Một số ứng dụng của sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị bệnh di truyền

Trong đề tài này, chúng tôi nêu một số thí dụ về việc xử dụng những hiểu biết thu được từ ngành khoa học này trong việc chữatrị một số bệnh di truyền Định nghĩa một cách tóm tắt, SHPT là

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NỐNG LÂM TP.HCM

Bộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

I KHẢI QUẮT CHUNG

Trong y học hiện đại, môn sinh học phân tử (SHPT) đóng vai trò hàngđầu giúp hiểu biết được cơ chế sinh bệnh và từ đó ứng dụng vào việc chẩnđoán và chữa bệnh Trong đề tài này, chúng tôi nêu một số thí dụ về việc

xử dụng những hiểu biết thu được từ ngành khoa học này trong việc chữatrị một số bệnh di truyền

Định nghĩa một cách tóm tắt, SHPT là ngành khoa học khảo cứu ở mức độphân tử (molecular level) cấu trúc (structure) của sinh vật ; và nhất là cơchế hoạt động và điều tiết (regulation), sự tác dụng hỗ tương (interaction)của các phân tử này

SHPT nhắm vào việc tìm hiếu ở mức độ phân tử sự liên hệ giữa các cơquan của một sinh vật, cũng như sự liên hệ giữa các sinh vật với nhau (thí

dụ, cơ chế sinh sản và di truyền), và sự thích ứng của sinh vật với môitrường chung quanh

Từ "sinh học phân tử" đã được xử dụng từ những năm 1930, nhưngngành khoa học này chỉ bắt đầu được chú ý đến nhờ những thành côngtrong việc nghiên cứu về DNA như là đơn vị cơ bản của sự di truyền, nhất

là nhờ việc khám phá cấu trúc trong không gian của DNA Với những tiến

bộ về kỹ thuật trong những năm gần đây, với sự đóng góp đắc lực của cácmáy tính, SHPT trở thành ngành "mũi nhọn" của sinh học và y học

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

II MÔT SỎ BÊNH DI TRUYỀN THƯỜNG GĂP :

1) Bệnh Tay-sachs :

Đây là một bệnh di truyền, thường gặp ở người châu Ầu, do thiếu gen

mã hóa tống hợp enzym hexozaminidaza A Đây là một enzym ưa acidnằm trong tiêu thể, có tác dụng phân hủy gangliozid GM2 GangliozidGM2 là glycolipid thành phần chính của vỏ bao myelin thần kinh.Dokhông có enzym phân hủy,glycolipid này tích lũy và ứ đọng gây rahiện tượng chậm phát triển, rối loạn tâm thần, mù lòa, tai biến ngậpmáu và tủ’ vong

tl’I OÔ UC I&

W.*M'M

n /5

0

Lysosome

p)

Cells in children with Tay-Sachs disease

Children with Tay-Sachs lack Hex-A, so the GM2 proliíerates to such a

(ills the cell gradually shutting dovvn the Central nervous System.

If Hex-A ereyme is not present GM2 accuirailates and in tirne chokes off the cells.

REID BROWNI THE PLAIN DEALER

Hình 1&2 : Cơ chế của bệnh Tay-sachs

2 ) Bênh Huntington :

Vào thời Trung cổ, điệu múa giật ( chorée ) một đặc trưng của

bệnh Huntington, bị coi là vũ điệu của Saint-Guy người ta kết tội bệnh

nhân là bị qủy ám, qủy nhập và đưa họ lên giàn thiêu Tới thế kỷ 17, ở

Salem Mỹ, người ta vẫn kết tội họ là phù thuỷ và giết họ Phải chờ tới

năm 1872, một người Mỹ, ông George Huntington, mô tả bệnh này

một cách khoa học, người ta mới biết đây là một chứng bệnh về thần

kinh

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

Tuy nhiên suốt một thời gian dài, căn bệnh di truyền bất trị này

hổ ; và bệnhnhân được đemgiấu đi, cả thầythuốc cũngkhông biết Mãiđến năm 1958,khi ca sĩ người

Mỹ WoodyGuthie qua đời,nguyên nhân cáichết được công

bố thì côngchúng mới biết

rõ hơn vê bệnh này

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

The gene'i DNA il Ironiloled into amino otidi whi(h (orm the abnormal hưntingtin protein.

di truyền của hệ thần kinh trung

uơng, thường biểu hiện ở tuổi từ 25

đến 55 Não dần dần bị thoái hóa

gây nên các triệu chứng ban đầu nhu

cử động vô thức và rối loạn thăng

bằng Khi bệnh nặng lên, các chức

năng sống nhu ngôn ngữ và đi lại có

thế bị sút giảm Bệnh Huntington bị cho là có liên quan đến phiên bản đột

biến của protein huntingtin gây phá hủy mô não.Nhưng hiện chưa xác địnhđược chức năng của protein huntingtin "bình thường" ở người không bịbệnh

Các nhà nghiên cứu thuộc Trường ĐH Milan, Italia phát hiện thấyprotein huntingtin kiểm soát việc sản sinh yếu tố hướng thần kinh của não(BDNF), thiết yếu đế duy trì loại tế bào não bị chết đi trong bệnhHuntington Những bệnh nhân có protein huntingtin đột biến không thế sảnsinh được lượng BDNF thích hợp, dẫn đến thoái hóa não Từ trước đến nay,người ta cho rằng bệnh Huntington là do hoạt tính độc của protein đột biến.Nghiên cứu này đã cho thấy có hiện tượng mất chức năng bình thường

Sự gia tăng hàm lượng BDNF có thế có lợi cho bệnh nhân Huntington.Các nhà nghiên cứu đang tìm ra các thuốc bắt chước hoạt động của proteinhuntingtin bình thường, làm tăng sản sinh BDNF đế điều trị bệnh

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

Hi'nh 5: Co’ chế cuả bệnh Himtington

2) Bệnh Thaỉassemia :

a ) Bệnh Thalassemỉa là gì?

Thalassemia là bệnh lý thiếu máu di truyền thường gặp nhất tại Việt

nam và các quốc gia vùng Đông Nam Á, Địa Trung Hải Bệnh có nhiều

thế lâm sàng; thế bệnh nặng thì bệnh nhân cần phải truyền máu suốt đời và

ảnh hưởng tới tuổi thọ

b )Nguyên nhân bệnh

Thalassemia?

Hemoglobin là protein

trong hồng cầu có chức năng

vận chuyển oxy cho các bộ

phận của cơ thể Hemoglobin

red blood cell

\\ Chain

a Chainshape of thepolypeptide molecule

a Chain

heme

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

gồm có hai dạng protein là chuỗi alpha globin và beta globin Neu bấtthường xảy ra trên phần alpha globin, bé bị thiếu máu dạng alphaThalassemia Trường hợp bất thường nằm trên chuồi beta globin, trẻ bịdạng beta Thalassemia

Đây là bệnh lý di truyền do sự thiếu hụt tổng hợp một chuồi globintrong huyết sắc tố của hồng cầu Hồng cầu bệnh nhân không bền, bị pháhuỷ sớm làm bệnh nhân bị thiếu máu và ứ sắt

c ) Các biếu hiện bệnh :

Bệnh khởi phát âm thầm, từ từ Đen một lúc nào đó, người bệnh bịthiếu máu, da nhợt, màu xanh lục, mu bàn tay nhiễm sắc tổ nâu, lách rất to,đôi khi gan to Mỗi đợt tan máu thì có sốt, da vàng, nước tiếu sẫm, lách tothêm Neu chụp X-quang xương sẽ thấy có hiện tượng rối loạn loãngxương Bệnh nhân nếu là trẻ em thì sẽ chậm lớn

Neu xét nghiệm máu, ta sẽ thấy hồng cầu không đều, to nhỏ khác

nhau, hồng cầu dẹt, ở giữa nhạt, gọi là hình bia Hồng cầu lưới tăng, sức

bền thấm thấu của hồng cầu và bilirubin máu t ăng, đôi khi có hiện tương

bạch cầu tăng

H ình 6 : Hồng cầu bị biến dạng

-: H c ■ ■ ■

Transcription

Only one base ditĩei^s from the sequence

1 of ttie normal hemoạlobin allele

Normal hemo^rlobin Sickle cell hemoglobin

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

Hình 8 : Cơ chế gây đột biến hồng cầu hình liềm

eNOS, adhesĩon molecules

(ICAMS,VCAMS, integrĩns, selectins), grovvth factors

Hình 10: Hồng cầu hình liềm gây nghẽn mạch máu

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

4 ) Bênh loan dưỡng cơ Duchenne và Becker :

structure of a Skeletal Muscle

Muscle fiber

/

Hình 11 : câu tạo cua một bó cơ

Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker là một rối loạn về di truyền đặc trưng bởi sự thoái hóa và suy yếu dần dần bát đầu từ những thay đối vi mô ở các cơ Một khi các cơ thoái hóa dần theo thời gian, sức mạnh của các cơ của người bệnh

sẽ bị suy giảm theo.

Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne (tiếng Anh viết tắt là DMD) được một bác sĩ

chuyên khoa thần kinh người Pháp tên là Guillaume Benjamin Amand Duchenne

mô tả lần đầu tiên trong thập niên 1860 Chứng loạn dưỡng cơ Becker (tiếng Anh

viết tắt là BMD) được đặt theo tên của một bác sĩ người Đức Peter Emil Becker là

người đầu tiên mô tả biến thể của bệnh DMD này trong thập niên 1950.

Ở chứng loạn dưỡng cơ DMD, các em bé trai bát đầu cho thấy những dấu hiệu cơ

bị yếu ngay khi các em chỉ mới lên ba tuổi Bệnh làm yếu dần các cơ xương hay cơ

vân là những cơ ở tay, chân và thân người Ngay khi các em bước vào tuổi thiếu

niên hay có khi sớm hơn, các cơ tim và hệ hô hấp của các em bé trai có thể cũng

bị bệnh ảnh hưởng.

*Nguvẻn nhân gây ra hềnh loan dưõng CO' Duchene vả Becker :

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

Mãi cho đến thập niên 1980, người ta vẫn chưa biết đươc gì nhiều về nguyên nhân

gây ra bất kỳ dạng nào của chứng loạn dưỡng cơ Đến năm 1986, các nhà nghiên

cứu đã xác định được một gien mà khi bị biến dị - một tình trạng còn được gọi là

sự đột biến - sẽ gây ra chứng DMD Đến năm 1987, loại protein có trong giẽn này

đã được xác định và đặt tên là dystrophin.

Cảc gien có chứa những mà hay là công thức cúa chất protein là những thành

phân sinh học rất quan trọng tronc) tất cá mọi hình thức cúa sự sống Chứng loan dường cơ DMD xáy ra khimột gien đặc biệt nào đó trên nhiem sắc thê’ X không sản sinh ra được loai protein dystrophin Chứng BMDnhững đột biến khác nhau trong cùng một gien gây ra Những người bị chứng BMD cũng cỏ một ít dystrophnhưng không đú hoặc có dystrophin nhưng chất lượng kém, Việc còn có được một ít dystrophin giúp báo vệbắp thịt cúa nhừng người bị mắc chứng loan dưỡng cơ Becker không bị thoái hóa quá nặng hoặc quá nhanhnhư trường hợp cúa những người bị mẳc chứng Duchenne

Bó sơi cơ Toàn bô cơ

Màng sơi cơ (vị trí chất dystrophin)

Khi một trong những protein này, dystrophin, bị

thiêu,chứng loạn dưỡng cơ Duchenne sề xảy ra; khidystrophin bị khiếm khuyết hay không đủ,

chứng loan

Stop *

Out-of-frame dystrophin transcript missing exons 45-

" 1

Truncated dystrophin

ln-frame dystrophin transcript missing exons 44-

type dystrophi

BMD-BMD-like phenotype

Nature Reviews I Genetics

Hình 13 : cơ chế gây bệnh loạn dưõng Duchenne và Decker

5 ) Hội chửng X không bền :

Đây là bệnh di truyền chậm phát triểntâm thần hay gặp nhất ở người Capcaz,ngoài ra có cả ở người Nhật, Trung Quốc,

ấn Độ, châu Phi Bệnh di truyền liên kếtgiới tính, liên quan đến vùng không đượcphiên dịch 5' của exon 1 của gen FMR-1 (Fragile X Mentaĩ Retardation

1).

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

FMR1 (íragile X mental retardation 1) is the gene that contains thegenetic iníormation for how to synthesize FMRP (íragile X mentalretardation protein) Fragile X syndrome occurs when FMRP is missing.The FMR1 gene is located in the DNA on the X chromosome Thespeciíic location is given as Xq27.3.That means it is on the Xchromosome (X), it is on the long arm (q) and it is at the far end (27.3)

Genetic iníòrmatỉon in humans is stored in an odd way Buried withinthe iníbrmation that is actually used is lots of iníòrmation that is notused

Imagine that you went to the library and íound that in the chapter youwere interested in, many of the pages contained random letters Youphotocopied the entire chapter, including the pages that contained nouseíul information Before you left the library, you tossed all the pageswith random letters in a recycling bin and only took home the pages withwords you could read

In a similar way, our genes are interspersed with spacers calledintrons These introns may play an important role but do not containiníormation that will be used to make a protein

DNA

To make a protein, we Tirst make a copy of the DNA (mRNA) ThatmRNA will used as a pattern for assembling a protein When we copy theDNA into mRNA, we initially copy both these introns and theiníormation we are going to actually use (exons) The introns must be

Control Exon IntronExon Intron Exon

Kegion

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

edited out beíbre the mRNA's can actually be used to coordinate thesynthesis of proteins

Used to assemble 3 protein

The FMR1 gene itselí takes up 38,000 base pairs of DNA But asshown in the drawing below, most of the gene is made up of introns(indicated by the yellow color) Only a small part of the information in thegene (the black exons) will be used to make the FMRP The edited mRNAhas only 4000 of the original 38,000 bases

The location of the mutation that sets in motion íragile X syndrome

is near the beginning of the FMR1 gene In this location, there is normally

a series of about 30 repeats of CGG In individuals with the premutation,there are from 55-200 of these repeats Persons with the full mutation havemore than 200 of the CGG repeats

ị - - 1

most com mon with 30 In a premutation the number is GO to 200; the exampie has 96 In a tull

Hình 17-18: Co’ chế gây bệnh và hậu quả

Naturc Revlevvs I Neuroscienc*

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

ni

ì Môt số phương pháp phát hiẽncác biển di di

truyền ở mửc phân tử

1 Điên di protein (protein electrophoresis) :

_Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự khác biệt của chỉ một amino acidtrongphân tủ’ protein xảy ra do đột biến trên DNA sẽ có thế gây ra một sự

khác biệt nhẹ trong điện tích của protein

-Điện di protein đã được dùng đế phát hiện các biến dị amino acidtrên hàng trăm loại protein người Tuy nhiên các đột biến thay base nhưngkhông làm đổi nghĩa của codon và các đột biến làm thay đối amino acid

nhưng không làm thay đối điện tích của protein sẽ không thế phát hiện

được bằng phương pháp này Vì những lý do đó điện di protein chỉ cho

phép phát hiện chỉ khoảng một phần ba các đột biến xảy ra trên các codoncủa DNA Các đột biến xảy ra trên các đoạn DNA không mang mã cũng

2 Phát hiên đôt biến ỏ’ mức DNA :

1 Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giói hạn (Restriction

Fragment Length Polymorphism: RFLPs):

Nỗ lực đầu tiên trong việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức độDNA đựoc thực hiện thông qua vai trò của các enzyme của vi khuẩn đượcgọi là các enzyme giới hạn (restriction endonuclease/restriction enzyme) Cácenzyme này được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhằm mục đíchngăn chặn sự xâm nhập của các DNA lạ bằng cách cắt nhỏ những DNA này

▼ Các đoan nhó hon

Hình : cắt DNA bằng enzyme giói hạn EcoRI

Đe có thế quan sát được các đoạn DNA giới hạn có chiều dài khác nhaungười ta đã thực hiện kỹ thuật gồm các bước sau

(1) Xử lí bằng enzyme giới hạn (restriction digestion)Trước tiên DNA được chiết tách tù’ các mẫu mô, thường là tù’ máu Sau đó DNAđược cho tiếp xúc với một enzyme giới hạn như EcoRI Quá trình này sẽ tạo ratrên một triệu đoạn DNA với các chiều dài khác nhau

(2) Điện diNhững đoạn này được đem điện di ở trên gel theo một quy trình tương tự’như điện di protein tuy nhiên các đoạn DNA di chuyên trên geì phụ thuộc vàokích thước chứ không phụ thuộc vào điện tích Các đoạn DNA ngắn hơn sẽ dichuyên nhanh hơn trên gel

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

TTiAm k&n

rrvvvg

BỔ sung các probe

CA hOAil tỉnh phcrtg

T>òp XÚC vói

phim X

Đế Cố định vị trí của các đoạnDNA này người ta thấm chuyểnchúng tù' gel qua một màng rắnnhư nitrocellulose (Southerntransíer) Màng này bây giờ sẽchứa hàng ngàn đoạn DNA phân

bố theo trật tự tương tự như vịtrí của chúng ở trên gel và đượcgọi là màng thấm Southern(Southern Blot)

(5) Xác định đoạn DNA đặchiệu

Neu người ta nhìn tất cả cácđoạn này một lần trên màng lai

sẽ khó phân biệt chúng với nhau

do sổ lượng các đoạn DNA trên

đó quá lớn Vì vậy để có thểnhận định sự có mặt của cácđoạn DNA đặc hiệu người tadựa vào nguyên tắc bố sung

Một mẫu dò (probe) đặc hiệuđược tạo ra nhờ kỹ thuật DNA tái kết hợp (recombinant DNA) mang một đoạnmạch đơn DNA đặc hiệu có chiều dài khoảng vài ngàn bp và được đánh dấu

Quay trở lại với trường hợp bệnh hồng cầu hình liềm, ở người bình thườngtại vị trí thứ 6 của chuỗi polypeptide globin bêta trong cấu trúc của phân tủ' Hb

Pro Gtu Glu Pro Val Glu Pro Glu Glu

Hình 5: cẳt gene beta - lĩlobin bàng enzym giới hạn Mst II

Trong thực tế hiện nay đã có nhiều phương pháp hịêu quả hơn để đánh giáđột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn hữưích trong việc xác định nhiều loại biến dị và các đột biến gây bệnh khác Hiệnnay người ta đã biết được hàng ngàn cnzymc giói hạn, mồi cnzymc ghi nhậnmột đoạn DNA đặc hiệu Thêm vào đó hàng ngàn loại probe khác nhau đã đượctổng họp, mồi probe đại diện cho một đoạn ngắn DNA của người Bằng cách

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

kết hợp giữa các enzyme và các probe khác nhau, hàng ngàn vị trí đa hình đãđược phát hiện trên genome của người Sự đa hình này được sử dụng làm công

cụ trong việc định vị nhiều gene bệnh quan trọng như gene gây bệnh u xơ thầnkinh type I (neuro-íĩbromatosis type I), bệnh Huntington, bệnh xơ nang (cysticíìbrosis) v.v 2 Sự đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (Variable Number

of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR) Phương pháp xác định các RFLP chỉcho phép phát hiện các biến dị có mặt hoặc không có mặt ở một vị trí hạn chếtrên DNA Các biến dị này được gọi là sự đa hình của các vị trí giới hạn (restriction site polymorphism: RSPs) trong trường hợp này mỗi biến dị chỉ cóthể có 2 allele do đó cũng dẫn đến sự hạn chế khi khảo sát các biến dị di truyền

Sự đa dạng sẽ tăng lên nếu như biến dị có thế tạo ra nhiều allele hơn, nhữngbiến dị như vậy được thấy ở các DNA tiểu vệ tinh (minisatellites) Biến dị ditruyền ở đây được tính thông qua số lượng của các đoạn lặp trên một vùng nhấtđịnh Một vùng DNA tiếu vệ tinh có thế lặp 2, 3 lần hoặc lên đến trên 20 lầnlặp Sổ lượng này thay đổi rất lớn từ người này qua người khác tạo ra nhiều biến

dị di truyền trong quần thể vì vậy chúng được gọi là số lượng dao động của cácđoạn lặp nối tiếp (variable number of tandem repeats: VNTRs) Các VNTRđược phát hiện bằng kỹ thuật tương tự kỹ thuật dùng đế phát hiện các RFLP.DNA sẽ được xử lý bằng một loại enzyme giới hạn, các đoạn DNA sau đó đượcđiện di, tách xoắn và chuyến qua màng thấm Tuy nhiên trong khi sự đa hìnhcủa các vị trí giới hạn chỉ cho phép phát hiện các biến dị dựa vào sự có mặthoặc vắng mặt của các vị trí giói hạn (chỉ có 2 aĩlele) thì các VNTR cho phépphát hiện các biến dị thông qua sự khác nhau về số lượng của các đoạn lặp giữahai vị trí giới hạn (có thế có > 2 allele) (hình )