳ: 95 ºC – 1 phút, 62 ºC – 10 giây, 72 ºC – 1 phút; kết thúc: 72 độ C – 5 phút – 1 chu kỳ Kết quả điện di xác định 3 kiểu gen như sau: kiểu gen *1/*1 (hay AA) cho 2 băng là 125 và 287 bp, kiểu gen *1/*3 (hay AC) cho
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
3 băng là 125, 200 và 287 bp, kiểu gen *3/*3 (hay CC) cho 2 băng là 200 và 287 bp Tuy nhiên đây là kỹ thuật yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ thao tác cao nếu không phản ứng PCR không ổn định, kết quả sẽ không chính xác
Ngoài ra Realtime PCR (hay còn gọi là PCR định lượng – qPCR) là kỹ thuật mới dựa trên phản ứng PCR cũng ngày càng được sử dụng nhiều Người thực hiện sẽ theo dõi sự khuếch đại của một phân tử DNA đích sau từng chu kỳ nhiệt của phản ứng, không phải ở cuối phản ứng như PCR thông thường Realtime PCR có cùng nguyên lý với phương pháp PCR nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang
Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA [7] Một số nhóm nghiên cứu sử dụng qPCR để xác định kiểu gen CYP2C9*3 có thể kể đến như nghiên cứu của Sangviroon (Đại học Chulalongkorn, Thái Lan) sử dụng qPCR với đầu dò phát huỳnh quang fluorogen [37] Một nhóm nghiên cứu khác tại Mỹ cũng sử dụng qPCR phân tích 75 người bệnh trẻ tuổi để phát hiện kiểu gen CYP2C9*3 [34] Hay nghiên cứu của Chen Jiyang sử dụng qPCR xác định kiểu gen trên nhóm 257 người bệnh Trung Quốc [20, 50] Tuy nhiên, việc đầu tư ban đầu cho hệ thống máy Realtime PCR và các hóa chất tiêu hao có chi phí khá cao, phương pháp này lại cần kỹ thuật viên với kiến thức và kỹ năng phân tích kết quả phức tạp hơn.
Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol
Nghiên cứu của nhóm nghiên cứu dược lý học thuộc Hiệp hội dược sĩ Hoàng gia Hà Lan (The Royal Dutch Association for the Advancement of Pharmacy – Pharmacogenetics Working Group) đã đưa ra một số khuyến cáo về liều thuốc chống đông kháng vitamin K trên kiểu gen CYP2C9 Thông tin cụ thể được tóm tắt trong Bảng 4.1 Theo Schalekamp và cộng sự, nhóm người bệnh sự hiện diện của một alen CYP2C9* 3 thì cần giảm 20 % liều điều trị acenocoumarol ban đầu Mức độ giảm liều cao hơn hẳn so với alen *2 (chỉ 1%) cho thấy ảnh hướng của alen *3 cao hơn *2 trong chỉ định liều dùng thuốc Kết quả của nghiên cứu này cũng tương đồng với nghiên cứu của Visser và cộng sự, người bệnh chỉ mang 1 alen *3 nên giảm 20% liều ban đầu, chỉ mang 1 alen *2 thì nên giảm 13%, số lượng alen *2 và
*3 càng tăng thì mức độ giảm liều càng mạnh, giảm liều cao nhất tới 40% khi người bệnh mang cả hai alen *2, *3 Một nghiên cứu khác của Visser cũng cho thấy tăng nguy cơ chảy máu ở người bệnh mang alen *2 và *3 gấp trung bình 1,83 lần so với người bệnh không mang 2 alen này
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan
Tài liệu tham khảo Số người tham gia Mối liên quan
Schalekamp, 2004 [39] 231 Giảm liều khi mang 1 alen: *2: 1 %, *3: 20 % Visser, 2004 [46] 1124
Visser, 2004 [47] 996 Nguy cơ chảy máu tăng 1,83 khi mang alen
Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm nghiên cứu người Tây Ban Nha [13]
Sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hoá enzym CYP2C9 0,119
Một thuật toán định lượng liều acenocoumarol nghiên cứu trên nhóm 147 người bệnh người Tây Ban Nha [13] cũng đã được công bố Với các biến và ảnh hưởng của chúng mô tả ở Bảng 4.2, bác sĩ sẽ đưa ra liều khởi đầu dựa trên khuyến
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU đông của các biến ở cột 2 Nghiên cứu này cũng cho thấy, CYP2C9*3 có ảnh hưởng đến định liều acenocoumarol Bệnh cạnh đó, một sô các biến khác cũng cần quan tâm nghiên cứu đó là tuổi tác, cân nặng và chiều cao (qua đó tính được chỉ số BMI), tình trạng sử dụng thuốc cảm ứng hoạt hóa enzym CYP2C9, tình trạng amiodarone, sự có mặt của alen CYP2C9 * 1 và * 2, kiểu gen VKORC1, kiểu gen CYP4F2, kiểu gen APOE Xem xét trong nhóm người bệnh có các đặc điểm lâm sàng tương đồng, thuật toán dự đoán chính xác liều ổn định thực sự trong 59,8 % trường hợp, cao hơn so với mức 37,6 % trường hợp nếu chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng
Tương tự, một thuật toán chi tiết hơn được xây dưng cho nhóm 100 người bệnh Bắc Ấn Độ [35] cũng dựa trên các yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc và mức độ của chúng, thuật toán tính liều chi tiết như sau:
Liều lượng (mg/ngày) = 3,082 - 0,013 x (tình trạng hút thuốc, 1 cho người hút thuốc và 0 cho người không hút thuốc) - 0,433 x (giới tính, 1 cho nam và 0 cho nữ) - 0,004 x (tuổi theo năm) + chỉ định x (0,327 cho người bệnh thay van đôi và - 0,092 cho người bệnh thay van động mạch chủ) + 0,026 x (chiều cao tính bằng cm) + 0,151 x (trọng lượng tính bằng kg) – 7,660 x (diện tích bề mặt cơ thể tính bằng cm2) – 0,862 x (VKORC1 AG) – 2,257 x (VKORC1 AA) – 0,049 x (CYP2C9 * 1 / *
2 ) – 0,456 x (CYP2C9 * 1 / * 3) + 0,449 x (CYP4F2 AG) + 0,230 x (CYP4F2 AA)
Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau THUẬT TOÁN LIỀU TRUNG BÌNH (mg/tuần)
Liều điều trị khuyến cáo 21,31 ± 8,35 Nghiên cứu Bắc Ấn Độ [35] 21,16 ± 4,82 Nhóm nghiên cứu Thổ Nhĩ Kỳ [33] 27,16 ± 1,19 Nhóm nghiên cứu Trung Quốc [48] 27,87 ± 4,94
Thuật toán dược động học của Ấn Độ giải thích được lý do phải thay đổi liều ở người bệnh (chiếm 41,4 %, p < 0,001) Khi so sánh kết quả liều dự đoán với liều điều trị thực tế tại bệnh viện trong khu vực, họ xác nhận rằng khả năng dự đoán của liều điều trị trong thuật toán này tốt hơn các thuật toán đã được thiết lập dựa trên các biến tương tự mà các nhóm nghiên cứu khác đã làm năm 2008, chi tiết theo
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Bảng 4.3 Điều này có thể giải thích do số lượng biến của họ nhiều hơn, mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố được xem xét kỹ lưỡng, phân loại cẩn thận hơn
Khi tiến hành so sánh giữa các thuật toán được đưa ra ở trên, tôi nhận thấy có nhiều yếu tố khác nhau như chiều cao, cân nặng, kiểu gen… ảnh hưởng tới liều điều trị acenocoumarol Kết quả dự báo bằng các thuật toán dược động học cho thấy có khả năng dự đoán liều nhanh và tốt hơn chỉ dựa vào đặc điểm lâm sàng hay chỉ số cận lâm sàng của người bệnh Nghiên cứu về các thuật toán dược động học dự đoán liều chính là cơ sở của y học cá thể hóa, đem lại chất lượng điều trị tốt nhất cho từng người bệnh Tuy nhiên, tôi cũng nhận thấy mức độ ảnh hưởng của từng biến đến liều điều trị acenocoumarol có sự khác nhau giữa các nhóm Chính vì vậy, tôi mạnh dạn đề xuất tiến hành nghiên cứu xác lập thuật toán phù hợp cho người bệnh Việt Nam, tiến tới định liều thuốc cho từng người bệnh trong tương lai
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Dựa vào những kết quả đạt được, tôi đưa ra một số kết luận như sau:
- Quy trình phân tích kiểu gen CYP2C9*3 sử dụng mẫu máu toàn phần đã được xây dựng thành công
- Áp dụng thành công quy trình phân tích gen CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sử dụng chống đông acenocoumarol sau thay van tim tại Bệnh viện Tim Hà Nội Số lượng kiểu gen AA, AC lần lượt là 96% và 4% Tần số đột biến C là 0,02
Hướng tới y học cá thể hóa điều trị, cung cấp cho người bệnh chất lượng điều trị cao hơn, hạn chế biến chứng có thể xảy ra, tôi có một số kiến nghị như sau:
- Mở rộng nghiên cứu xác định kiểu gen CYP2C9*3 với cỡ mẫu lớn hơn và tiến hành các nghiên cứu xác định mức độ ảnh hưởng của kiểu gen này tới sự chuyển hóa của acenocoumarol
- Tiến hành phân tích thêm tác động của các yếu tố khác như chiều cao, cân nặng, độ tuổi, các gen mới… nhằm xây dựng được thuật toán giúp định lượng liều acenocoumarol cho người bệnh Việt Nam
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), "Phân tích gen và sản phẩm của gen", Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội
2 Hội Tim mạch (2008), Khuyến cáo 2008 của Hội tim mạch Việt Nam về chẩn đoán điều trị các bệnh van tim
3 Lê Thị Nhiên (2016), “ Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 ở người bệnh đặt Stent động mạch vành qua da”, Luận văn Thạc sĩ Dược học Đại học Dược Hà Nội
4 Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học
5 Phạm Hùng Vân (2009), "Real-time PCR Các vấn đề cơ bản", PCR và realtime PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học,
6 Phạm Thị Minh Đức (2011), “ Sinh lý máu”, Sinh lý học, NXB Y học
7 Tạ Thành Văn (2010), "Realtime PCR và PCR định lượng", PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, 33-66
8 Võ Thị Thương Lan (2007), "Phản ứng PCR", Một số vấn đề của sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 86-88
9 Abhijit Trailokya, JS Hiremath, JPS Sawhney và các cộng sự (2016),
“Acenocoumarol; A Review of Anticoagulant Efficacy and Safety”, Journal of The Association of Physiccian of India, 64
10 Alec Vahanican, Ottavio Alfrieri, Felicita Andreotti và các cộng sự (2012),
“Guideline onthe management of valvular heart disease”, European Heart
11 Ansell J, Hirsh J, Hylek E và các cộng sự (2008), “ Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”,
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU