Cơ sở khoa học và ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh

CHỦ ĐỀ: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ ỨNG DỤNG  SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH Sơ lược về Chẩn đoán trước sinh • Khái niệm, mục đích, đối tượng, v v Các phương pháp tiêu biểu • FISH, QF-PCR, karyotype, DNA microarray Khái niệm Chẩn đoán tình trạng phôi thai trước khi trẻ được sinh ra Mục đích Phát hiện sớm các bệnh, tật di truyền của thai nhi Nhiệm vụ Đề ra những giải pháp xử trí kịp thời, tư vấn di truyền cho từng cá nhân, từng gia đình, hạn chế sự ra đời của nhứng đứa trẻ khuyết tật, góp phần thực hiện ưu sinh học cho nòi giống Sơ lược về Chẩn đoán trước sinh:  Cơ sở:  Mỗi con người hình thành đều nhận 50% vật chất di truyền từ bố và 50% vật chất di truyền từ mẹ Trong quá trình phát triền cá thể, con người luôn chịu tác động của các yếu tố môi trường bao gồm yếu tố ngoại cảnh và yếu tố cơ thể Một số yếu tố độc hại có thể gây các đột biết dẫn đến bệnh tật di truyền ở mức độ NST hoặc mức độ gen.   Các  đối  tượng  cần  chẩn  đoán  trước  sinh • Những bà mẹ mang thai trên 35 tuổi • Những bà mẹ từng sẩy thai nhiều lần • Những bà mẹ từng sinh con dị tật • Bố hoặc mẹ (hoặc cả 2) đã được xác định là người có rối loạn cấu trúc NST di truyền được • Kết quả siêu âm xác định có nguy cơ bất thường về hình thái • Kết quả sàng lọc bằng huyết thanh mẹ xác  định có nguy cơ cao sinh con dị tật Những phương pháp dùng để chẩn đoán trước sinh Siêu âm bào thai Sàng lọc máu mẹ Xét nghiệm di truyền không xâm lấn NIPT Chọc dò dịch ối Sinh thiết gai nhau thai Các xét nghiệm khác từ tế bào phôi thai SIÊU ÂM BÀO THAI Xác định được một số khuyết tật di truyền nhất là các trường hợp khuyết tật về hình thái như: một số tật của chi, sứt môi, hở hàm, vô não, thoát vị não, não úng thủy, tràn dịch não, thoát vị rốn, thoát vị cơ hoành, dị dạng thận, dị tật tim, đa ối, thiểu ối, thai chậm lớn BỆNH DOWN - Đối với bệnh Down, siêu âm kiểm tra thai giai đoạn 11-13 tuần, thường phát hiện được dấu hiệu dày khoảng sáng sau gáy Hygroma Kystique (dị dạng bạch mạch dạng nang) là triệu chứng khá đặc hiệu trong một số bất thường của bộ nhiễm sắc thể, và là một trong những bất thường thể hiện sớm trong ba tháng đầu của thai kỳ - Kết quả quan sát trên màn hình siêu âm là vùng da gáy dày, phồng lên từ vài mm đến hàng chục mm, da đầu dày, da bụng cũng có thể dày Trường hợp Hygroma Kystique lớn, thai nhi có tình trạng hết nước ối, việc chẩn đoán có thể bị bỏ qua hoặc nhầm lẫn - Nếu người mẹ bỏ qua thăm khám siêu âm thời kỳ 11-13 tuần, những thời điểm sau, có thể quan sát thấy da dày ở thai nhi, không có sống mũi, khoảng cách hai mắt xa nhau, dị tật tim, và chân tay (đa dị tật) Đặc biệt, đối với bệnh này, lưỡi của thai nhi to, dày nên miệng thai nhi luôn há.  Vị trí đo độ mờ da gáy phát hiện thai nhi có bất thường hay không Sàng lọc máu mẹ Tỷ lệ âm tính/dương tính giả 5% Double test Triple test Thời điểm thực hiện Mẹ bầu nên thực hiện khi thai nhi được 11 13 tuần 6 ngày tuổi ( tương ứng chiều dài đầu mông thai nhi từ 45 – 84mm), tốt nhất vào tuần thai thứ 12 Mẹ bầu nên thực hiện từ tuần thai thứ 15 đến tuần thai 22, chính xác nhất là vào tuần thứ 16 18 Khả năng phát hiện Hội chứng Down (thừa NST 21), hội chứng Trisomy 18 (thừa NST 18), hội chứng Trisomy 13 (thừa NST 13) Hội chứng Down (thừa NST 21), hội chứng Trisomy 18 (thừa NST 18), nguy cơ dị tật ống thần kinh Bộ chất xét nghiệm • PAPP-A (PAA): Một loại glycoprotein sản xuất từ nhau thai • β-hCG tự do (FBC): Một thành phần trong cấu trúc của hCG (human chorionic gonadotropin) • AFP (Alpha-fetoprotein): Một loại glycoprotein có nguồn gốc từ bào thai • uE3 (Unconjugated estriol): Xuất hiện vào ngày thứ 8 của thai nhi • β hCG (Beta human Chorionic Gonadotropin): Một loại steroid do nhau thai sản xuất Kết quả Double test • Kết quả xét nghiệm Double test kết luận thai nhi có nguy cơ cao hay thấp với hội chứng dị tật bẩm sinh • Xét nghiệm Double test nguy cơ thấp Một trong hai kết quả sau khi xét nghiệm được dự đoán đó là thai nhi có nguy cơ thấp (ít có nguy cơ mắc hội chứng Down) dựa trên kết quả đo độ mờ da gáy < 3mm, tỷ lệ bất thường ở khoảng 21,1% Nếu nguy cơ đã được hiệu chỉnh ≤ 1: 100 thì thai nhi được xem như có nguy cơ thấp (âm tính) • Xét nghiệm Double test nguy cơ cao Nếu dựa vào kết quả đo độ mờ da gáy của thai nhi ở khoảng 3,5 – 4,4mm, tỷ lệ bất thường ở khoảng 64,5% trở lên thì thai nhi được xếp vào nhóm nguy cơ cao với hội chứng dị tật bẩm sinh Nếu nguy cơ được hiệu chỉnh ở khoảng ≥1: 100 thì thai được xem như có nguy cơ cao (dương tính) Kết quả Triple test Kết quả xét nghiệm Triple test được đánh giá dựa vào hàm lượng cao hoặc thấp của AFP, hCG, Estriol: Hàm lượng AFP cao: Cho biết thai nhi có nguy cơ mắc khuyết tật ống thần kinh hoặc thiếu một phần não Hàm lượng AFP thấp: Cho biết những bất thường về lượng hCG và estriol cho biết khả năng bào thai có thể mắc phải hội chứng Down (3 nhiễm sắc thể thứ 21) hoặc hội chứng Edward (3 nhiễm sắc thể thứ 18) và các bất thường về di truyền khác Đánh giá:  Ưu điểm Nhược điểm - Phát hiện được đột biến mất đoạn nhỏ -Đầu dò huỳnh quang thiết kế phức tạp - Không đòi hỏi thời gian nuôi cấy nên thời gian trả kết quả nhanh  - Yêu cầu nhân công có trình độ cao Kỹ thuật karyotype Khái niệm: • Đây là kỹ thuật di truyền dựa trên NST  • Được phát hiện rất sớm khoảng đầu thế kỉ XX, xuất phát từ việc quan sát NST của tế bào thực vật • Được sử dụng trong hầu hết các phòng di truyền tế bào học  và được coi là một  trong những phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống • Là kỹ thuật phổ biến trong chẩn đoán  di truyền trước sinh, trong quá trình lập karyotype có thể xác định luôn được giới tính thai nhi Nguyên tắc •  Sử dụng tế bào trong dịch nước ối hoặc gai nhau thai  làm  tiêu  bản  quan  sát  bộ  NST  người  ở  kì  giữa     hoặc tiền kì giữa , chụp ảnh của một cụm NST để lập bộ nhiễm  sắc  thể  ( sử  dụng  hệ  thống  vi  tính  kết     nối với kính hiển vi) từ đó so sánh với karyotype chứng để phát hiện  các  bất thường  của  NST Phạm vi •  Phát hiện các bất thường về cấu trúc : đảo đoạn ,mất đoạn,lặp đoạn, chuyển  đoạn;  số  lượng  NST: lệch bội, đa bội, từ đó phát hiện ra các bệnh : hội chứng Down, trisomy 18, tríomy 13, và các bệnh liên quan đến NST X, Y •  Phát hiện các dạng khảm có trong mẫu phân tích Phương pháp •Nuôi cấy mô: với mục đích tạo nhiều  tế bào đang phân chia thì mới quan sát được bộ NST ở kì giữa-trạng thái mà NST được nhìn thấy rõ nhất •Sử dụng colcemid điều chỉnh quá trình  phân bảo ở kì giữa •Lấy 1 ít mẫu cho  lên tiêu bản •Phá vỡ tế bào  •Xử lý bằng enzyme trypsin để loại bớt protein histone trên NST •Nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa •Quan sát kính hiển vi độ phóng đại cỡ  1000x , chụp ảnh  Từ NST đồ của thai nhi so sánh với NST đồ giới tính để tìm ra sự bất thường NST Từ NST đồ của thai nhi đem so ság để tìm ra    những sai khác về số lượng, hình dạng  Hội chứng 3X                                                                        Bất thường NST số 15 Kỹ thuật karyotype trong chẩn đoán hội chứng Down trước sinh       Các bước lấy mẫu và làm tiêu bản tương tự như slide trên      Phân loại 1.Trisomy 21(chiếm khoảng 95%) Tất cả các tế bào đều có 3 NST số 21, xảy ra do sự phân chia bất thường của tế bào tinh trùng hoặc trứng 2 Chuyển đoạn NST (chiếm khoảng 3-5%) Do trong quá trình giảm phân hình thành giao tử 1 phần của NST 21 tách ra gắn với NST khác thường là NST 14 3 Dạng khảm( chiếm khoảng 1%)  Một số tế bào có 3 NST sô 21 ,1 số thì không  Xảy ra do sự phân chia của 1 tế bào bị lỗi ngay sau khi thụ tinh Kết quả là sau khi lập karyotype có 2 loại NST đồ: loại gồm 46NST, loại gồm 3 NST số 21 Cơ chế của thuố cnhuộm giemsa Trên NST có 2 loại vùng + Heterochromatin: giàu A,T , ít gen hoạt động nên nhuộm màu tốt, soi kính hiển vi thấy vùng tối + Euchromatin: giàu G,X , nhiều gen hoạt động, ít bắt màu hơn và là vùng sáng   •Các vùng sáng, tối được gọi là băng đượ c đánh số bắt đầu từ tâm động ra đầu m út    khi hiển thị trên máy tính •Nhờ vị trí các băng sáng ,tối người ta cơ  bản xác định được các bất thường về cấu  trúc như đảo đoạn, mất đoạn =>Nhược điểm: Mất thời gian nuôi cấy                              Độ phân giải cao nhất cho mỗi băng là 3-5Mb                              Bình thường độ phân giải là từ 350-850 băng, mỗi băng từ 5-10Mb Kỹ thuật DNA microarray • Là kỹ thuật của tương lai nhưng được tìm hiểu  và nghiên  cứu  khoảng  cuối  thế  kỷ  20 Ưu điểm: • Khả năng đánh giá trên toàn bộ 46NST trong 1 xét nghiệm  và  không  phải  nuôi  cấy  mô,  phát  hiện  mất   cân bằng NST gồm lệch bội, mất đoạn, nhân  đoạn  chính xác  hơn  karyotype •  Có thể sử dụng kỹ thuật này nếu thai nhi bất thường  nhưng karyotype  bình  thường Nguyên tắc •  Các đoạn cDNA tạo từ mRNA của mẫu bệnh,mẫu  chứng (không bệnh) ( gắn huỳnh quang) bắt cặp bổ   sung với các đoạn dò( được gắn trên phiến kính thủy tinh),  sau  khi  quá  trình  lai  phiến  kính  được  đọc   trên máy quét microarray ( microarray scanner) để đo lượng huỳnh quang đỏ, xanh trên  mỗi vị trí  của  phiến  kính  từ  đó  xác  định  được  tình  t rạng thừa, thiếu , cân bằng vật liệu di truyền Phương pháp a) Tách mRNA -Tách RNA ra khỏi mẫu, gồm mRNA, rRNA, tRNA, mRNA có đuôi poly A, sử dụng các hạt bi từ có gắn đuôi poly T bắt cặp bổ sung với đuôi poly A, mRNA được giữ bởi bi từ -Ly tâm để tách mRNA khỏi bi từ, lọc để tách bi từ  khỏi dịch b) Tạo cDNA từ mRNA -Thêm oligo dT primer, enzyme reverse transcriptase(RT), nucleotide đã nhuộm huỳnh quang -dT bắt cặp với đuôi poly A, các nu bổ sung với mRNA gắn với primer nhờ RT -Hình thành cDNA mẫu bệnh màu đỏ, mẫu chứng màu xanh c Microarray plate -Gồm nhiều giếng tương ứng với khoảng 20000 gen của người  + Mỗi giếng gồm sopts( feature) , mỗi spot chứa hàng triệu đoạn dò giống nhau -Một cDNA có thể bắt cặp với nhiều đoạn dò khác nhau trong 1 giếng dọc theo chiều dài của nó - Đoạn dò có thể là + DNA mạch đơn kích thước 75-150 Kb + Oligonucleotide kích thước 25-85 b d Lai Trộn cDNA của mẫu bệnh với mẫu chứng, đổ lên microarray plate để các cDNA bắt cặp với đoạn dò theo nguyên lý Chagaf Rửa đĩa để loại bỏ cDNA không bắt cặp Đĩa được đọc trên microarray scanner để đo lượng huỳnh quang xanh, đỏ trên mỗi điểm DNA Trên 1 giếng xuất hiện + màu vàng: cDNA mẫu bệnh biểu hiện bằng cDNA mẫu chứng + màu xanh:cDAN mẫu bệnh biểu hiện ít hơn + màu đỏ : cDNA mẫu bệnh biểu hiện nhiều hơn VD: nếu lặp đoạn 1 lần của mẫu bệnh thì trên 1 spot xuất hiện màu đỏ  Nhược điểm  +Không xác định được các đột biến điểm vì số cặp đột biến nhỏ hơn rất nhiều so với đoạn dò + Không xác định được các bất thường liên quan đến chuyển đoạn cân bằng , đảo đoạn do không có sự thiếu hay thừa vật chất di truyền Tư liệu tham khảo chính: • Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen – Khuất Hữu Thanh, 2006, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội • Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng – Khuất Hữu Thanh, 2006, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội • Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các bệnh lệch  bội nhiễm sắc thể thường gặp – Lê Thị Liễu, 2011 • Giáo trình Di truyền Y học - Bộ Y Tế - NXB Giáo dục Hà Nội  2008 ... nhứng đứa trẻ khuyết tật, góp phần thực ưu sinh học cho nịi giống Sơ lược Chẩn đốn trước sinh:   Cơ sở:   Mỗi người hình thành nhận 50% vật chất di truyền từ bố 50% vật chất di truyền từ mẹ Trong. .. dụng hầu hết phòng di truyền tế bào học ? ?và coi ? ?trong phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống • Là kỹ thuật phổ biến chẩn đoán  di truyền trước sinh, q trình lập karyotype xác định... hợp Các giai đoạn phản ứng PCR Điện di mao quản (Capillary Electropherosis) Nguyên tắc điện di: DNA đại phân tử sinh học mang điện tích âm, mơi trường có điện trường, phân tử DNA có kích thước