THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC PHẨM

Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến dextrin. Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa. #HOÁINHTHUCPHAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA GIÁO DỤC THỂ CHẤT  BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH THỰC PHẨM GVHD: ThS LÊ TẤN HỒNG Lớp: PFBC312850_03 Thứ 3: Tiết 1-11 NHĨM THỰC HIỆN: Nhóm NĂM HỌC: 2018-2019 TP Hồ Chí Minh – 9/2018 Page 19 Nhóm 4 Hoàng Ngọc Thương Hà Thị Trinh Trần Lê Tri Đỗ Duy Tùng Nguyễn Thị Yến Trương Thị Thu 16116179 16116187 ĐIỂM 16116186 16116191 16116200 16116176 NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……… Mục Lục Danh mục hình Page 19 Danh mục bảng Bài thí nghiệm số XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOLHGEMUTH 1.Tóm tắt thí nghiệm 1.1 Nguun tắc Page 19 Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp thủy phân tinh bột đến dextrin Đơn vị Wohlgemuth lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa 1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất - 11 ống nghiệm đánh số từ 1 11 - Dung dịch NaCl 0,55̀%: Cân 1.08g NaCl cho vào bình định mức 100ml thêm 50ml nước cất, lắc định mức đủ 100ml - Dung dịch H2SO4 10%: Dùng bình định mức 50ml cho khảng 30ml nước cất xong dùng pipep lấy 5.21 ml dung dịch H2SO4 10% vào bình định mức sau định mức đủ 50ml - Tinh bột 0.5%: cân 0.5g tinh bột pha với 100ml nước cất, đun nóng,khuấy cho dung dịch từ trắng đục sang suốt - Iodine 0,3% KI 3%: cân 0.3g Iodine 3g KI sau định mức đủ 100ml 1.3 Trình tự thí nghiệm 1.3.1 Chuẩn bị dịch chiết amylase Cân 10 gam Malt Xay vỏ, định mức 100ml, lắc kĩ Ngâm 15 phút, lắc Dịch chiết enzyme amylase Lọc lần giấy lọc 1.3.2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase Chuẩn bị môi trường chứa chất hoạt hoá ClCho mào ống nghiệm 1ml NaCl-đã pha Pha loãng dung dịch enzyme Amylase Cho vào ống nghiệm số 1ml, lắc Chuyển 1ml dung dịch ống nghiệm sang ống nghiệm 2, lắc tương tự tới ống nghiệm số 10 bỏ ml Page 19 Cho chất tác dụng với enzyme Ở ống nghiệm từ 110 cho 1ml tinh bột đem ủ 37oC 30 phút Bất hoạt enzyme, cho Iodine làm thị màu Cho vào ống nghiệm 1ml H2SO4 10%, hai giọt Iodine KI, lắc Kết Quan sát, ghi nhận kết quả, tiến hành tính tốn 1.3.2 Giải thích mục đích bước thực • Chuẩn bị mơi trường hoạt hố: Ion Cl- chất hoạt hố enzyme amylase Khi hồ tan NaCl vào nước phân li ion Cl - Cl- làm thay đổi trung tâm hoạt động • cho phù hợp với chất gắn vào dễ dàng Pha lỗng dịch chiết enzyme: Tìm nồng độ pha lỗng enzyme mà enzyme • khơng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột Bất hoạt enzyme, iodine thị màu: Thay đổi pH môi trường làm cho enzyme Amylase bị biến tính bất thuận nghịch Giúp q trình quan sát kết xác Iodine thêm vào để xác nhận dung dịch có cịn tinh bột hay khơng Kết thí nghiệm ♦ Tính lượng enzyme Amylase cho vào ống nghiệm Trong đó: V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml) V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml ) m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (10000mg) Page 19 2.1 Khảo sát hoạt độ enzyme 37oC 30 phút Hình 1: Kết khảo sát 37oC 30 phút Bảng 1: Kết thu 370c Số ống nghiệm 10 Độ pha loãng 16 32 64 128 256 512 1024 V V V V X X X X X X Nồng độ enzyme Màu ♦ Một đơn vị Wohlgemuth Trong : F- Độ pha lỗng ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm số có màu trùng với màu ống nghiệm 11) ♦ Số đơn vị Wohlgemuth có ml dịch chiết enzym ( NW): ♦Nhận xét kết thu được: Page 19 - Ở ống nghiệm số 1,2,3,4 xuất màu vàng tinh bột bị enzyme amylase thuỷ phân, nên ta thêm dung dịch Iodine vào thấy màu vàng dung dịch Iodine KI - Ống nghiệm số 5,6,7,8,9,10 xuất màu xanh đen dung dịch tinh bột, bao lấy Iodine tạo phức xanh đen Điều chứng tỏ pha lỗng tới nồng độ n/32 enzyme khơng cịn thuỷ phân hồn tồn tinh bột - Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) ta thấy màu sắc ống kiểm chứng trùng với màu ống nghiệm số 2.2 Khảo sát hoạt độ enzyme Amylase 47oC 30 phút o 47 oC 30 phút 2: Kết quảsátkhảo Hình 2:Hình Kết khảo 47sát C 30 phút Bảng 2: Kết thu 470c Số ống nghiệm 10 Độ pha loãng 16 32 64 128 256 512 1024 V V V V N X X X X X Nồng độ enzyme Màu Page 19 ♦ Một đơn vị Wohlgemuth Trong : F- Độ pha lỗng ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm số có màu trùng với màu ống nghiệm 11) ♦ Số đơn vị Wohlgemuth có ml dịch chiết enzym ( NW): ♦ Nhận xét kết Ở ống nghiệm số 1,2,3,4 xuất màu vàng tinh bột bị enzyme amylase thuỷ phân, nên ta thêm dung dịch Iodine vào thấy màu vàng dung dịch Iodine KI Ống nghiệm số có màu nâu đỏ lượng tinh bột cịn lại Do enzyme thuỷ phân tinh bột lại phân chưa thuỷ phân Ống nghiệm số 6,7,8,9,10 xuất màu xanh đen dung dịch tinh bột, bao lấy Iodine nên tạo phức xanh đen Điều chứng tỏ pha lỗng tới nồng độ n/32 enzyme khơng cịn thuỷ phân hồn tồn tinh bột Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) ta thấy màu sắc ống kiểm chứng trùng với màu ống nghiệm số Bàn luận câu hỏi mở rộng 3.1 Bàn luận kết Theo kết thực hai thí nghiệm ta nhận thấy nhiệt độ 47 oC enzyme Amylase hoạt động mạnh 37 oC điều giải thích ngun nhân sau: Page 19 - Khi nằm khoảng nhiệt độ tối ưu enzyme Amylase hoạt độ enzyme tăng theo nhiệt độ, tới giới hạn enzyme Amylase không tăng tăng nhiệt độ enzyme bị biến tính khơng phục hồi được( biến tính bất thuận nghịch) - Nguyên nhân thứ ta dùng acid H2SO4 để thay đổi pH nhằm bất hoạt enzyme, acid làm tinh bột thuỷ phân có xúc tác nhiệt độ Do kết thu thí nghiệm sau không đáng tin cậy 3.1.1 Các nguyên nhân ảnh hưởng đến kết - Q trình pha hố chất ( cân, đong, tính lượng chất tan) làm kết khơng xác, mắc sai số - Do thao tác thực sai sót dẫn đến kết qảu mắc sai số - Do thiết bị phịng thí nghiệm q cũ dẫn đến sai số ví dụ không đảm bảo đủ nhiệt độ 37oC hay 47oC thời gian 30 phút Gây nên sai số 3.1.2 Cách khắc phục sai số - Cần xác định rõ chất cần định lượng, tiến hành pha hoá chất thật xác - Thao tác thí nghiệm cẩn thận, xác - Kiểm tra dụng cụ, thiết bị trước thực 3.2 Câu hỏi mở rộng Nêu điều kiện hoạt động tối ưu loại Alpha-amylase có nguồn gốc khác Alpha-amylase từ nấm men Cryptococcus flavus: pH tối ưu 5.5, nhiệt độ tối ưu 50°C (Kenya J Wanderley,2004) Alpha-amylase từ rum (Carthamus tinctorius L.): pH tối ưu 6, nhiệt độ tối ưu 55°C, chất hoạt hóa Ca2+ (Mosbah Ben Elarbi, 2009) Alpha-amylase từ hạt đậu tương nảy mầm (Glycine max): pH tối ưu 5.5, nhiệt độ tối ưu 70°C (Arpana Kumari,2010) 2.Nêu tất sản phẩm thủy phân thu thủy phân tinh bột enzyme loại amylase sau: a Alpha b Beta c Gamma Page 19 Alpha Amylase thủy phân tinh bột cắt liên kết 1,4-alpha-glucoside cách ngẫu nhiên nên phần lớn sản phẩm tạo dextrin maltose dextrin Và sau thời gian dài lượng dextrin bị thủy phân tiếp tạo maltose, glucose Beta Amylase thủy phân tinh bột tạo maltose β-dextrin Gamma Amylase thủy phân tinh bột tạo glucose Nêu loại enzyme có malt, chất hàm lượng chúng Malt loại hạt ngũ cốc nảy mầm: malt đại mạch, malt thóc, malt ngơ…Enzyme malt phần lớn alpha-amylases, beta-amylases, proteases Ngồi cịn số enzyme beta-glucanases, hemicellulases lipases - Amylases: chất tinh bột, hàm lượng amylase malt - beta-glucanases: chất chất beta-glucan - Proteases: chất protein, hàm lượng amylase malt - Hemicellulases: chất Hemicellulose - Lipase: chất lipide 4.Nêu giai đoạn trình dextrin hóa Tinh bột alpha-amylase dextrin phân tử lượng thấp Bài thí nghiệm số XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME LIPASE Tóm tắt thí nghiệm 1.1 Ngun tắc Dưới tác dụng lipase, lipid bị thủy phân giải phóng acid béo Hàm lượng acid chuẩn độ kiềm Hoạt độ enzyme lượng kiềm cần để trung hịa acid hình thành Cơ chất tốt lipase lipid đối tượng enzyme 1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất -Cối chày sứ, erlen 10ml, pippet 1ml,10mlống đong, burret, cốc 100ml, 250ml, tủ ấm Page 19 -Đệm acetate pH=4,7 ( trộn CH3COOH 1N CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1) Đệm có tác dụng ổn định PH dung dịch để trình chuẩn độ diễn dễ dàng -Cồn 96o để gây biến tính protein làm enzyme ngưng hoạt động sau đem khỏi máy lắc -Toluen dung mơi để hịa tan chất - Ether ethylic dung môi để phân tán chất chuẩn độ để chuẩn độ hiệu -NaOH 0,1N chất chuẩn độ để trung hòa acid -Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein pha với 50 ml ethanol 50 ml nước cất Là chất thị để nhận biết NaOH dư -Dầu đậu nành tinh khiết chất cho enzyme thủy phân 1.3 Trình tự thí nghiệm -Cân 5.0 g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn cối sứ Chuyển vào erlen, thêm 10ml nước cất, lắc 15 phút 30oC -Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm chất ml đệm acetate với vài giọt toluene, lắc hỗn hợp 30oC 24 -Khi hết thời gian phản ứng, cho vào bình 25ml cồn 96 o 15ml ether, lắc để yên phút Chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N với thị phenolphthalein 1% -Làm bình kiểm chứng tương tự dịch chiết enzyme phải đun cách thủy 10 phút để làm hoạt tính trước cho chất vào Kết giải thích -Sau đem bình dung dịch bình kiểm chứng khỏi máy lắc Thêm 25ml cồn 96° 15ml ether lắc để phút quan sát : màu bình giống có màu trắng đục Lúc bình thí nghiệm acid béo tự sinh Page 19 -Tiến hành Hình 3: kết sau chuẩn độ chuẩn độ với NaOH 0,1N có thị phenolphtalein 1% dung dịch bắt đầu chuyển qua màu hồng nhạt Sự chuyển màu dung dịch có enzyme lipase thủy phân lipid dầu đậu nành thành acid béo Ban đầu NaOH phản ứng với acid để trung hòa dung dịch Sau NaOH dư tác dụng với thị làm dung dịch chuyển sang màu hồng Hình 4: Dung dịch sau chuẩn độ Hình 5: Màu dung dịch trước sau chuẩn độ Page 19 Bảng 3: Kết thu sau chuẩn độ dung dịch NaOH 0.1N Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm 17,1ml Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm chứng 8,4ml  Bình kiểm chứng có lượng NaOH thấp dịch chiết enzyme đun cách thủy nên bị bất hoạt lượng acid béo sinh từ q trình thủy phân nên cần lượng kiềm để trung hòa, dung dịch dễ chuyển sang màu hồng nhanh -Hoạt độ lipase (X) biểu thị số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự sinh lipase trích từ 10g hạt thủy phân 24 giờ: X với a: số ml NaOH để chuẩn độ bình thí nghiệm b: số ml NaOH để chuẩn độ bình kiểm chứng k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N (k=1) m: khối lượng hạt sử dụng  Vậy hoạt độ enzyme lipase 17,4 =>Ta thấy hoạt độ enzyme lipase cao, qua thấy khả xúc tác(cường độ xúc tác) để phân giải chất béo enzyme lipase cao, cao nhiều loại enzyme khác - Kết thí nghiệm dễ bị ảnh hưởng yếu tố như: + Qúa trình nghiền đậu nành khơng mịn +Dầu đậu nành làm chất không tinh khiết mua ảnh hưởng đến việc xúc tác enzyme +Do hệ thống cân bị sai lệch q trình cân làm thí nghiệm chưa xác dẫn đến nồng độ pha bị xê dịch Page 19 +Do thao tác người tiến hành thí nghiệm chưa chuẩn xác, gây sai số +Do chuẩn bị chưa kĩ nên để dịch chiết có enzyme thủy phân chất vòng khoảng tiếng, gây ảnh hưởng tới kết thí nghiệm +Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH lấy tương đối chưa hoàn tồn xác Bài thí nghiệm số KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME INVERTASE 1.Tóm tắt thí nghiệm 1.1 Ngun tắc Invertase enzyme thủy phân đường saccharose thành glucose fructose Có thể xác định hoạt độ enzyme invertase thơng qua lượng glucose tạo Iodine có khả oxi hóa glucose mơi trường kiềm Sau đó, lượng glucose sinh xác định cách định phân iodine dư dung dịch Na2S2O3 1.2 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất − Saccharose 10%: Cân 10g Saccharose pha bình định mức 100mL, thêm nước đến vạch định mức Saccarose chất cho phản ứng − NaOH 0.1N: hòa tan 4g NaOH cho đủ 1000 ml nước cất; NaOH giúp tạo môi trường kiềm để Iodine oxy hóa glucose − Iodine 0.1N: cân 4g KI hịa tan với 10ml nước cất bình cầu 100ml Cân 1.27g I cho vào bình cầu lắc tan hoàn toàn Nhỏ giọt HCl 37% Định mức cho đủ 100ml nước cất − H2SO4 1N: hòa tan 2.27 ml H2SO4 96% cho đủ 100ml nước cất; − Hồ tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột với 100ml nước cất Đun cách thủy 15 phút − Dung dịch Na2S2O3 0.05N: cân 12.5g Na2S2O3.5H2O cho đủ nước cất cho đủ 1000ml 1.3 Trình tự thí nghiệm a Điều chế dung dịch invertase: Cân 1g men bánh mì, hịa tan với 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc phút Để lắng, lọc lấy dịch lọc b.Chuẩn bị ống nghiệm: Page 19 Bảng 4: Chuẩn bị ống nghiệm sau Số ống Dung dịch saccharose 10% (ml) 2 Nước cất (ml) 0 Dịch enzyme (ml) 2 Dịch enzyme đun cách thủy (ml) 0 Để ống nghiệm nhiệt độ phịng xác 30 phút sau đem cách thủy 10 phút Sau Ở ống nghiệm, hút 1ml hỗn hợp dung dịch cho vào bình tam giác 100ml để xác định hàm lượng glucose Xác định glucose: cho vào bình tam giác ml dung dịch iodine 0,1N nhỏ chậm ml NaOH 0,1N cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng phút Để yên bóng tối 20 phút Lấy cho thêm 1ml H 2SO4 1N Định phân lượng iodine thêm thừa Na2S2O3 0.05N có hồ tinh bột 1% làm chất thị Lặp lại bước thí nghiệm lần 2.Kết thí nghiệm giải thích Bảng 5: Kết dùng Na2S2O3 dùng để chuẩn độ I2 dư thí nghiệm xác định hoạt độ dung dịch invertase Ống nghiệm Số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để định phân 7.0 3.5 6.8 3.8 3.65 Page 19 Hình 6: Kết chuẩn độ I2 dư Na2S2O3 thí nghiệm xác địn hoạt độ enzyme invertase Hoạt độ enzyme invertase biểu thị số mol saccharose bị thủy phân lượng enzyme có 1g men bánh mì phút nhiệt độ phịng thí nghiệm a invertase = (V1 - V2) × A × B/( 1000 × 20 × × a × b × t × m) Trong đó: V1: số ml dung dịch dùng để định phân ống nghiệm V2: số ml dung dịch dùng để định phân ống nghiệm A: thể tích tổng cộng ống nghiệm B: tổng thể tích dịch trích enzyme có từ m(g) men bánh mì (ml) a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml) Page 19 b: thể tích dịch trích enzyme cho vào ống nghiệm (ml) t: thời gian thủy phân (phút) Như vậy, hoạt độ enzyme invertase xác định thí nghiệm a = () × × 100/(1000 × 20 × × × × 30 × 1) =5.58 × 10-4 Vậy hoạt độ enzyme invertase 5.58 × 10-4 mol saccarose bị thủy phân 100ml enzyme có 1g men bánh mì phút nhiệt độ phịng Giải thích kết Thí nghiệm thực dựa phản ứng hóa học sau: invertase Saccharose α-glucose + β- fructose Trong môi trường kiềm, Iodine tác dụng với NaOH tạo thành NaOI NaI NaOI tác dụng với glucose (tạo thành trình thủy phân invertase) tạo thành acid gluconic NaI I2 + NaOH = NaOI + NaI + H2O NaOI + CH2OH-(CHOH)4-CHO = NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH (Glucose) (Acid gluconic) Sau đó, cho dung dịch H2SO4 vào ta thu hồi lượng I dư sau xảy q trình oxi hóa glucose 2NaOI + 2NaI + 2H2SO4 = I2 + 2Na2SO4 +2H2O Page 19 Lúc này, hỗn hợp dung dịch bình tam giác có màu vàng I2 dư Sau cho hồ tinh bột 1% làm chất thị, dung dịch bình tam giác có màu xanh đen phức iodine- hồ tinh bột Dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ lượng I2 dư đến màu xanh đen trở thành không màu 2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 +2 NaI Trong ống nghiệm chứa nước cất dịch enzyme nên toàn lượng Iodine cho vào Na2S2O3 chuẩn độ Vì vậy, số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ nhiều Tỉ lệ chuyển hóa saccharose nhờ enzyme invertase tăng tăng nhiệt độ, để tránh biến tính, nhiệt độ cố định từ 50 0c đến 550c (Monsan cộng 1984) nên thí nghiệm ta đun cách thủy 10 phút làm bất hoạt enzyme Vì vậy, ống nghiệm số saccharose 10% không bị thủy phân dịch enzyme đun cách thủy 10 phút nên glucose không tạo Ở ống nghiệm số 2, enzyme invertase hoạt động giúp thủy phân saccharose tạo thành glucose fructose xảy đầy đủ phản ứng nên lượng Na 2S2O3 dùng định phân Bài thí nghiệm số KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC XÁC ĐỊNH HÀM ĐỘ ENZYME UREASE Tóm tắt thí nghiệm 1.1 Điều chế dung dịch urease Page 19 - Cân 10g đậu nành xay thành bột khuấy vào 150ml nước sau cho vào bình định mức 250ml, định mức tới vạch nước cất Lọc thu dịch 1.2 Khảo sát động học -Chuẩn bị dãy óng nghiệm dãy ống Cho dung dịch vào dãy sau: Bảng 6: Thành phần cho vào ống nghiệm Ure 1/3M (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 Nước cất (ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1 1 1 dung dịch urease(ml) - Đặt dãy thứ nhấ vào bể ổn nhiệt 40°C, dãy thứ hai vào tủ ấm 30°C 20 phút - Thêm vào ống nghiệm ml formol trung tính, lắc phút - Chuyển ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với nước cất, thêm giọt phenolphtalein 1% - Cho dung dịch NaOH 0,05 N lên burret bắt đầu định phân tới dung dịch chuyển sang màu hồng dừng lại ghi nhận kết 1.3 Khảo sát hoạt độ enzyme Bảng 7: Thành phần cho vào ống nghiệm Ure 1/3M 1 Nước cất (ml) 0 dung dịch urease (ml) 1 dung dịch urease đun cách thủy (ml) 0 - Mang tất ống nghiệm cho đặt vào 40°C 20 phút - Cho vào ống nghiệm 1ml formol trung tính lắc phút Page 19 - Đổ ống erlen 100ml thêm vào giọt phenolphtalein tiến hành chuẩn độ đến dung dịch chuyển sang màu hồng dừng lại ghi nhận kết Kết giải thích thí nghiệm 2.1 Kết - Ống nghiệm sau định phân chuyển từ không màu sang màu hồng nhạt Hình 7: Kết chuẩn độ dung dịch NaOH 0.05N 2.1.1 Kết thí nghiệm khảo sát động học enzyme Bảng 8: Kết lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch thí nghiệm khảo sát động học(ml) Ống nghiệm 30°C 0,2 0,4 1,1 1,1 1,2 40°C 0,2 0,6 1,1 1,2 1,2 1,3 *Lưu ý: ống nghiệm thứ khơng có chất nên nhỏ NaOH xuống để chuẩn độ dung dịch chuyển sang màu hông ta ghi nhận lại kết thực chất phản ứng thủy phân không xảy nên vận tốc Page 19 Từ kết vẽ đồ thị biểu diễn phương trình động học MichaelisMenten sau: Bảng 9: Kết xác định vận tốc thủy phân urease đậu nành [S] (mM) Ống V1 (30°C) (mM/phút) V2(40°C) (mM/phút) 1/[S] (mM)-1 1/V1 (mM/phút)-1 1/V2 (mM/phút)-1 - - - 7.5.10-4 30 2000 1333 1.25.10-3 1.38.10-3 15 800 725 1/10 1.38.10-3 1.5.10-3 10 725 667 2/15 1.38.10-3 1.5.10-3 7.5 725 667 1/6 1.5.10-3 1.63.10-3 667 613 0 1/30 10-4 1/15 Đồ thị biểu diễn biến đổi vận tốc thuỷ phân urease đậu nành thay đổi nồng độ chất ure Đồ thị biểu diễn phụ thuộc 1/V 1/[S] urease đậu nành Bảng 10: Từ kết số liệu thu nhận thấy cách thông số động học đậu nành sau: Vmax (mM/phút) Km (mM) Ở 30 c 7,99.10 -3 0,486 Ở 400c 4,34.10-3 0,166 Từ kết cho thấy Km 30°C cao hon Km 40°C điều cho giúp ta kết luận đậu nành ủ nhiệt độ 30°C có lực với chất thấp đậu nành ủ nhiệt độ 40°C Ta thấy Vmax đậu ủ 30°C thấp đậu ủ 40°C 2.1.2 Kết thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzyme Bảng 11: Kết lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch thí nghiệm khảo sát hoạt độ enzym Page 19 Ống nghiệm 400C 0,3 0,7 0,4 - Hoạt độ enzyme tính theo cơng thức: 1.25× 10-5 - Vậy có 1.25× 10-5 (mol) ure bị thủy phân lượng enzym urease có 1g bột đậu nành thời gian phút 400c - Trong đó: V1,V2: Số ml NaOH 0,05N dùng định phân ống nghiệm a: Thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: Tổng thể tích enzyme có từ m(g) đậu nành t: Thời gian thủy phân (phút) m: Khối lượng mẫu cân k: Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05N 2.2 Gỉai thích Ở thí nghiệm khảo sát động học lượng - NaOH dùng để chuẩn độ nhiệt độ 40°C cao so với nhiệt độ 30°C vì: Nhiệt độ tối ưu urease 45-50°C (Mobley cộng sự) nên gần nhiệt độ tối ưu enzyme urease thủy phân ure tốt để tạo NH3 CO2 nên lượng H2CO3 tạo nhiều lượng NaOH dùng nhiều - Khi lượng H2CO3 hết tiếp tục nhỏ NaOH vào erlen chuyển sang màu hồng phenolphtalein có chất acid yếu tác dụng với bazơ đổi màu - Trong thí nghiệm ta cần phải điều chế formol trung tính formol dư tác dụng với NaOH chuẩn độ làm sai lệch đáp số cuối Ở thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme Page 19 -Ống nghiệm thứ khơng có ure khơng có H2CO3 tạo giọt NaOH nhỏ xuống dung dịch bị chuyển sang màu hồng -Ống nghiệm thứ hai có phản ứng thủy phân ure xảy có urease xúc tác nên thể tích tăng NaOH cao ống thứ ống thứ - Ở ống thứ ba có ure urease urease bị bất hoạt trình đun cách thủy nên khơng thể xúc tác cho ure tham gia phản ứng thủy phân, lí mà giọt NaOH nhỏ xuống dung dịch chuyển sang màu hồng Câu hỏi mở rộng Trình bày lợi ích tác hại enzyme urease? • Lợi ích: - Ure nguồn cung cấp N2 quan trọng trồng khôn sử dụng trực tiếp nguồn N2 urease phân hủy ure thành NH3 cho trồng tiêu thụ - Urease ứng dụng y học để định lượng ure máu nước tiểu • Tác hại: Urease thủy phân Ure tạo NH3 làm tăng pH Điều kiện pH tạo tăng cường lắng đọng khoáng chất bề mặt răng, nồng độ amoniac cao có tác dụng có hại tế bào chủ chẳng hạn nguyên bào sợi bạch cầu đa nhân Vì vậy, phân hủy góp phần vào phát triển hủy hoại mô thấy trường hợp viêm nướu viêm nha chu.(M Chen cộng 1996) • Mở rơng: Ngồi phương pháp xác đingj hoạt độ enzyme nêu người ta chuẩn độ trực tiếp lượng NH3 tạo H2SO4 dùng phản ứng tạo màu với thuốc thử Nessler để định lượng NH3 phóng thích Tài liệu tham khảo [1] Tài liệu hướng dẫn Thí nghiệm Hóa sinh, 2017, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TPHCM, page 1-10 [2] H L Mobley, M J Cortesia, L E Rosenthal, B D Jones.1988.Characterization of Urease from Campylobacter pylori Journal of clinical microbiology Pp831-836 Page 19 [3] Yi-ywan M chen, 1K Anne Clancy,1,2 and Robert A Burne 1996.Streptococcus salivarius Urease: Genetic and Biochemical Characterization and Expression in a Dental Plaque Streptococcus Infection and immunity Pp585–592 [4] Arpana Kumari 2010 Alpha-Amylase from germinating soybean (Glycine max) seeds – Purification, characterization and sequential similarity of conserved and catalytic amino acid residues Phytochemistry 71 1657–1666 [5] Kenya J Wanderley 2004 Biochemical characterization of alpha-amylase from the yeast Cryptococcus flavus FEMS Microbiology Letters 231 165-169 [6] Mosbah Ben Elarbi 2009 Purification and characterization of α-amylase from safflower (Carthamus tinctorius L.) germinating seeds Biochemistry / Biochimie C R Biologies 332 426–432 [7] Nguyễn Đức Lượng 2010 Những hiểu hiết enzyme Công nghệ enzyme Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 10 [8] R.J Whitehurst and B.A Law 2002.Enzymes in brewing Enzymes in Food Technology CRC Press LLC Boca Raton, Florida 64-66 [9] Monsan, P., & Combes, D (1984) Application of immobilized invertase to continuous hydrolysis of concentrated sucrose solutions Biotechnology and Bioengineering, 26(4), 347–351 Page 19