Thông tin tài liệu
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét quý báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy ln tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi sẵn sàng giải đáp thắc mắc để hồn thành khóa luận Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23 Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ thầy cô bạn sinh viên làm việc thực tập Phòng thí nghiệm Bộ mơn Y dược học sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, toàn thể thầy cô giáo Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng cao áp biến tính) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát Kb kilobase (= 1000 bp) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) NPHS2 Gen mã hóa cho protein podocin NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi máu quốc gia) OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) SSCP Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) STR Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn) TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 .20 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR gen NPHS2 .30 Bảng Tổng hợp SNP thuộc gen NPHS2 149 bệnh nhân 32 Bảng Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu 33 Bảng Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 nghiên cứu 33 Bảng Tần số kiểu gen tần số alen SNP xuất alen đột biến 34 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư số nước .4 Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH .5 Hình 1.3 Gen NPHS2 protein podocin Hình 1.4 Tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận tương tác protein cấu tạo nên tế bào .9 Hình 1.5 Các đột biến protein podocin mã hóa gen NPHS2 .10 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu 23 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số gel agarose 0,7% 25 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi exon gen NPHS2 27 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi exon gen NPHS2 28 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác exon gen NPHS2 29 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR exon gen NPHS2 sau tối ưu 29 Hình 3.6 Một số kết giải trình tự gen NPHS2 .31 Hình 3.7 Số lượng đột biến exon gen NPHS2 31 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨ NG TH ẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học 1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học 1.1.3 Biến chứng liệu pháp corticosteroid điều trị HCTHTP .5 1.1.4 Tổng quan gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát 1.2 TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 .8 1.2.1 Vị trí, cấu trúc, vai trị gen NHPS2 1.2.2 Đa hình di truyền gen NPHS2 1.3 CÁC NGHIÊN C Ứ U VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀ N GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN M ẮC HCTHTP 11 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀ N ĐƠN NUCLEOTIT 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 VẬT LIỆ U NGHIÊN C ỨU 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị 19 2.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu sinh phẩm 20 2.2.2 Tách chiết kiểm tra chất lượng ADN tổng số 20 2.2.3 Nhân dòng exon gen NPHS2 PCR 21 2.2.4 Xác định kiểu gen exon gen NPHS2 giải trình tự 23 2.2.5 Xác định tần số SNP thuộc gen NPHS2 23 2.3 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN C ỨU 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ 26 3.1 TÁCH CHI Ế T ADN T ỔNG SỐ 26 3.2 NHÂN DÒNG EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR 26 3.3 XÁC ĐỊNH KI Ể U GEN EXON C ỦA GEN NPHS2 B Ằ NG GI ẢI TRÌNH TỰ 30 3.4 TẦN SỐ ALEN C ỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤ T HI ỆN TRONG NGHIÊN CỨ U 33 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 4.1 VỀ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH EXON ĐẦ U CỦA GEN NPHS2 34 4.2 VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢ C TRÊN EXON … 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .40 4.1 K Ế T L U Ậ N .40 4.2 KI Ế N NGH Ị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) bệnh cầu thận mạn tính thường gặp trẻ em yếu tố nguy dẫn đến suy giảm chức thận [14, 65] Cho đến nay, phương pháp điều trị bệnh chủ yếu liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch ghép thận Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH phân loại dựa vào đáp ứng bệnh nhân với liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm kháng corticosteroid [14, 38] Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường cảm thụ với liệu pháp này, nhiên việc điều trị kéo dài corticosteroid gây nhiều tác dụng phụ hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng xương, chậm phát triển thể chất [12] Bên cạnh đó, tỉ lệ khơng nhỏ (10 – 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58] Nhiều trường hợp kháng corticosetorid chứng minh đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức biệt hóa tế bào podocyte (tế bào biểu mơ có chân màng đáy cầu thận) Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo lo lắng, chán nản tiêu tốn nhiều tiền cho bệnh nhân gia đình người bệnh [6] Trên giới, nhiều cơng trình nghiên cứu HCTHTP thực để xác định nguyên nhân, chế biểu bệnh tính di truyền bệnh Những nghiên cứu áp dụng tiến di truyền học phân tử vài năm qua chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng corticosteroid, đột biến gen NPHS2 mã hóa cho protein podocin đóng vai trị quan trọng [49, 60] Các nhà khoa học xác định tổng cộng 89 đột biến điểm exon gen NPHS2, 56 đột biến tập trung từ exon đến exon chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41] Vì vậy, việc xác định đột biến gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan di truyền với đáp ứng thuốc hỗ trợ bác sĩ lâm sàng định phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng thuốc giảm chi phí điều trị [43] Đây xu hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học phác đồ điều trị bệnh nhân Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu đa hình thái gen NPHS2 quy trình phân tích gen Từ nhu cầu lâm sàng tính cấp thiết nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, chúng tơi tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát” Mục tiêu nghiên cứu: - Xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền nằm exon đến exon thuộc gen NPHS2 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam - Xác định tần số đa hình gen NPHS2 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam Nội dung nghiên cứu: - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon đến exon thuộc gen NPHS2 - Giải trình tự xác định đa hình gen NPHS2 - Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen tần số alen 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học Hội chứng thận hư biểu thường gặp bệnh cầu thận nguyên phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với đợt bột phát, xen lẫn thời kỳ thuyên giảm Đây hội chứng lâm sàng sinh hóa xuất nhiều bệnh tổn thương cầu thận đặc trưng phù, protein niệu cao, protein máu giảm, rối loạn lipid máu đái mỡ [6] Hội chứng thận hư tiên phát HCTH khơng có ngun nhân rõ ràng, khởi phát sớm tháng tuổi, với hình thái bệnh lí tổn thương cầu thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hyalin hoá cục phần tăng sinh gian mạch lan toả Bệnh hay gặp tuổi tiền học đường học đường (5 – 10 tuổi) [8] Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome - SRNS) định nghĩa tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư không đạt thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư trẻ em có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối bệnh thận vòng 10 năm [44] Khi bệnh nhân cần điều trị lọc máu ghép thận với chi phí cao Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư địa Tuổi mắc bệnh trung bình trẻ em Việt Nam 8,7 ± 3,5 (tuổi học) số nghiên cứu giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp thường gặp trẻ em trước tuổi học Trẻ nam gặp nhiều trẻ nữ (tỷ lệ 2:1) Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); trẻ em Châu Phi mắc HCTHTP, trẻ em da đen mắc HCTHTP thường bị kháng corticosteroid [52] Ở Mỹ, tỉ lệ mắc hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ mắc 16/100.000 người Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mắc trẻ em gốc Á (Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể tỉ lệ mắc HCTH số nước giới) Ở nước ta, khoa Nhi bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú chiếm 10 – 30% tổng số bệnh nhi bị bệnh thận Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân chiếm 40% tổng số bệnh nhân khoa thận [1, 10] Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư số nước giới [27] 1.1.2 Cơ chế sinh bệnh học Cơ chế sinh bệnh học HCTHTP đến chưa biết đầy đủ Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có rối loạn chức tế bào lympho T dẫn đến rối loạn đáp ứng miễn dịch Các protein đặc biệt Albumin xuất nước tiểu biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng lỗ lọc điện tích âm màng đáy Một số bệnh nhân mang điện tích dương huyết tương phân tử protein trung hịa điện tích âm thành mao mạch cầu thận Ngồi số nghiên cứu cịn cho thấy có vai trị yếu tố di truyền chế sinh bệnh học HCTHTP Gần người ta thấy thay đổi phân tử creatin bộc lộ chân lồi tế bào biểu mơ có chân, đặc biệt nephrin, podocin α-actin có vai trị gây xuất protein niệu [4] Hình 1.2 mơ tả chế gây albumin từ máu nước tiểu HCTH Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH [53] Hầu hết bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid trẻ em HCTH bẩm sinh chứng minh nghiên cứu có nguyên nhân gen làm ảnh hưởng tới biệt hóa chức tế bào podocyte [33] 1.1.3 Biến chứng liệu pháp corticosteroid điều trị HCTHTP Những chứng rối loạn miễn dịch sở để sử dụng corticosteroid thuốc ức chế miễn dịch khác điều trị HCTHTP Khi chưa có corticosteroid, tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết tiến triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng Từ năm 1950, corticosteroid sử dụng điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH xuống khoảng 3% Corticosteroid có tác dụng giảm viêm cầu thận điều trị HCTHTP, từ triệu chứng bệnh giảm hoàn toàn Với trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp corticosteroid [45] Tuy nhiên, bệnh có khả tái phát cao, cần theo dõi lâu dài tuân thủ phác đồ cách xác Mặt khác, điều trị corticosteroid thời gian dài gây nhiều biến chứng nghiêm trọng [12, 45]: - Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim bù Tiêu hóa: bệnh lý dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển trẻ em Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, kali máu toàn phần, dạng mẫu dễ thu thập sở khám chữa bệnh Việc tối ưu điều kiện có ý nghĩa quan trọng ứng dụng thực tế tiết kiệm thời gian cơng sức thao tác Áp dụng phân tích 149 bệnh nhân cho thấy quy trình phân tích gen chúng tơi có tính ổn định, dễ dàng lặp lại với độ xác cao Quy trình xây dựng nghiên cứu công cụ hỗ trợ nghiên cứu mối liên quan kiểu gen NPHS2 HCTH, mảng nghiên cứu cần bổ sung thêm nhiều dẫn liệu hoàn toàn chưa đánh giá Việt Nam 4.2 Về phân tích kết SNP xác định exon Dựa vào kết giải trình tự kết hợp với sở liệu NCBI, xác định 251 SNP exon gen NPHS2 đột biến exon exon Trên giới, có nhiều cơng bố giải trình tự tồn exon gen NPHS2, nhiên, lần chúng tơi cơng bố giải trình tự toàn exon gen NPHS2 bệnh nhân nhi người Việt Nam mắc hội chứng thận hư tiên phát Nghiên cứu trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid khơng có tiền sử gia đình cho thấy khả liên quan số đột biến gen NPHS2 đến tiên lượng thuận lợi bệnh nhân [14] Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư Nam Ấn Độ phát đột biến NPHS2 rs74315345, rs869025495, rs74315342 rs74315346, xuất nhóm kháng corticoid mà khơng xuất nhóm nhạy cảm với corticoid [15] Ở Việt Nam, khuyến nghị mở rộng thực nghiên cứu kết hợp với liệu cận lâm sàng lâm sàng HCTHTP để đánh giá mối liên quan đa hình di truyền NPHS2 đáp ứng thuốc corticoid điều trị HCTH Chúng tơi xác định số SNP thuộc nhóm đột biến sai nghĩa vô nghĩa Theo nhiều nghiên cứu trước giới, đột biến sai nghĩa nhóm đột biến xuất nhiều đột biến NPHS2 Trong đó, đột biến rs74315342 (tên khác c.413G>A hay p.R138Q) exon đột biến thường gặp Châu Âu [54] Axit amin arginine vị trí 138 đóng vai trị quan trọng bảo toàn cấu trúc chức podocin màng đáy cầu thận [21] Vì vậy, thay nucleotit G A dẫn đến thay glutamine cho arginine làm khả giữ lại nephrin tính tồn vẹn màng lọc cầu thận [37] Nghiên cứu chúng tơi tìm thấy xuất đột biến Các đột biến gen mã hóa protein podocin giữ lại mạng lưới nội chất chứng minh đột biến sai nghĩa khác như: p.P118L (c.353C> T), p.D160G (C.479A> G), p.R168S (c.502C> A), p.R168C (c.502C> T), p.R168H (C.503G> A), p.V260E (c.779T> A) [62] Mặt khác, số đột biến sai nghĩa dẫn đến đột biến podocin nhắm mục tiêu vào màng tế bào Các đột biến gây hại việc ảnh hưởng trực tiếp đến chức protein làm thay đổi đặc tính báo hiệu và/ thay đổi tương tác với protein khác màng lọc cầu thận [57] Các đột biến sai nghĩa không giới hạn vài exon cụ thể mà phân bố suốt chiều dài gen Do đó, miền chức khác podocin bị ảnh hưởng [62] Trong số đột biến sai nghĩa, đột biến công bố sở liệu giải trình tự p.V290M (C.868G> A) p.V180M (c.538G> A) với tần suất 1/13006 alen (0.008%), p.R138Q (c.413G> A) với tần số 8/13006 (0.06%), cho thường gặp đột biến sau bệnh nhân [20] Nhóm đột biến thứ hai xác định gen NPHS2 đột biến vô nghĩa Tổng hợp từ nghiên cứu trước, mười bảy đột biến vô nghĩa mô tả, có đột biến (p.S46X [c.137C> A], p.Q219X [c.655C> T], p.R229X [C.685C> T], p.L270X [c.809T> A]) Các đột biến khác mô tả trước là: p.Q39X (c.115C> T), p.R71X (c.211C> T), P.E87X (c.259G> T), p.W122X (c.366G> A), p.Q129X (c.385C> T) P.R138X (c.412C> T), p.Y162X (c.486C> A), p.R196X (c.586C> T) P.Q215X (c.643C> T), p.E237X (c.709G> T), p.E264X (c.790G> T) P.K289X (c.865A> T), p.R322X (c.964C> T) Xét nghiệm invitro protein đột biến p.R138X (c.412C> T) gây khả giữ lại nephrin màng đáy cầu thận [37] Mặt khác, phản ứng khuếch đại gen sinh thiết thận bệnh nhân mang đột biến p R138X (C.412C> T) phát sản phẩm chứng tỏ đột biến làm phân hủy mRNA [20, 21] Nghiên cứu Karim Bouchireb cộng (năm 2013) cập nhật đột biến gen NPHS2 liên quan đến HCTH kháng corticosteroid, đột biến thêm hay bớt nucleotit xác định bao gồm 11 đột biến chèn thêm 26 đột biến xóa đoạn gen ngắn Trong số có đột biến gây lệch khung đọc Đột biến thêm nucleotit rải rác tồn chiều dài gen mã hóa podocin, nhiên, đột biến nucleotit tập trung vùng PHB đầu C-terminal Chỉ có đột biến nucleotit là: p.Pro89ArgfsX13 (c.264 265del), (p.P45RfsX54 [C.134del], p.E56GfsX43 [c.167del], p.L84WfsX15 [c.249del]) exon có ảnh hưởng đến đầu N podocin Nghiên cứu không thấy xuất đột biến này, kích thước quần thể nghiên cứu đột biến có tần số thấp đột biến liên quan đến chủng tộc địa dư mà chưa chứng minh rõ Ngoài đột biến thuộc exon đầu, nhiều nghiên cứu khác đột biến thuộc vùng intron đột biến mã kết thúc xác định Mười sáu đột biến làm thay đổi vị trí cắt mô tả nghiên cứu bao gồm: 275-1G> C, 275-2A> C, 378> 1G> A, 378> 5G> A, 379-1G> C, 451 + 2T> A, 451 + 3A> T, 452-2A> C, 534 + 1G> T, 535-1G> T, 794 + 5G> T, 873 + 5G> A, 873 + 2T> A, 873> 1G> A, 874-1G> C, 874-2A> G Tuy nhiên cho nguyên nhân gây bệnh Phần lớn đột biến vị trí cắt ảnh hưởng đến intron (58% tất đột biến vị trí cắt) Đột biến p.X384QextX7 (c.1150T>C) tìm thấy gần nghiên cứu Bouchireb Trong đột biến này, thay base đơn lẻ stop codon tạo khung đọc mở dài hơn, kết tạo protein với 390 axit amin dẫn đến biểu mức podocin tế bào chân giả Vì vậy, nghiên cứu thực nghiệm tương lai cần thiết để đánh giá hậu chức đột biến đơn lẻ Việc xác định tần số kiểu gen tần số alen đa hình di truyền xuất alen đột biến góp phần vào việc xác định SNP tiềm cho mối liên quan đa hình di truyền gen NPHS2 với HCTHTP kháng corticoid quẩn thể người Việt Nam Trong 149 bệnh nhân nghiên cứu, hai đột biến nằm exon exon 3, chúng tơi thấy có SNP có tính đa hình exon - rs1079292, rs758564490, rs3738423, rs200437667, rs12401711, rs12401708 Rs528833893; exon 5, có tính đồng hình Kết tương đồng với nghiên cứu Hasan Otukesh 20 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng corticoid bệnh viện Ali Asghar (Iran) nghiên cứu Maruyama exon 36 trẻ em Nhật Bản mắc HCTH kháng corticosteroid [32, 50] Trong nghiên cứu Yu năm 2005 23 bệnh nhân người Trung Quốc, có trường hợp đột biến dị hợp tử đa hình: 51G>T, 288C>T, IVS3-46C>T, IVS3-21C>T, IVS774G>C, 954T>C 1038A>G xảy với bệnh nhân nhóm đối chứng [67] Nghiên cứu HCTH kháng corticosteroid số nhóm người châu Âu cho thấy tỉ lệ xuất đột biến gen NPHS2 từ 12-19% [26, 58, 65] Ở nghiên cứu khác, đột biến gen NPHS2 phổ biến trẻ em Ai Cập mắc HCTH kháng corticosteroid khơng có tiền sử gia đình đưa khả giải thích cho tiên lượng thuận lợi bệnh nhân [16] Nghiên cứu 484 bệnh nhân mắc hội chứng thận hư Nam Ấn Độ phát đột biến gen NPHS2 G92C, P118L, R138Q D160G nhóm kháng corticoid (chiếm 18,5%) cịn nhóm nhạy cảm với corticoid khơng thấy đột biến xuất [39] Azocar M cộng phân tích gen NPHS2 34 trẻ em Chile mắc hội chứng thận hư kháng corticoid, phát bệnh nhân có đột biến (chiếm 21%) bệnh nhân dị hợp tử đột biến R229Q bệnh nhân đột biến A284V [15] Nội dung khóa luận phần thuộc nghiên cứu lớn Đây bước đầu việc xác định SNP có ý nghĩa quần thể người Việt Nam mắc HCTHTP, từ tìm hiểu mối liên quan di truyền đặc điểm lâm sàng số hóa sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết đạt được, đưa số kết luận sau: - Chúng xây dựng quy trình phân tích gen cho exon đến thuộc gen NPHS2 sử dụng mẫu máu toàn phần với điều kiện tối o ưu hóa cho phản ứng PCR: nhiệt độ gắn mồi 56 C, nồng độ mồi 0,3 pmol/µl nồng độ ADN khn khoảng 50 - 100 ng/µl - Áp dụng thành cơng quy trình phân tích gen 149 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát Qua xác định 251 SNP đột biến Tần số alen SNP xuất đột biến thống kê so sánh với tần số lý thuyết theo định luật Hardy – Weinberg cho giá tri p > 0,05 4.2 KIẾN NGHỊ - Thực nghiên cứu đánh giá mối liên quan đa hình di truyền gen NPHS2 với đáp ứng thuốc corticosteroid điều trị hội chứng thận hư - Xây dựng quy trình phân tích gen với exon cịn lại vùng khơng mã hóa protein gen NPHS2 để xác định thêm đa hình có khả ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc corticosteroid 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 11 12 Bệnh viện Nhi Trung Ương (2006), "Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trẻ em" BioMedia Việt Nam Đa hình đơn nucleotide – Công cụ sử dụng di truyền học người, truy cập ngày 01 - 03-2018, trang web http://www.biomedia.vn/review/da-hinh-don-nucleotide-cong-cu-sudung-trong-di-truyen-hoc-o-nguoi.html Đinh Đồn Long and Đỗ Lê Thăng (2008), "Phân tích gen sản phẩm gen", Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 325-355 Hà Phan Hải An (2015), "Hội chứng thận hư", Bệnh học nội khoa, tập 1, Nhà xuất Y học Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học phân tử, Nhà xuất Y học Hoàng Hà Kiểm (2010), "Thận học lâm sàng", Nhà xuất Y học Khuất Hữu Thanh (1997), "Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen", Nhà xuất KHKT HN Lê Nam Trà (2009), "Hội chứng thận hư tiên phát", Bài giảng Nhi khoa, tập 2, Nhà xuất Y học Lê Thị Nhiên (2016), Nghiên cứu tính đa hình di truyền CYP2C19 bệnh nhân đặt Stent động mạch vành qua da, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Gia Khánh (2013), "Bài giảng Nhi khoa", tập Nguyễn Ngọc Sáng (1987), Nhận xét đặc điểm lâm sàng sinh học qua 52 trường hợp HCTHTP thể kháng thuốc trẻ em, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú bệnh viện, Trường Đại học Y Hà Nội Trần Đình Long (1995), "Một số biến chứng liệu pháp corticoid điều trị hội chứng thận hư trẻ em", Tạp chí Nhi khoa, (2&3), tr 50-51 Tiếng Anh 13 14 Andolino TP and Reid-Adam J (2015), "Nephrotic syndrome", Pediatrics in Review, 36(3), pp 117–126 Arbeitsgemeinschaft fur Pädiatrische Nephrologie (1988), "Short versus standard prednisone therapy for initial treatment of idiopathic nephrotic syndrome in children", Lancet, 1, pp 380 –383 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Azocar M, Vega A et al (2016), "NPHS2 Mutation analysis study in children with steroid-resistant nephrotic syndrome", Rev Chil Pediatr, 87(1), pp 31-6 Bakr A Yehia S, El-Ghannam D and et al (2008), "NPHS2 mutations", Indian J Pediatr, 75, pp 135-8 Basiratnia M., Yavarian M and Torabinezhad S (2013), "NPHS2 Gene in Steroid-resistant Nephrotic Syndrome Prevalence, Clinical Course, and Mutational Spectrum in South-West Iranian Children", Iran J Kidney Dis, 7(5), pp 357-62 Berdeli A, M.S et al ( 2007), "NPHS2 (podocin) mutations in Turkish children with idiopathic nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 22, pp 2031-2040 Bernward Hinkes, C.V et al (2008), "Specific Podocin mutations correlate with age of onset in Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 19, pp 365-371 Bouchireb K, Boyer O and Gribouval O (2013), "NPHS2 mutations in steroid-resistant nephrotic syndrome: a mutation update and the associated phenotypic spectrum", Hum Mutat, 35(2), pp 178-86 Boute N, Gribouval O and Roselli S (2000), "NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroidresistant nephrotic syndrome", Nat Genet, 24(4), pp 349-54 Budowle B., Adams D.E and Allen R.C (1994), "Fragment-length polymorphisms for forensic science applications", Methods in nucleic acids research, pp 181-202 Buscher AK and Weber S ( 2012), "Educational paper: the podocytopathies", Eu J Pediatr, 171 (8), pp 1151-60 Butler J.M (2001), "Biology and Technology behind STR marker", Forensic DNA Typing, Academic Press, London Caridi G, Bertelli R and Carrea A (2001), "Prevalence, genetics, and clinical features of patients carrying podocin mutations in steroidresistant nonfamilial focal segmental glomerulosclerosis", J Am Soc Nephrol, (12), pp Caridi G,12 Bertelli R et2742-6 al (2003), "Broadening the spectrum of diseases related to podocin mutations", J Am Soc Nephrol, 14, pp 1278‐86 Chanchlani R and Parekh RS (2016), "Ethnic differences in childhood nephrotic syndrome", Front Pediatrics, DOI: 10.3389/fped.2016.00039 Dedi Rachmadi, A.M and Leo Monners (2015), "Gene Mutation and Polymorphisms in Indonesian Chhildren with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome", Open Journal of Pediatrics, 5, pp 27-33 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Dusel JA, Burdon KP and Hicks PJ (2005), "Identification of podocin (NPHS2) gene mutations in African Americans with nondiabetic endstage renal disease", Kidney Int, 68(1), pp 256-62 Eddy AA and Symons JM (2003), "Nephrotic syndrome in childhood", Lancet, 362(9384), pp 629–639 HabibR (1993), "Nephrotic syndrome in the st year of life", Inserm U, Hospital Necker – Enfant Malades, Paris, France, 7(4), pp 347353 Hasan Otukesh, B.G et al (2009), "NPHS2 Mutations in Children with Steroid-Resistant Nephrotic syndrome", Iranian Journal of Kidney Diseases, 3, pp 99-102 Hee Gyung Kang and H.I.C (2015), "Nephrotic syndrome: What’s new, what’s hot?", Korean J Pediatr 58, pp 275-282 Hee Yeon Cho, Joo Hoon Lee and Hyun Jin Choi (2008), "WT1 and NPHS2 mutations in Korean children with steroid resistant nephritic syndrome", Pediatr Nephrol, 23, pp 63-70 Hinkes B, Wiggins RC et al (2006), "Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible", Nat Genet, 38, pp 1397–1405 Hinkes BG, Mucha B and ) Vlangos CN (2007), "Nephrotic syndrome in the first year of life: Two thirds of cases are caused by mutations in genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2)", Pediatrics, 119, pp 907–919 Huber TB, Simons M and Hartleben B (2003), "Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains", Hum Mol Genet, 15;12(24), pp 3397-405 International Study of Kidney Disease in Children (1981), Primary nephrotic syndrome in children: Clinical significance of histopathologic variants of minimal change and of diffuse mesangial hypercellularity, A Report of the International Study of Kidney Disease in Children Jaffer A, Unnisa W et al (2014), "NPHS2 mutation analysis and primary nephrotic syndrome in southern Indians", Nephrology, 19(7), pp 398-403 Joshi S, A.R et al (2013), "Genetics of steroid resistant nephritic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing", Acta Paediatr, 102(9) Kalman Tory, Dora K Menyhard et al ( 2013), "Mutation dependent recessive inheritance of NPHS2 associated steroid resistant nephritic syndrome", Nature Genetics, 46(3), pp 299-304 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Karle SM, Uetz B and Ronner V (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13(2), pp 388-93 Karle SM, Uetz B et al (2002), "Novel mutations in NPHS2 detected in both familial and sporadic steroid-resistant nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol, 13 pp 388 –393 Kitamura A, Tsukaguchi H et al (2006), "Genetics and Clinical Features of 15 Asian Families with Steroid-Resistant Nephrotic Syndrome.", HealthNephrology Dialysis Transplantation, 21, pp 31333138 Kosskimies O, V.J et al (1982), "Long-termoutcome of primary nephrotic syndrome", Archives of Diseasein Chilhood 57, pp 544-548 Kruglyak L and Nickerson D.A (2001), "Variation is the spice of life", Nature Genetics, 27, pp 234–236 Kwok PY and Chen X (2003), "Detection of single nucleotide polymorphisms", Curr Issues Mol Biol, 5(2), pp 43-60 Lombel R M., Hodson E M and Gipson D S (2012), "Treatment of steroid-resistant nephrotic syndrome in children: new guidelaines from KDIGO", Pediatr Nephrol, 2304(8) Maddalena Gigante, Matteo Piemontese et al (2011), "Molecular and Genetic Basic of Inherited nephrotic syndrome ", International Journal of Nephrology, 2011, pp 1-15 Maruyama K, Iuima K et al (2003), "NPHS2 mutations in sporadic steroid‐resistant nephrotic syndrome in Japanese children", Pediatr Nephrol, 18, pp 412‐6 Mitra Basiratnia, M.Y et al (2013), "NPHS2 gene in Steroid resistant nephritic syndrome Prevelance, clinical course, and mutational spectrum in South West Iranian children", IJKD, 7, pp 357-362 Nelson (2000), "Nephrosis", Textbook of Pediatrics, 1129-1133 Nephrotic Syndrome: Pathophysiology, Treatment, Complications, Differential Diagnoses (2017), accessed 01 - 032018, from web https://www.healthdiseaseblog.com/2017/09/nephrotic-syndrometreatment-pathophysiology-complications-differential-diagnosis.html Patrick Niaudet (2004), "Podocin and Nephrotic Syndrome: Implications for the Clinician", Journal of the American society of Nephrology, 15, pp 832-834 Pereira AC, Pereira AB and Mota GF (2004), "NPHS2 R229Q functional variant is associated with microalbuminuria in the general population", Kidney Int, 65(3), pp 1026-30 Ren Q and Y.S (2011), "NPHS2 variation in children with late steroidresistant nephrotic syndrome", New York Science Journal 4, pp 30-33 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 Roselli S, Moutkine I and Gribouval O (2004), "Plasma membrane targeting of podocin through the classical exocytic pathway: effect of NPHS2 mutations", Traffic, 5(1), pp 37-44 Ruf RG, Lichtenberger A and Karle SM et al (2004), "Patients with mutations in NPHS2 (podocin) not respond to standard steroid treatment of nephrotic syndrome", J Am Soc Nephrol 15, pp 722 –732 Schumacher V, Scharer K et al (1998), "Spectrum of early onset nephrotic syndrome associated with WT1 missense mutations", Kidney Int, 53, pp 1594–1600 Severine Roselli, Imane Moutkine et al (2004), "Plasma membrane targeting of Podocin through the classical exocytic pathway: Effect of NPHS2 mutations", TRafic, 5, pp 37-44 Snustad D P and Simmons M J (2012), "The human Hapmap project", Principle of genetics, John Wiley & Sons, Inc, 414-415 Stefanie Weber, Oliver Gribouval and Ernie L (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid-resistant nephrotic syndrome and low post-transplant recurrence", Kidney International, 66(2004), pp 571–579 Tsukaguchi H, Yager H and Dawborn J (2000), "A locus for adolescent and adult onset familial focal segmental glomerulosclerosis on chromosome 1q25-31", J Am Soc Nephrol, 11(9), pp 1674-80 A Vignal and et al (2002), "A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics", Genetics, selection, evolution: GSE, 34(3), pp 275-305 Weber S Gribouval O, Esquivel EL and et al (2004), "NPHS2 mutation analysis shows genetic heterogeneity of steroid resistant nephritic syndrome and low post transplant recurrence", Kidney International Supplements, 66(2), pp 571-579 What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)? , accessed 03 - 012018, from web https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp Yu Sy Ren Q (2011), "NPHS2 variation in children with late steroidresistant nephrotic syndrome", New York Science Journal, 4(30-33) Zenker M, Tralau T et al (2004), "Congenital nephrosis, mesangial sclerosis, and distinct eye abnormalities with microcoria: An autosomal recessive syndrome", Am J Med Genet A, 130, pp 138–145 Zihua Yu, Jianping Huang et al (2005), "Mutations in NPHS2 in sporadic steroid – resistant nephrotic syndrome in Chinese children", Nephrol Dial Transplant, 20, pp 902-908 PHỤ LỤC Phụ lục Quy trình tách chiết ADN tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit Rã đông mẫu máu đá để hóa chất nhiệt độ phịng Lắc ống máu Chuyển 250 µl mẫu vào ống ly tâm vơ trùng Thêm 25 µl OB Protease Solution 250 µl BL Buffer Vortex 10 giây o Ủ 65 C 10 phút Chú ý: Sau ủ phút, vortex 15 giây Thêm 260 µl Ethanol 100%, vortex 20 giây Ly tâm 1000 vòng/ phút 15 giây để đảm bảo mẫu khơng dính thành nắp ống Chèn HiBind ADN Mini Column vào Collection Tube 2ml Chuyển toàn mẫu vào cột (để pipet mức 790 µl) Ly tâm 14.000 vịng/ phút phút 10.Bỏ dịch lọc Collection Tube 11.Lắp HiBind ADN Mini Column vào Collletion Tube 2ml 12.Thêm 500 µl HBC Buffer 13.Ly tâm 14.000 vòng/ phút phút 14.Bỏ dịch lọc sử dụng lại Colletion Tube 15.Thêm 700 µl ADN Wash Buffer 16 Ly tâm phút 10.000g 17.Bỏ dịch lọc sử dụng lại Colletion Tube 18.Lặp lại bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ với ADN Wash Buffer 19.Ly tâm HiBind ADN Mini Column 14.000 vòng/ phút phút để làm khô cột 20 Chuyển HiBind ADN Mini Column vào ống ly tâm 2ml o o 21.Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 C) Ủ 65 C phút 22.Ly tâm 14.000 vịng/ phút phút 23.Thêm 50 µl Elution Buffer phút nhiệt độ phòng 24.Ly tâm 14.000 vòng/ phút phút o 25.Thu vào bảo quản ADN -20 C Phụ lục Quy trình kiểm tra chất lượng ADN thơng qua điện di Bước 1: Chuẩn bị gel agarose Pha Agarose bột đệm TAE 1X để đạt nồng độ dung dịch gel agarose 1,5% Đun lị vi sóng cho agarose tan hồn tồn, sau để o nguội đến 50 – 60 C đổ vào khay điện di có cài sẵn lược để tạo giếng nhỏ Sau khoảng 30 phút, gel đông, gỡ lược đặt gel vào bể điện di tư nằm ngang Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1- mm Bước 2: Tra mẫu ADN Mẫu ADN trộn với ADN dye 6X (chất chứa hai chất nhuộm màu khác nhau: bromophenol xanh xylene cyanol FF để theo dõi trực quan di chuyển gel điện trường, 5µl ADN mẫu 5µl ADN thang chuẩn Lambda/Hind III Marker tra vào giếng Bước 3: Chạy điện di Quá trình chạy điện di tiến hành hiệu điện 70V 60 phút ADN di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát di chuyển màu để biết dừng điện di Bản gel lấy nhẹ khỏi khn soi ghi hình ánh sáng tử ngoại Phụ lục Kết đo OD mẫu ADN A260/A280 STT OD A260/A280 104 76,55 1,803 1,916 105 179,55 1,872 105,3 1,975 106 138,1 1,843 54 90,5 2,025 107 101,0 1,796 1,797 55 87,5 1,91 108 58,05 1,932 59 1,832 56 80 1,82 109 108,5 1,869 35,4 1,723 57 60 1,862 110 97,1 1,873 57,05 1,84 58 106 1,859 111 130,35 1,873 88 1,833 59 59,1 2,017 112 61,15 2,347 10 49,4 1,83 60 89,3 1,882 113 95,65 1,838 11 72,1 1,828 61 156,5 1,854 114 77,95 2,23 12 64,1 1,834 62 51,05 1,782 115 231,05 1,876 13 66,8 1,838 63 202 1,852 116 65,85 2,335 14 83,5 1,835 64 65 1,898 117 94,4 1,855 15 34,9 1,776 65 164,8 1,865 118 110,75 1,819 16 75,3 1,848 66 82,85 119 101,4 1,829 17 129,7 1,837 67 353,65 1,858 120 143,6 1,859 18 55,7 1,814 68 95,95 2,016 121 53,2 1,921 19 105,9 1,827 70 128,7 122 58,65 2,026 20 65 1,86 71 94 1,891 123 71,7 1,846 21 123,9 1,892 72 78,9 1,779 124 133,4 1,849 OD A260/A280 STT STT OD 85,6 1,877 51 112,8 1,932 89,95 1,849 52 169,4 186 1.931 53 62,55 1,853 58,05 22 119,3 1,856 73 72,25 1,899 125 140,55 1,851 23 125,7 1,852 75 151,55 1,865 126 61,65 1,819 24 65,1 1,852 76 90,6 1,872 127 49,7 1,807 25 31,7 1,761 78 166,4 1,85 128 57,8 1,806 26 160,3 1,829 79 96,65 1,91 129 93,55 1,849 27 61,35 1,771 80 110,85 1,882 130 69,25 1,976 28 68,55 1,876 81 67,85 1,829 131 89,55 1,916 29 87,2 1,91 82 149,75 1,871 132 32,95 2,175 30 125,2 1,886 83 95,7 1,935 133 77,7 1,962 31 115,9 1,905 84 68,7 1,893 134 46,1 1,851 32 120,9 1,914 85 90,95 1,839 135 128,7 1,925 33 77,4 1,972 86 163,4 1,846 136 77,85 1,91 34 34,65 2,126 87 47,3 1,87 137 121,55 1,846 35 74,95 1,949 88 83,95 1,833 138 58,2 1,836 36 105,3 1,903 89 66,6 1,884 139 63,25 2,014 37 282,3 1,866 90 146,5 1,884 141 65,3 2,047 38 92,45 1,938 91 126,25 1,93 143 84,45 1,868 39 157,3 1,862 92 71,4 2,122 144 78,55 1,861 40 184,9 1,883 93 103,8 1,968 145 82,95 1,86 41 91,55 1,942 94 95,1 2,026 146 47,9 1,86 42 189,3 1,908 95 60,15 2,175 147 49,8 1,89 43 126,8 1,836 96 91,55 2,064 148 34,45 1,867 44 128,1 1,911 97 155,35 1,978 149 40,35 1,758 45 145,5 1,899 98 104,5 2,057 151 70,5 1,868 46 60,6 99 64,4 2,248 152 77,3 1,874 47 95,7 1,957 100 106,1 1,801 153 52,9 1,856 48 63,05 2,002 101 159,1 1,793 154 96,9 1,867 49 112,2 1,902 102 109,9 1,852 155 58,95 1,877 50 146,4 1,901 103 82,8 1,765 156 160,3 1,894 157 200,3 1,880 ... x? ?y dựng phương pháp chẩn đoán, điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, tiến hành đề tài ? ?Phân tích gen NPHS2 mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát? ?? Mục tiêu nghiên cứu: - X? ?y dựng quy trình. .. nhân nhi mắc HCTHTP Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học Hội chứng thận hư biểu thường gặp bệnh cầu thận nguyên phát, ... TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP Trên giới, nhà nghiên cứu tiến hành phân tích đa hình di truyền gen NPHS2 nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác Năm 2000, Boute cộng lần đầu phân tích đột
Ngày đăng: 21/04/2021, 12:31
Xem thêm:
