Cơ sở khoa học và ứng dụng của sinh học phân tử trong chẩn đoán ung thư

Giáo viên hướng dẫn: PGS-TS Khuất Hữu Thanh Cơ sở khoa học ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán ung thư Thành viên thực hiện: Nội dung ► Định nghĩa ung thư ► Nguyên nhân chế gây ung thư ► Chẩn đoán ung thư ► Chẩn đoán ung thư sinh học phân tử Định nghĩa ► Ung thư (hay u ác tính) nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vơ tổ chức những tế bào có khả xâm lấn những mô khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nơi xa gọi di ► Nếu khơng chữa trị sớm dẫn đến tử vong Đây nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước phát triển ► Hầu hết bệnh ung thư chữa trị chữa lành phát điều trị sớm Nguyên nhân chế 2.1 Nguyên nhân ngoại sinh a Các chất gây ung thư công nghiệp ► Con người chịu tác động ô nhiễm môi trường hóa chất sinh thư cơng nghiệp, đặc biệt cơng nhân nhà máy Ví dụ: ► Asbestos nhà máy đóng tàu gây tỷ lệ ung thư phổi cao ► Naphthylamine phẩm nhuộm nguyên nhân gây ung thư bàng quang người làm nghề nhuộm ► Công nhân mỏ niken thường ung thư mũi , công nhân sử dụng thuốc trừ sâu nhiều dễ bị ung thư da b Thuốc ► Có nhiều loại thuốc dùng cho điều trị tác nhân gây ung thư Nhưng nguy phát triển thành ung thư thuốc thường chậm , dùng chúng để điều trị cho bệnh ung thư Ví dụ: ► Các ung thư thứ phát  phát triển bệnh nhân điều trị tác nhân alkyl hoá nitrogen mustard cyclophosphomid ► Trong bệnh  Hodgkin thuốc hố học cứu bệnh nhân cho dù ung  thư thứ phát xảy từ 1-3 % bệnh nhân điều trị c Chất hóa học ► ► Các chất hố học gây ung thư kể nhiều mơi trường sống Các chất hố học gây ung thư phân loại theo nguồn gốc, thành phần hố học cách tác động chúng Ví dụ: ► ► ▪ Alfatoxin B1 chất có khả gây ung thư gan cao , chúng sinh từ nấm Aspergillus flavus Nhóm hay gây ung thư polycyclic aromatic hydrocarbon: Chất polycyclic hydrocarbon benzpyrenne thành phần quan trọng khói thuốc lá, nhựa đường, sản phẩm đốt than đá dùng công nghiệp chứa nhiều hydrocarbon vòng ▪ Cấu trúc hydrocarbon vòng thấy steroide hormone sinh dục đặc biệt ostrogen chúng sinh khối u số tổ chức nhạy cảm với hormone estrogen Khi có chế tiết mức buồng trứng thượng thận nguyên nhân ung thư vú tử cung Cơ chế tác động: ► Tác động chỗ: Ung thư da tác dụng chỗ kích  thích ánh sáng mặt trời, yếu tố gây ung thư phổi khói thuốc tác động nên niêm mạc khí phế quản ► Trong quan tiêu hóa: Trong dày ruột yếu tố gây ung thư thường chuyển thành chất trung gian gây tác động nitrites nitrates thức ăn chuyển thành nitrosamine nhờ tác động vi khuẩn ruột , nitrosamine gây ung thư đại tràng ► Trong quan chuyển hóa: Gan quan liên quan đến việc hoá giáng biến đổi tác nhân gây ung thư, biến đổi chúng thành thành phần khác như alfatoxin chất có khả gây ung thư gan cao ► Ở quan xuất: Aromatic amine từ thuốc nhuộm azo chuyển hoá thể tiết qua thận thường gây ung thư bàng quang Cơ chế sinh học phân tử: ► Các chất hóa học (hay chất gây đột biến, mutagen) gắn vào DNA gây gãy chuỗi DNA can thiệp vào chép DNA, gây đột biến DNA d Tác nhân vật lý ► Tác nhân chủ yếu tia xạ, tia xạ có nguồn gốc từ tia sáng cực tím , tia XQ , chất đồng vị phóng xạ bom nguyên tử Tia cực tím thường gây ung thư da , hay gặp người làm việc ánh sáng mặt trời nhiều ngư dân , nông dân ► Các chất có hoạt tính phóng xạ mơi trường sử dụng nhiều nghiên cứu tia anpha, beta gama tia gama có hại tiềm gây ung cao ► Cơ chế sinh học phân tử: Các xạ ion hóa phá hủy cấu trúc phân tử gây tổn thương tế bào Phản ứng ion hoá DNA tuỳ vào lượng tia xạ , liều lượng loại xạ Tổn thương quan trọng DNA gãy chuỗi xoắn đôi gây đột biến a Nhiễm sắc thể: ► Đột biến nhiễm sắc thể tạo dấu ấn sinh học điểm ung thư chẩn đốn Ví dụ: NST Pheladelphia đột biến quen thuộc ung thư máu Khi NST số 22 bị đột biến thêm đoạn từ NST số chuyển vào Gen ABL NST số lúc chuyển sang NST số 22 hợp với gen BCR NST số 22 để tạo thành liên hợp gen BCR-ABL Gen chứa thông tin di truyền tổng hợp nên protein bất thường gây ung thư bạch cầu Phương pháp chủ yếu để xác định xét nghiệm máu b Gen: ► Đột biến mức độ gen dẫn đến ung thư mà chẩn đoán sinh học phân tử ► Khi DNA xảy thay đổi thành phần, số lượng nucleotide, từ tạo hệ khác nhau: • Khơng ảnh hưởng: Sự thay đổi DNA không ảnh hưởng đến chức protein mà chúng mã hóa cho • Kích hoạt: Khiến cho khơng kiểm sốt q trình tạo protein protein tạo có chức khác • Bất hoạt: Làm chức protein mà chúng mã hóa cho, ảnh hưởng đến hoạt động bình thường gen khác c Protein: ► Dùng protein dấu ấn sinh học phân tử phương pháp phổ biến chẩn đoán ung thư Thường protein bất thường tạo từ gen đột biến vào máu, số trường hợp giữ lại lớp mơ Chẩn đốn phân tử 4.4 Các phương pháp chẩn đoán ung thư sinh học phân tử a Giải trình tự DNA: Một phương pháp để phát DNA trực tiếp xác định nucleotide mà DNA mang Người phát nguyên tắc Fred Sanger, ông tạch đoạn DNA thành mạch đơn, sau mạch đơn tái nhiều lần dùng hóa chất để dừng q trình tái vị trí khác Từ tạo hàng loạt các mạch DNA đơn với độ dài khác Các hóa chất dùng để dừng cacd nucleotide định, điều cho phép họ tập hợp mảnh DNA thành chuỗi hồn chỉnh đoạn DNA ban đầu Qua đó, ta nhìn thấy điểm đột biến bất thường từ DNA ta phân tích Hiện phương pháp cải tiến có tên NGS, nhanh đỡ tốn đồng thời tích hợp với máy tính hiển thị kết Từ dễ dàng phát đột biến gen bất hoạt khối u, gen có khả gây ung thư b Các phương pháp sử dụng đoạn dị: Probe (cịn có tên gọi khác là đoạn dị) sợi nucleic acid (hoặc ribonucleic acid) có trình tự xác định đánh dấu phương pháp khác dùng để nhận diện đoạn nucleic acid khác có trình tự bổ sung với Q trình dựa ngun tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA, gọi là lai phân tử DNA Các phương pháp cổ điển có sử dụng probe là Northern Blot (nhận diện bản RNA phiên mã), Southern Blot (nhận diện phiên của gen) ► Phương pháp Southern blot: Phương pháp Southern Blot Edward Southern phát minh năm 1975, cho phép nghiên cứu DNA gen, kiểm tra kết chuyển gen kiểm tra có mặt gen đó, đặc biệt gen gây ung thư q trình chẩn đốn Đầu tiên cắt đoạn DNA thành đoạn nhỏ cho điện di gel agar để tách DNA có kích thướng khác Sau chuyển đoạn DNA từ gel lên màng lai sức mao dẫn Sử dụng mẫu dị có đánh dấu phóng xạ lai với đoạn DNA màng lai tạo nên phân tử DNA lai Cuối thực phóng xạ tự ghi phim X quang nhạy nhiệt độ -20 độ C, xử lý ánh sáng tử ngoại giây để kiểm tra kết lai ► Phương pháp Northern blot: Nguyên tắc thực tương tự lai Southern blot Tách triết tinh RNA tế bào, chuyển lên màng lai, sử dụng mẫu dị DNA có đánh dấu phóng xạ để tạo nên phân tử lai RNA - DNA, cuối phát phân tử lai phim X quang nhạy c DNA Microarray: Kỹ thuật Microarray sử dụng phổ biến chẩn đoán bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm đặc biệt bệnh ung thư cách xác định đoạn gen gây bệnh đặc hiệu thể sinh vật DNA microarray (còn gọi là DNA chip hay gene chip) thủy tinh nhựa có gắn đoạn DNA thành hàng siêu nhỏ c DNA Microarray: Đầu tiên, lấy mẫu tế bào bệnh nhân đem nuôi cấy tách chiết RNA thông tin (mRNA) Sau phiên mã ngược tạo thành cDNA, ta đem đánh dấu huỳnh quang cho lai microarray Tiếp theo, đưa mẫu lai vào máy scan để hiển thị kết máy tính Từ xác định xem, gen tế bào bệnh nhân có gen gây ung thư hay khơng Ví dụ ứng dụng SHPT vào chuẩn đoán ung thư ► Đối với người có triệu chứng bệnh nghi ngờ ung thư đại tràng với số triệu chứng ban đầu hay rối loạn tiêu hóa, đại tiện khơng khơng bình thường thời gian dài, đại tiện kèm xuất huyết Một số triệu chứng muộn đau quặn bụng cơn, sút cân, chán ăn,… ► Hầu hết trường hợp ung thư đại tràng xuất phát từ khối u nhỏ lành tính, viêm nhiễm rối loạn chức đại tràng khiến khối u trở thành ung thư phát triển ► Người có nghi ngờ bị ung thư đại trực tràng bác sĩ đưa tiến hành kỹ thuật xét nghiệm, chụp chiếu Trong có xét nghiệm máu kiểm tra nồng độ protein CEA ► CEA viết tắt cho CarcinoEmbryonic Antigen – protein, cụ thể kháng nguyên xuất tế bào ruột thai nhi, kháng thể biến giảm xuống sau đứa trẻ đời Các quy trình xét nghiệm, chẩn đoán ung thư trực tràng CEA: ► Lấy mẫu máu người có nghi ngờ ung thư trực tràng (Trong số trường hợp xét nghiệm dịch khác thể để kiểm tra có di căn) ► Lọc hồng cầu yếu tố gây đông tụ, thu huyết ► Dùng phương pháp Western Blot, cho chạy điện di gel acrylamide Sau lấy gel chuyển protein lên màng ► Đem lai với đoạn dò đặc hiệu kháng thể đơn dòng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên Sau sử dụng phim X-Quang nhạy để phát đoạn lai ► Nếu xuất đoạn lai nghĩa có xuất CEA huyết người xét nghiệm Từ kèm theo xét nghiệm khác để đưa chẩn đoán ung thư cho người khám ► Tuy nhiên, phương pháp Western Blot định tính có mặt protein CEA máu Yếu tố khơng xác số trường hợp, thể người có lượng CEA định mà ung thư, người hút thuốc lá, mắc số bệnh lành tính xơ gan, viêm loét dày,… Vì vậy, ta dung thêm phương pháp định lượng ELISA để đưa đến kết luận xác ► ELISA phương pháp phân tử ứng dụng chẩn đoán miễn dịch Về nguyên tắc giống phương pháp dùng phương pháp định tính kết hợp kháng thể - kháng nguyên đặc hiệu Ngoài phương pháp cịn định lượng cách đo mật độ quang OD để xác định nồng độ CEA huyết người bệnh KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG ► Giá trị CEA huyết người bình thường không hút thuốc thường < 2,5 ng/ml ► Giá trị CEA người hút thuốc thường < ng/ml ► Giá trị CEA huyết người có bệnh lành tính thường khơng q 10 ng/ml Cảm ơn thầy bạn ý lắng nghe!!! ...Nội dung ► Định nghĩa ung thư ► Nguyên nhân chế gây ung thư ► Chẩn đoán ung thư ► Chẩn đoán ung thư sinh học phân tử Định nghĩa ► Ung thư (hay u ác tính) nhóm bệnh liên quan đến việc? ?phân chia... mạng Chẩn đốn 3.1 Đại cương Chẩn đoán bệnh ung thư bao gồm: Chẩn đoán xác định, chẩn đoán giai đoạn chẩn đoán sớm ung thư Để đạt mục tiêu chẩn đoán ung thư cần phải tiến hành bước ► Chẩn đoán. .. đầu: Chẩn đoán sơ hướng đến bệnh ung thư ► Chẩn đoán xác định: Dựa vào mô bệnh học - tiêu chuẩn vàng ► Chẩn đoán giai đoạn bệnh ung thư theo TNM Chẩn đoán 3.2 Chẩn đoán? ? lâm sàng  bệnh ung thư