Khảo sát đa hình gen cyp2c93 và vkorc1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông acenocoumarol​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Lệ Hằng KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1 TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Thị Lệ Hằng, học viên cao học khóa 25 (2016-2018), chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn của: TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm Ngƣời viết cam đoan Đỗ Thị Lệ Hằng LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung người hướng dẫn khoa học, người Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tơi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội, mã số: QG.17.29 cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Trung Kiên, chủ nhiệm đề tài hỗ trợ tạo điều kiện cho thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy cô, nhà Khoa học Hội Đồng chấm đề cương luận văn tốt nghiệp đóng góp ý kiến q báu, giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu nhà trường, phịng Đào Tạo sau Đại Học, Thầy Cơ Khoa Sinh học Thầy Cô môn Sinh học Tế Bào Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội cho kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Các cán Bộ môn Y Dược học sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Các bác sĩ nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội giúp đỡ tơi nhiều q trình hồn thành luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn Bố Mẹ người thân gia đình với bạn bè đồng nghiệp chỗ dựa vững tơi, ln thương u, khuyến khích, động viên tạo điều kiện tốt tinh thần giúp hồn thành tốt chương trình học tập thực thành công luận văn Cuối xin gửi lời tri ân tới bệnh nhân tham gia vào nhóm nghiên cứu, đóng góp bệnh nhân giúp tơi có thành cơng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lý van tim thay van tim 1.2 Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim 1.3 Dược di truyền học acenocoumarol 1.4 Tổng quan đa hình di truyền gen CYP2C9*3 gen VKORC1 1.4.1 Khái niệm đa hình đơn nucleotide 1.4.2 Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 mối liên quan tới liều thuốc acenocoumarol 11 1.4.3 Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 mối liên quan tới liều thuốc acenocoumarol 15 1.4.4 Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 18 1.5 Tình hình nghiên cứu mối liên quan di truyền học liều thuốc acenocoumarol giới nước 21 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 26 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 26 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 27 2.3.1 Hóa chất 27 2.3.2 Thiết bị 28 2.3.3 Dụng cụ 28 2.3.4 Mẫu nghiên cứu 28 2.4 Các bước nghiên cứu 29 2.4.1 Quy trình nghiên cứu 29 2.4.2 Thu thập, xử lý bảo quản mẫu 30 2.4.3 Tách chiết kiểm tra chất lượng DNA tổng số 30 2.4.4 Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 32 2.4.5 Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 phương pháp PCR 32 2.4.6 Tinh sản phẩm PCR 33 2.4.7 Xác định kiểu gen SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải trình tự gen 34 2.4.8 Xác định kiểu gen SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự gen 35 2.4.9 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 37 2.5 Xử lý phân tích số liệu 37 2.6 Các loại sai số cách khắc phục 37 2.6.1 Sai số mắc phải 37 2.6.2 Cách khắc phục sai số 37 2.7 Đạo đức nghiên cứu 38 Chƣơng KẾT QUẢ 39 3.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 39 3.2 Kết phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKOCR1 40 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 40 3.2.2 Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 41 3.2.3 Kết khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 47 3.2.4 Kết phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 50 3.3 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 55 3.3.1 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 55 3.3.2 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP rs9923231 rs99 rs9934438 gen VKORC1 56 3.4 Tỷ lệ kiểu gen phối hợp SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 57 Chƣơng BÀN LUẬN 58 4.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 59 4.2 Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934438 gen VKORC1 60 4.3 Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 SNP rs9923231, SNP rs9934348 gen VKORC1 62 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 76 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A H A EDTA INR NST A V K PCR A F RE b p c s C O A D V T d N T P d d N T P D N A H V R PT RFLP SNP TAE Ameri can Heart Associ ation: Hiệp hội Tim mạch Mỹ Anti Vitami nK: Kháng vitami nK Atrial Fibrill ation: Rung nhĩ Base pair (cặp bazơ) cộng Thuốc chống đông máu đường uống họ Coumarinic Deep Venous Thrombosis: Huyết khối tĩnh mạch sâu Deoxyrinucleotide Triphosphate Dideoxynucleotide Triphosphate Deoxyribonucleic Acid (Acid deoxyribonucleic) Heart Valve Replacement: Thay Van Tim Ethylenediaminetetraacetic Acid International Normalized Ratio: Chỉ số bình thường hố Quốc Tế Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase Prothrombin Restriction Enzym: enzym cắt giới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Single Nucleotide Polymorphism: Đa hình đơn nucleotide Tris base, acetic acid and EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Mối liên quan đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol 14 Bảng 1.2 Mối liên hệ kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol 16 Bảng 1.3 Tần số phân bố alen gen CYP2C9 quần thể người 23 Bảng 1.4 Tần số phân bố alen gen CYP2C9 quần thể người 23 Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa alen 32 Bảng 2.2 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen rs9923231 gen VKORC1 35 Bảng 2.3 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen rs9923231 gen VKORC1 36 Bảng 3.1 Một số đặc điểm chung nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 39 Bảng 3.2 Kết kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tổng số 41 Bảng 3.3 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 47 Bảng 3.4 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 48 Bảng 3.5 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 48 Bảng 3.6 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP CYP2C9*3 .55 Bảng 3.7 Kết tần số phân bố alen, kiểu gen SNP rs9923231 SNP rs9934438 gen VKORC1 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Buồng tim vị trí van tim Hình 1.2 Cấu trúc hoá học acenocoumarol Hình 1.3 Ảnh hưởng gen CYP2C9 gen VKORC1 tới acenocoumarol Hình 1.4 Mô tả Single nucleotide polymorphisms Hình 1.5 Mơ tả Haplotype 10 Hình 1.6 Vị trí nhiễm sắc thể số 10 NST người 12 Hình 1.7 Vị trí gen CYP2C9 nhiễm sắc thể số 10 12 Hình 1.8 Vai trị Cytochrome P450 chuyển hoá thuốc 13 Hình 1.9 Vị trí nhiễm sắc thể số 16 NST người 15 Hình 1.10 Vị trí gen VKORC1 nhiễm sắc thể số 16 15 Hình 1.11 Gen VKORC1 15 Hình 1.12 Giải trình tự gen máy tự động 19 Hình 1.13 Enzym cắt tạo đầu dính cắt tạo đầu 20 Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0,7% 40 Hình 3.2 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 42 Hình 3.3 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 42 Hình 3.4 Kết PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 43 Hình 3.5 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 44 Hình 3.6 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 gen VKORC1 45 Hình 3.7 Kết PCR tối ưu nồng độ mồi (A) nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 gen VKORC1 46 Hình 3.8 Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438 49 PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU BỆNH VIỆN TIM HÀ NỘI STT Họ tên Dương Thị L Trương Việt Q Đỗ Thị M Đỗ Thị M Nguyễn Thị L Đinh Thị V Đỗ Thị H Nguyễn Văn T Nguyễn Thị T 10 Nguyễn Văn D 11 Nguyễn Thị Tường V 12 Phan Thị C 13 Đặng Thị T 14 Nguyễn Thị T 15 Nguyễn Văn L 16 Nguyễn Thị H 17 Nguyễn Văn T 18 Vũ Thị H 19 Nguyễn Thị H 20 Nguyễn Thạc Q 21 Nguyễn Thị H 22 Nguyễn Thị D 77 23 Trịnh Thị H 24 Nguyễn Văn D 25 Nguyễn Công L 26 Nguyễn Thị N 27 Hoàng Thị M 28 Đặng Văn H 29 Hà Văn M 30 Trần Thị H 31 Nguyễn Văn N 32 Nguyễn Thị L 33 Vũ Thị D 34 Vũ Thị T 35 Phạm Thị T 36 Ngô Thị L 37 Vương Thị V 38 Nguyễn Thị N 39 Đặng Văn L 40 Nguyễn Ngọc C 41 Đỗ Thị V 42 Phạm Văn T 43 Nguyễn Văn D 44 Nguyễn Thị B 45 Đỗ Minh Đ 46 Lê Văn S 47 Trịnh Thị K 48 Phạm Khắc X 49 Đặng Thanh B 50 Nguyễn Văn H 78 51 Nguyễn Gia Q 52 Đỗ Thị V 53 Đặng Thị V 54 Phùng Thị T 55 Nguyễn Văn H 56 Hoàng Thị C 57 Dương Văn B 58 Nguyễn Thị V 59 Đỗ Trọng T 60 Trịnh Thị H 61 Phùng Thế H 62 Nguyễn Thị C 63 Nguyễn Văn D 64 Phạm Văn T 65 Nguyễn Thị H 66 Đinh Thị V 67 Bùi Đức C 68 Nguyễn Thị K 69 Nguyễn Thị H 70 Phùng Thị Đ 71 Nguyễn Thị Ư 72 Phan Thị Q 73 Nguyễn Đức T 74 Nguyễn Thành C 75 Bùi Khánh T 76 Nguyễn Văn N 77 Nguyễn Thị S 78 Phạm Đắc T 79 Nguyễn Thị N 80 Đỗ Thị H 81 Nguyễn Văn C 82 Triệu Thị S 83 Vũ Đình S 84 Nguyễn Thị N 85 Dương Thị L 86 Trần Quốc B 87 Phạm Văn L 88 Phùng Thị T 89 Phạm Thị K 90 Trần Thị L 91 Nguyễn Văn Đ 92 Hoàng Thế Q 93 Nguyễn Thị N 94 Kiều Duy T 95 Đặng Văn C 96 Vi Thị N 97 Đinh Đăng C 98 Đinh Thị H 99 Phạm Thị H 100 Triệu Hồng L 79 PHỤ LỤC DANH SÁCH KẾT QUẢ ĐO OD CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU STT 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 80 81 24 ĐT 28 25 ĐT 31 26 ĐT 32 27 ĐT 33 28 ĐT 34 29 ĐT 35 30 ĐT 36 31 ĐT 38 32 ĐT 39 33 ĐT 40 34 ĐT 42 35 ĐT 44 36 ĐT 46 37 ĐT 48 38 ĐT 49 39 ĐT 51 40 ĐT 52 41 ĐT 53 42 ĐT 58 43 ĐT 61 44 ĐT 65 45 ĐT 67 46 ĐT 68 47 ĐT 69 48 ĐT 71 49 ĐT 72 82 50 ĐT 73 51 ĐT 74 52 ĐT 75 53 ĐT 78 54 ĐT 79 55 ĐT 80 56 ĐT 82 57 ĐT 84 58 ĐT 85 59 ĐT 86 60 ĐT 87 61 ĐT 88 62 ĐT 89 63 ĐT 90 64 ĐT 92 65 ĐT 93 66 ĐT 94 67 ĐT 95 68 ĐT 96 69 ĐT 97 70 ĐT 98 71 ĐT 99 72 ĐT100 73 ĐT101 74 ĐT102 75 ĐT103 76 ĐT104 77 ĐT105 78 ĐT107 79 ĐT109 80 ĐT110 81 ĐT113 82 ĐT114 83 ĐT115 84 ĐT117 85 ĐT118 86 ĐT123 87 ĐT124 88 ĐT126 89 ĐT127 90 ĐT128 91 ĐT129 92 ĐT130 93 ĐT132 94 ĐT136 95 ĐT140 96 ĐT141 97 ĐT145 98 ĐT146 99 ĐT147 100 ĐT148 83 PHỤ LỤC DANH SÁCH KẾT QUẢ KIỂU GEN CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 85 23 Đt 27 24 Đt 28 25 Đt 31 26 Đt 32 27 Đt 33 28 Đt 34 29 Đt 35 30 Đt 36 31 Đt 38 32 Đt 39 33 Đt 40 34 Đt 42 35 Đt 44 36 Đt 46 37 Đt 48 38 Đt 49 39 Đt 51 40 Đt 52 41 Đt 53 42 Đt 58 43 Đt 61 44 Đt 65 45 Đt 67 46 Đt 68 47 Đt 69 48 Đt 71 49 Đt 72 50 Đt 73 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 86 79 Đt 109 80 Đt 110 81 Đt 113 82 Đt 114 83 Đt 115 84 Đt 117 85 Đt 118 86 Đt 123 87 Đt 124 88 Đt 126 89 Đt 127 90 Đt 128 91 Đt 129 92 Đt 130 93 Đt 132 94 Đt 136 95 Đt 140 96 Đt 141 97 Đt 145 98 Đt 146 99 Đt 147 100 Đt 148 87 ... thuật, hoạt động van nhân tạo, biến chứng hay gặp việc sử dụng thuốc chống đông máu sau thay van tim Có thể nói thay van tim thay ? ?bệnh van tim? ?? ? ?bệnh van tim nhân tạo” Nguyên nhân van tim thể người... QUAN 1.1 Bệnh lý van tim thay van tim Bệnh lý van tim bệnh phổ biến Việt Nam cấu bệnh lý tim mạch nói chung Nguyên nhân gây tổn thương van tim phần lớn di chứng bệnh lý thấp tim [2] Bệnh nhân có... trường hợp bệnh nhân phải thay van tim với bệnh lý chủ yếu tổn thương van tim thấp tim [28] 1.2 Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim Sau thay van tim bệnh nhân gặp số biến chứng như: liên